Name: In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: למדו לעקוב אחר פעילות קספאז לא אפופטוטית ב-Drosophila melanogaster באמצעות הביוסנסור CaspaseTracker. שיטה זו מאפשרת לחקור תפקידים תאיים בריאים ולזהות קספאזים פעילים בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Polan סנטוס דארן Obbard לאיורים תסיסנית באיור. 2a, מרסלו ג&#39;ייקובס-לורנה לשימוש של insectary JHMRI. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת קרן המחקר מדעי החיים (HLT), ועדת המענקים אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF), ו- NIH מעניקה NS096677, NS037402 ו NS083373 (JMH). הו לם טאנג הוא עמית קרן Shurl וקיי קורצ&#39;י של קרן המחקר למדעי החיים.

1. הכנת זבובים CaspaseTracker <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין CaspaseTracker (DQVD) זבובים לניסויים, לבצע הצלב הזה: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (כטב&quot;מ-RFP; כטב&quot;מ-FLP; Ubi&gt;&gt; עצירה GFP-NLS), על ידי העברת נקבה בתולה 7-10 (או זכר) זבובים נושאת את המצע biosensor caspase mCD8-DIAP1-Gal4 מונע על ידי האמרגן היוביקוויטין 35 יחד עם מספר זהה של גברים (או נשים) זבובים G-TRACE, אשר יש איזון כרומוזום ארגון הנוער הקתולי השנייה, כדי למנוע הקטלניות של שילוב הומוזיגוטים של G- TRACE (כטב&quot;מ-RFP, כטב&quot;מ-FLP, ו Ubi&gt;&gt; עצירה GFP-NLS) 34. מקום טס בקבוקון מזון טרי עם רסק שמרים טריים כמקור חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת קבצים על 18 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 7 ימים (מקסימום 2 שבועות) ולאחר מכן הסר את ההורה עף מהבקבוקון להימנע צפיפות עם צאצאים חדשים, וכדי להגדיר בקבוקוני רבייה חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגירה על 18 מעלות צלזיוס עד צאצאי זבובי eclose. בחר את ארגון הנוער הקתולי הלא [-ג ללאצאצאי urlY כנף] של גנוטיפ הנכונה של CaspaseTracker, שהן מהונדסות עבור אלמנטי CaspaseTracker ו- G-TRACE 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, ליצור שליטה הלא מהונדס הורית זבובי w118 ו caspase-רגישות (DQVA) זבובים במקביל לאמת RFP CaspaseTracker הספציפי GFP קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע genotyping PCR כדי לאשר קבצים עם CaspaseTracker באמצעות פריימרים: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, ייצור מוצר 3897 נ&quot;ב. עבור genotyping לוקוסים G-Trace, השתמש פריימרים הבאים GFP (474 ​​נ&quot;ב), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT גת C; עבור RFP (258 נ&quot;ב), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; ועבור Flpase (655 נ&quot;ב), 5&#39;- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA .ג גנוטיפ Gal4 ב וקטור pUWR (554 נ&quot;ב), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. רקמות הכנות, מכתים שם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור וניתוחי זבוב, למנוע רקמות גזורות יידבק טיפי פיפטה פלסטיק צינורות צנטריפוגה, טיפים מעיילים וצינורות עם אלבומין בסרום שור 1% (BSA) מומסים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח זבובים על כרית סיליקון באמצעות מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע נזק קצות מלקחיים על משטח קשה בעת ביצוע לנתיחה רקמות, לבצע דיסקציה על משטח סיליקון. להכנת לוחות לנתיחת סיליקון, להמס את סיליקון בערכה המסחרית בהתאם להוראות יצרן (רשימת חומרים). לאחר המסת סיליקון, להוסיף 3 עד 4 מ&quot;ל לצלחת בתרבית רקמה בקוטר 60 מ&quot;מ. