Name: לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: למד את ארגון הממברנות הפוטוסינתטיות ברקמות צמחים באמצעות קריו-SEM של שברי הקפאה. שיטה זו מאפשרת תיאור מורפולוגי מפורט של תילקואידים והתפלגות מרכיבי חלבון בממברנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אנדרס Kaech (אוניברסיטת ציריך) עבור עצות מועילות שלו על סריקת הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי המחקר החקלאי הדו-לאומית ארה&quot;ב-ישראל ופיתוח הקרן (מענק לא. ארה&quot;ב-4334-10, ZR), הקרן הלאומית למדע (מענק לא. 1034/12, ZR), והתכנית מדע האדם Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). המחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים נערכו בבית אירווינג צ&#39;רנה מוסקוביץ &#39;מרכז ננו וביו-ננו הדמיה במכון ויצמן למדע.

1. קריו קיבעון של רקמות ליף ידי הקפאה בלחץ גבוה הערה: סעיף זה מתאר כיצד לבצע הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלו לניסוי להקפיא שבר. משיקולים הקשורים דגימות צמח לראות 29. זה יכול להיות מותאם עבור סוגים אחרים של רקמות או דגימות עם שינוי כלשהו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפינה של סכין גילוח, לגרד את החלק התחתון של חלל 0.1 מ&quot;מ של טסיות אלומיניום 0.1 / 0.2 מ&quot;מ (איור 1). הכן לפחות תריסר טסיות (6 דגימות). קח זהירות לא ליצור סימני סכין על ההיקף של הדיסק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מגרד, לשטוף דיסקים באתנול מוחלטת, ולתת להם להתייבש ולשמור בצלחת נקייה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכונת ההקפאה בלחץ גבוה פי הוראות היצרן. ממלא את חדר האלכוהול של מכונת ההקפאה בלחץ גבוה עם isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן infiltratio תוצרת בית ואקום בסיועn המכשיר להחליף גז נמצא רקמת העלה עם נוזל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחוזקה להתחבר טיפ 200 פיפטה μl עד הסוף של מזרק 10 מ&quot;ל. חותכים ~ 1 ס&quot;מ של קצה. עושים חור במכסה של צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ל בחוזקה להתאים את קצה לחתוך. אבק יכול להיווצר בתוך הצינור על ידי משיכת הבוכנה של המזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה קטנה של עלים מצמח באמצעות סכין גילוח עם פינצטה מעמידים את עלה בתוך צינור microcentrifuge חצי מלא עם 1-hexadecene. לחדור את החללים בין תאית של העלה עם הנוזל על ידי משיכת הבוכנה בעדינות כדי ליצור ואקום, להחזיק למשך כ -30 שניות, ואז לאט לאט לשחרר את הבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פיסת עלה מהצינור באמצעות פינצטה. חתוך את עלה עם סכין גילוח במקרה זה הוא עבה יותר 0.2 מ&quot;מ וחותכים חתיכה קטנה שתתאים לתוך טסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טסיות נקי עם הצד השרוט לגמרי לתוך המחזיק של מכונת ההקפאה ולאחר מכן למקם את פיסת הקיצוץ של leaf לתוך טסיות. למלא את החלל שנותר סביב עלה עם 1-hexadecene. סיגרו את הכריך באמצעות טסיות אחר, עם השריטות מול העלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור והדק את הבעל ולהכניס אותו לתוך התא של המכונה. ואז ללחוץ על כפתור &quot;יט &#39;להקפיא (~ 2,100 ברים תמורת 300 - 500 אלפיות השניה), ובמהירות להעביר לבעל לתוך חנקן נוזלי. מוציאים בזהירות את הכריך קפוא מבעל באמצעות פינצטה מראש מקורר, נזהרת שלא שבר את הכריך. הערה: כריכים קפואים סגורים יכולים להיות הקפאה שברה מייד או לשמור חנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. השתמש בגדי משקפי מגן בעת ​​טיפול בחנקן נוזלי. </li></ol> 2. Freeze-שברים-שכבה כפולה ציפוי 27,28 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכונת שבר הקפאת לשימוש, כולל שני רובים לאידוי פלטינה / פחמן (Pt / C) ופחמן, על פי הוראות היצרן. מניחים את האקדח Pt / C ב 45 מעלותnd אקדח פחמן ב -90 מעלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -תוכנית קדם ערכת ציפוי של שכבה 2 ננומטר של Pt / C (שיעור ציפוי 0.02 - 0.04 ננומטר / sec) ושכבת 6 ננומטר של פחמן (ב ~ 0.1 ננומטר / sec). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את ההתקנה, במסך של מכונת הקפאה-שהבר. בחר מספר משתמשים שבו ערכת הציפוי תישמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר Pt / C עבור &#39;שכבה 1 &quot;. בחר מסגרת זמן, למשל., 5 דק &#39;(יעלה את הזמן הדרוש לצורך השלמת ציפוי). השתמש בחצים מעלה-מטה להגדיר בעובי של 2 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &#39;שכבה&#39; לעבור שכבה חזור על שלב 2. 2.1.1.2, למעט פחמן בחר ולהגדיר בעובי של 6 ננומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ולהתאים פעולת אקדח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;שכבה 1 &quot;. בחר את אקדח Pt / C על ידי לחיצה על הכפתור &quot;GUN1 &#39;ולחץ על כפתור ON בשלט האידוי של מכונת הקפאה-שהבר. לפקח על קצב האידוי לערוך אותו באמצעות ידיות מתח ופליטת until עמד על שיעור של 0.02 - 0.04 ננומטר / sec. &quot;OFF&quot; לחץ על כדי לכבות את האקדח Pt / C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;שכבה 2&#39;. חזור 2.1.2.1, למעט בחירה &#39;GUN2&#39; ולהתאים עבור שיעור האידוי של ~ 0.1 ננומטר / sec. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצנן את במת מערכת שבר הקפאת -140 C או C -160 (עלי hydrated או מיובשים, בהתאמה). צרף מעבורת העברת הוואקום קריו למכונית ולמלא הקאמרי שלה עם חנקן נוזלי. לחץ בתא ההקפאה-שבר מקורר הוא בדרך כלל בין 1 - 8 x 10 -7 mbar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעל דגימה שבירה הקפאה (מתאים טסיות 3 מ&quot;מ) לתוך תחנת הטעינה. להציף את תא טעינת התחנה עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שני כריכים קפואים על אחד בעל יד אחד באמצעות פינצטה כיתת דיוק גבוה. הדק את הכריך הראשון לתוך החזיק ואז להעיף את הבעל מעל לבדוק שזה מתאים בבטחה במקום. חזור על הכריך השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Detach המעבורת המקוררת ממכשיר שהבר הקפיא ולחבר אותו אל תחנת הטעינה. פתח את שסתום ההסעות, להציג את הזרוע בהתכנסות אל הבעל וכלא אותו למקומו. מחדש להציג את הזרוע עם הבעל לתוך המעבורת לסגור את שסתום ההסעות באמצעות כפתור תחנת טעינה. צרף המעבורת למכונית להקפיא שבר ולהציג בעל ההחדרה עם היד חוזר בה. לנתק את ההסעות מהמכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הסכין microtome שבר הקפאת לגובה כזה שהוא יוריד את טסיות העליון של כריכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סכין microtome, במהירות לשבור את הסנדוויצ&#39;ים, ומייד ולהעלות אותו על מנת למנוע זיהום של הדגימות ידי היצמדות פסולה אל הסכין, ולהפוך את התריס המקורר מעל למישור שנחשף מחדש כדי להגן על הדגימות מפני זיהום אפשרי על ידי מולקולות מים החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל דגימות עם פלטינה ופחמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן &#39;שכבה 1 &quot;על SCreen. הפעל את האקדח Pt / C על ידי לחיצה על כפתור &quot;GUN1 &#39;ואחריו כפתור ON. לבדיקת קצב האידוי ברגע שהוא מגיע 0.02 - 0.04 ננומטר / sec, בו זמנית לחשוף את הדגימות ולחצו על כפתור &quot;מדוד&quot; לפקח על עובי השכבה שהופקדה. הערה: האקדח יכבה באופן אוטומטי כאשר העובי הגיע הערך שנבחר מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הדגימות עם התריס כאשר אידוי Pt / C הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &#39;שכבה&#39; לעבור &#39;שכבה 2&#39;. חזור על שלבים 2.8.1 ו 2.8.2, למעט בחירת &#39;GUN2&#39; (עבור פחמן) ושיעור אידוי של ~ 0.1 ננומטר / sec. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לחמם את במת מערכת שבר הקפאת -120 C. </li></ol> 3. Cryo-מיקרוסקופ אלקטרוני סורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לעבודה קריו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שלב / שלב initialise מהתפריט confirm הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו כלים / Goto לוח, ולפתוח בלוח airlock &#39;על ידי בחירה מתוך הרשימה. לחץ על הכפתור &#39;הטור הסגור לשכת Valve &quot;. Vent תא מיקרוסקופ על ידי לחיצה על כפתור Vent תחת הלשונית &#39;אבק&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כלים / גוטו לוח, ולפתוח בלוח שלב נקודות רשימה &#39;. בחר את מיקום שער קריו לעבור לשלב לקואורדינטות הראויות לקבל את בעל המדגם. הערה: עמדת קריו-החליפין &#39;מוגדר מראש להיות בקנה אחד עם עמדת יחידת העברת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא הדגימה עם זוג נקי של כפפות והכנס את הבמה cryo על הבמה המרכזית של המיקרוסקופ. סגור את התא ולחץ על כפתור המשאבה בכרטיסייה &#39;האבק&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את מיקרוסקופ כדי -120 C. מלאו את המיקרוסקופ דיואר עם חנקן נוזלי. הפעל את פונקציית חום על יחידת הבקרה קריו-העברת -120 C פעם את הטמפרטורה של שלב יורדת מתחת -120 C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עו&quot;דACH מעבורת קריו-העברת המיקרוסקופ ולהעביר בעל המדגם באמצעות הזרוע בהתכנסות אל במת cryo מיקרוסקופ (כמו בשלב 2.5). לנתק את המעבורת מן מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &#39;טור להרחיב לשכת Valve&#39; בלוח מנעל האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזיז את בעל הדגימה קרוב העדשה האובייקטיבית (עבודה מרחוק 1 - 2 מ&quot;מ) באמצעות ג&#39;ויסטיק. בחר צמצם 10 מיקרומטר על הכרטיסייה &#39;הפתחים&#39;. לחץ לחיצה כפולה על שדה EHT בכרטיסייה &#39;אקדח&#39;. זן 10 (ק) עבור יעד EHT ולחץ על אישור. הקישו על הכרטיסייה EHT התחתונה ובחר &quot;EHT ביום &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;InLens&#39; מהרשימה הנפתחת גלאי בכרטיסייה &#39;גלאי&#39;. לייעל את תנאי הדמיה (פוקוס, בהירות והניגודיות, יישור קרן, אסטיגמציה) על פי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה &#39;סריקה&#39;. בחר