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הסיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זבוב עם CO 2, ולהעביר אותו לצלחת סיליקון עם 1 מ&quot;ל של קר PBS. הצג את CO 2 בקבוקון המכיל את הזבוב באמצעות צינורית ירי, ולאחר מכן להעביר את t הזבוב הרדיםOA Pad כי יש אספקה 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להחזיק את הראש לטוס, וזוג נוסף של מלקחיים למשוך את החזה בכיוון ההפוך כדי לנתק את הראש לטוס מהגוף המכסה מבלי לפגוע בקשר בין הראש במעי הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 2 זוגות מלקחיים כדי להסיר את הכנפיים והרגליים מהחזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להחזיק את החזה, ועוד זוג מלקחיים למשוך את הבטן על מנת להפריד בינו לבין בית החזה שוב מבלי לפגוע בקשר בין במעי הקדמי ו midgut. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח האיברים הפנימיים כולל המוח, הבטן, tubules malpighian והשחלות כפי שהוכח בעבר. 39-41 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל החלקים של לציפורן וגופי השומן עם מלקחיים כמו רקמות אלה לייצר autofluorescence החזק. סבלנות ותרגול נדרשים להכין מערכת איבר שלם כפי שמוצג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר רקמות גזורות 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, ולתקן wi רקמותה 0.5 מ&quot;ל של paraformaldehyde 4% PBS (שנאגרו מלוחים פוספט) ב RT במשך 20 עד 30 דקות עם סיבוב בחושך כדי למנוע RFP הלבנת GFP ברקמות. הימנע קיבוע ממושך שיכול להתפשר תוצאות מכתימות שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את paraformaldehyde ידי pipetting עדין ולשטוף 3 פעמים עם 0.5 מ&quot;ל PBST (PBS + 0.1% Triton X-100) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize הרקמות עם 0.5 מ&quot;ל PBST על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רעד עדין. incubations שורטר עלול לגרום לתוצאות permeabilization ופשרת מכתים שלמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להפחית מכתים רקע, שקול דוגרים הרקמות 0.5 מ&quot;ל PBST עם 1% BSA, במקום PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את רקמות 3 פעמים עם 0.5 מ&quot;ל PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים גרעינים אקטין פילמנטיות (F- אקטין), להחיל 0.5 מ&quot;ל PBST עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Hoechst 33342 צבע כחול גרעיני 0.3 מיקרומטר אלקסה פלואוריד 633 Phalloidin F- אקטין כתם דגירה זמנית עם רקמות של 1 ש &#39;ב RT wהסיבוב העדין ה- i בחושך. הימנע מכתים ממושך כמו זה יגדיל את הרקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunostaining, דגירה קבועים permeabilized רקמות עם 0.1% Triton X-100 ב 0.5 מ&quot;ל PBS לילה ב 4 ° C, הכתם עם 1: 100 דילול של נוגדן anti-ELAV או עם 1: 200 דילול של caspase אנטי 3 לילה בשעה 4 ° C (300 μL). עקוב על ידי נוגדנים משני המתאים מדולל 1: 100 ו דגירה במשך 1 עד 3 שעות ב RT. ראה חומרי רשימה למידע נוגדן ספציפי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את רקמות 3 פעמים, כל 5 דקות ב 0.5 מ&quot;ל PBST עם סיבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipet, להסיר את כל PBST, ולאחר מכן להוסיף 200 μL אנטי-אקונומיקה סוכן הרכבה (ראה חומרים) כדי לכסות רקמות לחלוטין עבור 1-3 שעות ב RT, או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. רקמות אופטימליות אשר קלטו סוכן ההרכבה מלא תשקענה לתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לנקות את שקופית הזכוכית עם אתנול מים או 70% ולהעביר את הרקמות עם הרכבת סוכן אל גלאסשקופיות של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום להחליק כיסוי זכוכית מעל לרקמות. החל וזלין לשקופית הזכוכית ואת הכיסוי להחליק להימנע להרוס את הרקמה על ידי overcompression. הסר סוכן הרכבה נוסף בנייר