סריקה מהירה ( &#39;מהירות סריקה = 1&#39;, המתאים להתעכב זמן של 100 NSEC לפיקסל) כדי למזער את הנזק הקורה, ואתא &#39;ברזולוצית חנות&#39; של 1,024 x 768 פיקסלים. בחר &quot;קו ממוצע &#39;ברשימה הנפתחת&#39; הפחתת רעש &#39;. התאם את הערך של N כדי 20 - 30 קווים לחיפוש. הזז את המדגם באמצעות הפונקציה &#39;Centre Point&#39; (על ידי לחיצה לשונית מלאה במקלדת) כדי לחפש אזורים עם תאי שבר כלורופלסטים (איורים 2 א ו -2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של כלורופלסטים שבר בהגדלות נמוכות (50 - 70 KX) (איור 2 ג ו 2D). השתמש בפונקצית &#39;תכונת המרכז&#39; (על ידי לחיצה מלאה-Shift-Tab במקלדת) כדי להתקרב אל פן שבר הכלורופלסט מעניינים לרכוש תמונות בהגדלה גבוהה (100 - 200 KX, איורים 3 ו -4). השתמש באותו הפרמטרים כמו בשלב 3.6 לרכישת תמונה, אבל לשנות את הערך הממוצע ליין N&gt; 100 עבור הפחתת רעש 30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Freeze לחץ על יחידת בקרת מיקרוסקופ הראשית או בלשונית &#39;הסריקה&#39; כדי לעצור את הסריקה ולשמוראת התמונה על ידי לחיצה על כפתור &quot;שמור TIFF &#39;. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 4. הערה: סעיף זה מתאר הליך קצר עבור פילוח של חלקיקי קרום מתמונות SEM-שבר הקפאה באמצעות חבילת הקוד פתוח 31 פיג&#39;י. ניתן להשיג תוצאות דומות עם תוכנת ניתוח תמונה אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה עם פיג&#39;י ידי גרירת קובץ התמונה לתוך חלון התוכנה הראשי. המר את התמונה לפורמט 8-bit על ידי בחירת תמונה / סוג / 8 סיביות. תמונה בחר / התאם / בהירות / ניגודיות ולהתאים לפי הצורך (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כלי הקו הישר, למתוח קו את גודל סרגל קנה מידת תמונה המוטבע. בחר לנתח / סט סולם. הזן את הפרטים בקנה המידה הנכונים (מרחק ידוע יחיד אורך) ולחץ על אישור. שמור תמונה מותאמת מותאם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך / מסננים בחרו / לטשטש גאוס (1.5 רדיוס ננומטר) ולוחצים על אישור (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה בחר / התאם / Auto מקומי סף (בשיטת Niblack) ולחץ על אישור (5C איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוך / הפוך ואז תהליך / בינארי / פרשת המים (5D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר גבול סביב האזור של (ROI) העניין עם כלי בחירת Freehand. מוסיפים את הבחירה למנהל ROI על ידי בחירת ערוך / בחירה / הוסף מנהל או על ידי לחיצה על &#39;T&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עריכה / נקה בחוץ (איור 5E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לנתח / מדידות גדר, לבחור את הפרמטרים המתאימים (למשל, אזור, אליפסה בכושר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לנתח / לנתח חלקיקים. זן טווח מתאים לגודל של חלקיקים ולסמן &#39;תוצאות תצוגה&#39;, &#39;הוסף מנהל&#39;, ואם יש צורך, &#39;אל תכלול בקצוות &quot;אפשרות ולחץ על אישור. התוצאה מוצגת באיור 5F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ צלם מדורגים הציל (שלב 4.2). בחר &quot;הצג הכל&quot;, ובטל את הסימון &#39;תוויות&#39; במנהל ההחזר על ההשקעה. סקור את partic שנבחרles הניח על התמונה המקורית והוסף ידני או סר של בחירות באמצעות &#39;הוסף&#39; או על &#39;מחק&#39; כפתורים של מנהל ROI. תקן כל בחירות צורך על ידי שימוש באפשרות בחירת Freehand ואת הכפתור &#39;עדכן&#39; של מנהל ROI (דמויות 5G ו 5H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים באמצעות המדידות שהתקבלו. בחלון התוצאות, לחץ על תוצאות / סכם להשיג, למשל, באזור הרע, רעת סרן וגרזנים מינור של החלקיקים המופיעים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ תוצאות / הפצה, בחר פרמטר (כגון פינה) ולחץ על אישור כדי להציג היסטוגרמה עבור פרמטר זה. </li></ol>

<ol><li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+consequences+of+grana+stacking+of+thylakoid+membranes+in+vascular+plants%3A+a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective.</a> Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).</li>
<li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+Faces+of+Frozen+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fracture Faces of Frozen Membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).</li>
<li>Branton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Etching+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze-Etching Nomenclature.</a> Science. 190 (4209), 54-56 (1975).</li>