טישו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את התלוש לכסות באמצעות החלת לק לאורך כל הקצוות של להחליק את המכסה כדי למנוע דליפה של הרכבת סוכנים מן הרקמות. </li></ol> 3. מיקרוסקופי Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ עלית קרינת confocal הפוך. עם זאת, עד-תקין מיקרוסקופים יכול לשמש גם. לרקמות התמונה באמצעות ריצוף, לשמור על טמפרטורת חדר יציבה כדי למנוע סחיפה של מיקוד משמרת של המטוס xy בשל התרחבות והתכווצות תרמית של רכיבים. מערכות בקרת הסביבה ומערכות פיצוי להיסחף מוקד לעזור להימנע מבעיה זו בשל אובדן שיווי משקל תרמי של מערכת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על הבמה של המיקרוסקופ. קח כמה תמונות בדיקה באמצעות ברזולוציה נמוכה (125 x 125 פיקסלים)d לקבוע את המספר המתאים של אריחי הדרוש כדי לכסות את האזור כולו של (ROI) ריבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת הסריקה במיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות עם רזולוציית סריקה כגון 500 x 500 פיקסלים. בחר את המטרה כגון 20X NA 0.8 או מטרה 63X NA 1.4 Plan-Apochromat לניתוח רקמות באמצעות coverslips זכוכית, כך שכל התמונות (אריחים) חופף ב -20% על כל הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התמונה ברצף מ ארוך ביותר עד קצרות אורכי גל עירור, כמו האור באורכי הגל ארוך יותר גורם צילום הלבנה נמוכה. רצף מ הארוך ביותר עד הקצר גל עירור הוא: (i) 633 ננומטר עבור Phalloidin F אקטין עבור נוגדנים caspases מופעל, (ii) 561 ננומטר עבור RFP, (iii) 488 ננומטר עבור GFP, וכן (iv) 405 ננומטר עבור גרעיני כתם Hoechst. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדמיה, לצמצם את החשיפה של תאים כדי עירור הלייזר פלורסנט במהלך ההדמיה תהליך להימנע צילום הלבנה על ידי הקטנת עוצמת הלייזר כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שאניהמגים נאספים, למזג את התמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מדגימים את פעולתו הבנייה הפנימית של CaspaseTracker המאפשר זיהוי של פעילות caspase בסיס נרחבת ברקמות בריאות. השלבים הקריטיים לאיתור פעילות caspase הלא אפופטוטיים in vivo הם: 1) יצירת זבובים עם transgene biosensor, 2) אימות פונקצית כתב ספציפי caspase עם בקרה נאותה, 3) תרגול טכניקות לנתיחה כדי לשמור על כל מערכות האיברים הפנימיות של תסיסנית המבוגרת, ו -4) פעילות biosensor מבדיל בין חפצי autofluorescent. <p class="jove_content" style=";text-align:right;dir...

Caspases הם פרוטאזות ציסטאין אשר מתווכים מוות של תאים אפופטוטיים ידי ביקוע חלבונים תאיים רבים אחרי שאריות aspartate מפתח. לדוגמה, caspases יוזם להפעיל caspases מפעיל, nucleases DNA derepress, רכיבים cytoskeletal תדבק ולשנות את הרכב השומנים של קרום התא לפרק תאי במהירות לעורר הכרה היבלעות על ידי תאים שכנים אשר לסלק את הגוויות התא. 1-4 ההערכה היא כי מיליארדי תאים מתים ליום בגוף האדם, אפופטוזיס הוא מנגנון חשוב של מוות של תאים סרטניים הנגרמת כימותרפיה. 5 סט של caspases שונה יכול לגרום מוות של תאים על ידי תהליכים שאינם אפופטוטיים ברורים כדי לעורר חסינות מולדת. 6 לפיכך, עיקר מחקר על caspases התמקד פונקציות פרו-מותם. מעניין לציין, כי עדויות ראשוניות בתחום גילו כי באותה caspases האחראי למותו תא קידום יש גם f שאינו מוותמשיחה. המחקרים החלוציים הוכיחו כי caspases מעורבים תפקודים תאיים מגוונים בתאים בריאים, ובכלל זה הסדרת תא התפשטות והגירה במהלך embryogenesis. 7-9 caspases נדרשים עבור אינדיבידואליזציה spermatid תסיסנית 10,11, עבור חסימת מסלול מוות של תאים necroptotic חלופי בעכברים 12,13, ו לעיבוד microRNA ב C. elegans. 14,15 בשנת אולי התאים-מי שמאריך ימים ביותר, נוירונים, caspases ומכונות אפופטוטיים אחרים מעורבים בוויסות הפעילות העצבית על ידי גיזום סופים הסינפטי, תהליך האמין להיות חיוני כדי לחזק סינפסות אחרות על למידה וזיכרון. 16 18 יתכן כי caspases להקל גיזום סינפטי על ידי סוג של מיני-אפופטוזיס של תחזיות עצביות זעירות ללא מות תא כולו. 19 עם זאת, caspases יכול להיות פונקציות חלופיות שאינן קשורות לאירועים כמו אפופטוזיס. 20,21 תפקיד כפולs בחיים ומוות אינם ייחודיים caspases; BCL-2 חלבונים המשפחה ציטוכרום C יש תפקידים אנרגטיקה הסלולר בתאים בריאים אבל הם גם חלק של מסלול אפופטוטיים הליבה כי הוא מופעל על ידי סוגים רבים של מתח התא. 22-25 אמנם לא הוכח, זה נראה הגיוני שהאבולוציה מקושר יום -משרות אל משרות מוות בתוך אותו למולקולות כדי להבטיח חיסול בזמן של תאים מתאימים או לא רצויים. נכון לעכשיו, את המנגנונים המולקולריים של פעילות caspase הלא אפופטוטיים אינם מובנים, ואת היקף פעילות caspase הלא אפופטוטיים במהלך התפתחות עוברית ברקמות למבוגרות גם אינו ידוע. אחד האתגרים הגדולים הוא הקושי להבחין-עבודות היום ממוות-עבודות של caspases. בניגוד אפופטוזיס pyroptosis, כאשר פעילות caspase מוגברת על ידי מפל פרוטאוליטים, היום-העבודות של caspases צפויות להתרחש בשעה נמוכה בהרבה רמות של פעילות אנזימטית, סביר מתחת זיהוי על ידי techn רב הזמיןologies. לפני העבודה המוצגת כאן, ואחרים פיתחו מגוון של חיישנים ביולוגיים caspase למטרות שונות. את biosensors SCAT (למשל, ECFP-DEVD-ונוס) במהירות לזהות פעילות caspase בזמן אמת בתאים בתרבית ורקמות החיה באמצעות סריג. 26,27 עם מחשוף caspase, מחצית GFP במיקוד הגרעין של Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) עובר relocalization subcellular בתוך דקות כאשר-לקשור קרום הפלזמה שלה הוא ביקע ידי caspases. 28 בדומה לכך, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes מן cytosol לגרעין על מחשוף caspase. 29,30 נוסף לאחרונה, chromophore ב iCasper תוכנן בחוכמה כדי לזרוח כאשר בקע ידי caspases, המתיר גילוי של פעילות biosensor בזמן אמת בנוירונים של עבר תסיסנית, אבל בעיקר בשיתוף עם מוות של תאים התפתחותי. 31 מות caspase-תלוי של נוירונים חוש הריח במהלך הזדקנות הייתה demonstעל פי דירוג של איתור חיסוני של הטופס בקע-caspase של חיישנים ביולוגיים CPV (למשל, mCD8-PARP-ונוס). 32,33 חשוב לציין, בצורה המופעלת של caspase-3 זוהתה בהעדר המוות של תאים על ידי immunostain הרגיש קוצים של נוירונים בתרבית, ובשנת סומה באמצעות הקרינה תלויה caspase של צבע כתב CellEvent הגרעיני, אך קשיים נתקלו בשל צילום רעיל, למרות מות תאים התעכב עד לאחר חיסול עמוד שדרה. 19 לפיכך, חיישנים הביולוגיים caspase חדשים יש צורך לזהות ולעקוב אחר תאים עם פעילות caspase הבזליים in vivo. כדי להתגבר על קשיים אלה, שעוררנו biosensor caspase צבע כפול רומן, מיועד CaspaseTracker. אסטרטגיה זו משלבת גרסה שונה של biosensor Apoliner caspase-רגיש תסיסנית 28 עם מערכת תסיסנית G-TRACE FRT recombinase 34 לתייג לצמיתות ולעקוב אחר תאים in vivo. &lt;sup&gt; 35 המערכת G-TRACE Gal4 המופעל מאפשר רמות נמוכות מאוד של caspases להפעיל CaspaseTracker, וכתוצאה מכך ביטוי RFP בציטופלסמה וביטוי GFP גרעינית במיקוד קבוע בכל תא שאי פעם חוותה פעילות caspase. 35 מערכת זו יכולה לתייג תאים לאורך כל החיים בחיות כולו באמצעות תסיסנית, מערכת מודל ממושמע בשימוש נרחב לחקר caspases תהליכי המוות התאי. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>חומרים מתכלים וריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>מוצרי וקטור</td><td>H-1000</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>טד פלה</td> <td>#505 (110 מ"מ, #5)</td> <td>פינצטה דומונט כיתה ביולוגיה, נירוסטה</td></tr><tr><td>תליית שקופיות טיפה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565B</td><td>שקופיות זכוכית</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>H1399</td><td>כתם DNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 בדיקות</td><td>מולקולריות</td> פלואידין <td>A22284</td><td>כתם אקטין</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 נוגדנים נגד Elav</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)</td><td>מזהה רישום נוגדנים:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>כתם עבור Drosophla pan-neuronal ELAV</td></tr><tr><td>קספאז-3 (Asp175) נוגדן שסוע</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>#9661</td><td>כתם לשבר פעיל של קספאז-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold מגיב אנטי-דהייה</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>לשימור פלואורופורים&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>לשימור פלואורופורים&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון SylGard 182</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>קוד מוצר: 0001023934</td><td>עבור לוחות</td></tr><tr> חיתוך<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>Carl Zeiss סטריאומיקרוסקופ Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila דיסקציה</td></tr><tr><td>AmScope סיבים אופטיים מיקרוסקופ כפול צוואר אווז, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>מקור אור</td></tr></tbody></table>

in vivo biosensor tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases הם המתווכים העיקריים של מוות תאי אפופטוטי באמצעות פעילותם הפרוטאוליטית. כאשר קספאזות מופעלות בתאים לרמות הניתנות לזיהוי על ידי טכנולוגיות זמינות, ההנחה היא שאפופטוזיס מתרחש זמן קצר לאחר מכן. קספזות יכולות לבקע רכיבים פונקציונליים ומבניים רבים ולגרום להרס מהיר ומוחלט של תאים תוך מספר דקות. עם זאת, עדויות מצטברות מצביעות על כך שבתאים בריאים נורמליים לאותם קספזות יש תפקידים אחרים, ככל הנראה ברמות אנזימטיות נמוכות יותר. מחקרים על פעילות קספאז שאינה אפופטוטית נפגעו על ידי קשיים באיתור רמות נמוכות של פעילות קספאז ובמעקב אחר גורל התא הסופי in vivo. כאן, אנו מדגימים את השימוש במדווח קספאז רגיש במיוחד, CaspaseTracker, שמתייג באופן קבוע תאים שחוו פעילות קספאז בבעלי חיים שלמים. חיישן ביולוגי CaspaseTracker בצבע כפול זה in vivo עבור Drosophila melanogaster מבטא באופן חולף חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) כדי להצביע על פעילות קספאז אחרונה או מתמשכת, ומבטא לצמיתות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בתאים שחוו פעילות קספאז בכל עת בעבר אך לא מתו. חשוב לציין, חיישן ביולוגי זה התלוי בקספאז חושף בקלות את נוכחותה של פעילות קספאז לא אפופטוטית ברקמות של מערכות איברים ברחבי הזבוב הבוגר. זה מודגם באמצעות נתיחות שלמות של זבובים בודדים כדי לזהות פעילות חיישנים ביולוגיים בתאים בריאים ברחבי המוח, המעיים, צינוריות מלפיגיות, קרדיה, צינורות השחלות ורקמות אחרות. CaspaseTracker מזהה פעילות קספאז לא אפופטוטית בתאים בעלי חיים ארוכים, שכן פעילות חיישנים ביולוגיים מזוהה בתאי עצב בוגרים וברקמות אחרות לפחות 10 ימים לאחר הפעלת הקספאז. חיישן ביולוגי זה משמש ככלי חשוב לחשיפת התפקידים והמנגנונים המולקולריים של פעילות קספאז לא אפופטוטית בבעלי חיים חיים.

ישנם שני מרכיבים מרכזיים המאפשרים CaspaseTracker כדי לזהות פעילות caspase בתאים הבריאים (איור 1 א). הראשון שבהם הוא חומצת אמינו 146 פוליפפטיד caspase-cleavable במתכונת (איור 1b) caspase biosensor Apoliner. 28 פוליפפטיד זה נגזר DIAP1 (דרוזופילה מעכב אפופטוזיס) המכיל אתר caspase יחיד טבעי כי הוא ביקע במהלך אפופטוזיס בדרך כלל DrICE ידי caspase. 42,43 DrICE שווה caspase-3 מצעים הסלולר היד...

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות ולעקוב אחר פעילות קספאז (caspase) שאינה אפופטוטית בבעלי חיים חיים, תוך שימוש ב-Drosophila Melanogaster כמודל. קספאזים הם פרוטאזים המבקיעים רכיבים תאיים רבים כדי לגרום למות תא אפופטוטית. לכן, נוכחות של קספאזים פעילים בתאים נחשבת לרוב כמשקפת מוות תאי קרב.עם זאת, עדויות גוברות מצביעות על כך שאותן קספאזים הגורמות למות תאים ממלאות גם תפקידים רגילים בתאים בריאים. תפקידים שגרתיים אלו של הקספאזים כוללים ויסות של פעילות נוירונלית, תפקודי מיטוכונדריה, ואף דיכוי של נתיבי מוות תאיים חלופיים. קיימים שני קשיים מרכזיים בחקר תפקידיהם השגרתיים של הקספאזים.ראשית, רמות בסיס רגילות של פעילות caspase הן בדרך כלל נמוכות מגבול הגילוי של הטכנולוגיות הזמינות. ושנית, גם כאשר פעילות basal caspase ניתנת לגילוי, קשה להבחין בינה לבין פעילות ה-caspase שתביא למות התא בעתיד הקרוב. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו מעקב caspase (caspase tracker): ביו-סנסור רגיש יותר ל-caspase שיכול לסמן באופן קבוע תאים ששרדו את הפעלת ה-caspase.ביו-חשש זה יאפשר לנו לזהות ולעקוב אחר תאים בעלי פעילות caspase שאינה אפופטוטית, ולחקור את תפקודיהם בבעלי חיים חיים. מערכת הביו-חשש למעקב אחר caspase in vivo בדרוזופילה מורכבת משני רכיבים: הגורם המשגשג של שמרים Gal4 שמופעל על ידי caspase, והדיווח הפלואורסצנטי המופעל על ידי Gal4 המכונה G-Trace.זבובים בעלי חיישן ביולוגי לקספאז (Caspase biosensor) מוכלאים עם זבובים מסוג G-Trace כדי להפיק זבובים מסוג CaspaseTracker, המדווחים על פעילות קספאז באמצעות פלואורסצנציה אדומה וירוקה. פעילות קספאז מזוהה בצאצאים כאשר החיישן הביולוגי נחתוך על ידי קספאזים פעילים ברצף DQVD, ובכך משתחרר Gal4 מממברנת הפלזמה. Gal4 המשתחרר עובר גרעין ומשרה ביטוי של חלבון פלואורסצנטי אדום, RFP, עד שהקספאזים הופכים לבלתי פעילים.עם זאת, Gal4 משרה גם את הביטוי של רקומינז FLP, מה שמוביל לביטוי רציף של GFP המכוון לגרעין לאורך כל חיי התא. ביו-סנסור של בקרה כולל מוטציה, DQVA, באתר השחור של הקספז. כדי להתחיל, בצעו הכלאה בין זבובים טרנסגניים הנושאים את הביו-סנסור Gal4 הרגיש לקספז לבין זבובים הנושאים את רפורטר הפלואורסצנציה G-Trace.שאיבו שבע עד 10 נקבות ביו-סנסור (biosensor) בתולות עם שבע עד 10 זכרי G-Trace שבקעו לאחרונה בבקבוק מזון טרי. בקרת שלילה חשובה היא הגרסה של ביו-סנסור זה שאינה רגישה לקספאז (caspase insensitive), הכוללת מוטציה נקודית אחת בשארית האספרטט הדרושה לשבביות של הקספאז. השתמשו באותו הליך הזיווג עבור זבובים אלו של הבקרה.לאחר ביצוע ההכלאות, שמרו את המבחנות בטמפרטורה של 18 degrees Celsius. כאשר הזחלים מתפתחים, ולפני בקיעת הדור הבא של הזבובים, העבירו את הזבובים ההורים למבחנות חדשות כדי להמשיך בייצור צאצאים. עם בקיעת הזבובים מהדור הבא, אספו את אלו בעלי כנפיים ישרות שאינן מקורסלות.פנוטיפ זה מעיד כי זבובים אלו נושאים טרנסגנים הן עבור החיישן הביולוגי של ה-caspase והן עבור הדיווח הפלואורסצנטי של ה-G-Trace. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקולים מוגדרים, בצעו דיסקציה לזבובים כדי לבודד רקמות רכות פנימיות שלמות הן מזבובים בעלי מעקב caspase והן מזבובים של ביקורת. ראשית, הכינו טיפי פפטה ומבחנות צנטריפוגה שאינן נדבקות לרקמות שבוצע להן דיסקציה.כדי לבצע זאת, יש לצפות את הקצות והמבחנות ב-1% bovine serum albumin המומס במים. כדי לקבע את הרקמות המבודדות, מלאו את המבחנות בעלות הדפנות השקופות והמצופות ב-0.5 mL של פאראפורמאלדהיד 4% טרי ב-PBS והעבירו את הרקמות המבודדות הטריות למבחנות אלו. לאחר מכן, הניחו את הרקמות בטמפרטורת החדר בחושך כדי למנוע דהייה פוטוכימית (photobleaching) והדגירו למשך 20 עד 30 דקות תוך סיבוב עדין כדי להשקיע את הרקמות במקבע תוך מניעת נזק לרקמות.קיבועים ממושכים עלולים להוביל לצביעה תת-אופטימלית של רקמות. כדי להסיר את הפאראפורמלהיד ולהתחיל את חדירות הממברנה (permeabilization) של הרקמות המקובעות, הסר בעדינות את תמיסת הפאראפורמלהיד באמצעות טיפ סינון מצופה ושטוף את הרקמות שלוש פעמים עם 0.5 mL של PBST. כדי להשלים את חדירות הרקמה, ולמנוע קישור לא ספציפי בהליכי הצביעה הבאים, דגור את הרקמות ב-0.5 mL של PBST המכיל 1% BSA בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה בחושך, תחת סיבוב עדין.ביום למחרת, הסירו את תמיסת ה-PBST BSA על ידי שטיפה של הרקמות שהועברו חדירות (permeabilized) שלוש פעמים עם 0.5 mL של PBST. כדי לסייע בוויזואליזציה של מבני רקמה שונים, בצעו צביעה משולבת של DNA גרעיני ו-F-actin ציטופלזמי על ידי דגירה של הרקמות שהוכנו ב-0.5 mL של PBST המכיל צבע גרעיני כחול Hoechst 33342 וצבע F-actin מסוג Alexa Fluor 633 phalloidin למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין. הסירו את עודפי הצבע על ידי שטיפה של הרקמות שלוש פעמים עם 0.3 mL של PBST.יש להדגיר כל שטיפה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב עדין. יש להסיר בזהירות את כל התמיסה מהרקמות שבמבחנה באמצעות טיפ פואט דק. כדי לשמר את האות הפלואורסצנטי במהלך ההדמיה, יש להוסיף 200 µL של חומר עיגון למניעת דהייה (anti-bleach mounting agent) כך שיכסה את הרקמות לחלוטין.דגרו את הרקמות למשך שעה עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר, או ב-4 °C למשך הלילה. באופן מיטבי, רקמות שספגו את חומר הקיבוע במלואן ישקעו לתחתית המבחנה. לפני קיבוע הרקמות, נקו את השקף זכוכית באמצעות מים או 70% ethanol.מרחו וסלין על השקופית ועל זכוכית המכסה כדי למנוע הרס של הרקמות כתוצאה מדחיסה יתר. לאחר מכן, העבירו את הרקמות עם חומר הקיבוע לשקופית. הסירו שאריות של חומר הקיבוע בעזרת נייר סופג.לבסוף, אטמו את זכוכית הכיסוי על ידי מריחת לק לאורך כל השוליים. להתחלה, הניחו את הפסנדה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. צלמו תמונות של התאים באמצעות עדשת Plan-Apochromat בפי 20x עם מפתח של point eight.צלם מספר תמונות ניסוי ברזולוציה נמוכה כדי לוודא שתוכנית ריצוף התמונות (tiling plan) תכסה את אזור העניין, שבמקרה זה הוא מערכת האיברים הפנימית המלאה של הזבוב. הגדר את סדר הצילום כך שיתחיל באורך גל העירור הארוך ביותר ויסתיים באורך גל העירור הקצר ביותר. פעולה זו תמזער את הפוטו-בליச்சிנג (photobleaching), שעוצמתו עולה באורכי גל קצרים יותר.לאחר מכן, צלמו תמונות ברזולוציה גבוהה המתאימה. על כל תמונה להיות עם חפיפה של 10% עם התמונה הבאה כדי להבטיח ריצוף (tiling) מוצלח. אספו בין שתי לשמונה סריקות דימות עבור כל אריח כדי להפחית את רעש הרקע.כדי להסיר את הצל בין אריחי התמונה הנובעת מניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, DIC, צלם תמונת ייחוס DIC של האזור הריק. לאחר מכן, בצע תיקון צל על תמונת האריח באמצעות תמונת הייחוס של ה-DIC. זוהי זבוב עם מעקב caspase שזה עתה בקע ונותח, עם חלקי פה, קיבה קדמית, זקיקית, קיבה תיכונה, קיבה אחורית, פי הטבעת, צינור הביצים והשחלאים.באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, פעילות קספאז (caspase) מודמיינת כפלואורסצנציית RFP המעידה על פעילות קספאז עדכנית, וכפלואורסצנציית GFP המעידה על פעילות קספאז בעבר. תמונות מוגדלות חושפות פעילות של חיישני RFP ו-GFP באונה האופטית, בלב (cardia), במעי האמצעי, במעי האחורי ובצינור הביצים. תאים ספציפיים לאורך הצינורות המלפיגייים מראים באופן בולט הן RFP והן GFP, מה שמעיד על פעילות קספאז מתמשכת.בניגוד לכך, לא ביטוי של פעילות ביו-סנסור RFP או GFP בתוך תאי הביצים (egg chambers), אם כי הביו-סנסור התבטא בתאי שריר בין תאי הביצים, על בסיס צביעה משותפת של F-actin. עם זאת, תאי הביצים מסוגלים להפעיל קספאזים (caspases) כאשר זבובים מטופלים בגירוי המוביל למוות תאי, כגון הרעבה או הלם קור, הגורמים להרס הגרעין ולהפעלה מאסיבית של קספאזים על בסיס צביעה אימונוהיסטוכימית. סביר שה-Caspase tracker מופיע בשלב מוקדם ומושמד לאחר מכן במהלך מוות התא.בתוך האונה האופטית של מוח זבוב בריא בעל מעקב קספאז (caspase tracker), נצפתה פעילות של הביוסנסור בתאים בריאים הנראים כנוירונים, בהתבסס על צביעה משלבת עם נוגדן anti-ELAVI, המשמש כסמן פאן-נוירונלי. דבר זה מרמז על תפקיד לפעילות קספאז שאינה אפופטוטית בנוירונים. ניתן להשתמש באסטרטגיות אחרות כדי להוכיח הישרדות ארוכת טווח של תאים בעלי פעילות קספאז, כגון כיבוי של ביטוי הביוסנסור באמצעות כלים גנטיים.לדוגמה, GalADTS המעכב את Gal4. מעקב הקספאז מדווח ספציפית על פעילות קספאז; כביו-סנסור בקרה שאינו ניתן לניתוק, DQVA אינו מופעל. האות היחיד בביקורות נובע מאוטופלורסצנציה של השאריות של העטיפה (cuticle) בחלקי הפה ובפי הטבעת, וממזון שנבלע, שמרים, בזקיק (crop) ובלב.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן השימוש בביו-סנסור למעקב אחר caspase כדי לעקוב אחר פעילות caspase שאינה אפופטוטית בזבובים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לכלול בקרות שליליות כדי להבחין בין אותות הביו-סנסור של caspase לבין autofluorescence. לדוגמה, הקוטיקולה וגופי השומן מייצרים autofluorescence חזק בזבובים, עם או בלי הביו-סנסור.הגרסה הנוכחית של הביוסנסור למעקב אחר קספאז תוכננה לזיהוי של קספאז DRICE פעיל. יישומים נוספים עשויים לכלול ביוסנסורים הספציפיים לקספאזים שונים, על ידי החלפת אתר הפיסוע המזוהה על ידי DRICE באתר הפיסוע המזוהה על ידי קספאזים אחרים.

in-vivo-biosensor-tracks-non-apoptotic-caspase-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים...

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

הפרעות גנטיות מסוימות או חשיפה לרעלים עלולות לשבש תהליכי התפתחות תקינים ולהוביל למוות של סוגי תאים ספציפיים. הניתוח של Caspase 3 המופעל על ידי אימונופלואורסצנציה שלמה בעוברי דג הזברה חושף לוקליזציה ספציפית לשלב ולרקמות של תאים העוברים אפופטוזיס באופן ספציפי.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

המונח אנסטאזיס מתייחס לתופעה שבה תאים גוססים הופכים תהליך התאבדות של תאים בשלב מאוחר, מתקנים את עצמם ובסופו של דבר שורדים. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לאיתור ומעקב אחר תאים שעוברים אנסטאזיס.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Anastasis הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לזהות ויוו כי התאים יש להפוך תהליך מוות של תאים יכולים להראות מורפולוגית תאים בריאים נורמלי. כאן נתאר פרוטוקולים עבור זיהוי ומעקב אחר תאים עוברים anastasis בבעלי חיים באמצעות פיתח ויוו CaspaseTracker ביוסנסור המערכת שלנו.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב תסיסנית עוברים

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי וטיהור של Drosophila caspases Dronc ו- Drice, והשימוש בהם במבחני מחשוף במבחנה .

במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

למדו לעקוב אחר פעילות קספאז לא אפופטוטית ב-Drosophila melanogaster באמצעות הביוסנסור CaspaseTracker. שיטה זו מאפשרת לחקור תפקידים תאיים בריאים ולזהות קספאזים פעילים בתאים חיים.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

גלה סרטונים נוספים