<li>Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Differentiation+of+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes+-+Freeze-Etch+Electron+Microscopy+of+Wild-Type+and+Mutant+Strains+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas.</a> J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.6.+Location+of+the+P700-Chlorophyll+a-Protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1.</a> Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Particle+Movements+Associated+with+Unstacking+and+Restacking+of+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Invitro.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes.</a> Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).</li>
<li>Miller, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-I+-+Changes+in+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).</li>
<li>Miller, K. R., Cushman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-II+-+Thylakoid+Stacking+in+the+Absence+of+the+Photosystem-II+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle.</a> Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).</li>
<li>Miller, K. R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Thylakoid+Outer+Surface+-+Coupling+Factor+Is+Limited+to+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions.</a> J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.3.+Location+of+the+Light-Harvesting+Chlorophyll-Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Carlsberg+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein.</a> Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).</li>
<li>Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Identification+of+the+Exoplasmic+Face+Particles+on+the+Freeze-Fractured+Thylakoid+Membranes+-+a+Study+Using+Double+and+Triple+Mutants+from+Chlamydomonas-Reinhardtii+Lacking+Various+Photosystem-Ii+Subunits+and+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex.</a> Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).</li>
<li>Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex+.2.+Localization+of+the+Complex+in+the+Thylakoid+Membranes+from+Spinach+and+Chlamydomonas-Reinhardtii+by+Immunocytochemistry+and+Freeze-Fracture+Analysis+of+B6%2FF+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants.</a> Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).</li>
<li>Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Relationship+between+Light+Harvesting+Complex+and+Photosystem-1+and+Photosystem-2+in+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes.</a> J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+structure%3A+from+chlorophyll+granules+to+supra-molecular+architecture+of+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes.</a> Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).</li>
<li>Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+architecture+and+dynamics+of+the+photosynthetic+apparatus+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants.</a> Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).</li>
<li>Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+and+Organelles+of+Dehydrated+Selaginella+and+Tortula+Retain+Their+Normal+Configuration+and+Structural+Integrity+-+Freeze-Fracture+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence.</a> Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).</li>
<li>Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+use+of+intact+plant+tissues+in+freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), e51694(2014).</li>
<li>Kirchhoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-light-induced+formation+of+semicrystalline+photosystem+II+arrays+in+higher+plant+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts.</a> Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).</li>
<li>Johnson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotective+Energy+Dissipation+Involves+the+Reorganization+of+Photosystem+II+Light-Harvesting+Complexes+in+the+Grana+Membranes+of+Spinach+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts.</a> Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).</li>
<li>Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+photosystem+II+organization+in+grana+thylakoid+membranes%3A+evidence+for+a+structured+arrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement.</a> Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).</li>
<li>Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Light-harvesting+superstructures+of+green+plant+chloroplasts+lacking+photosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems.</a> Plant Cell Environ. , (2015).</li>
<li>Goral, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-harvesting+antenna+composition+controls+the+macrostructure+and+dynamics+of+thylakoid+membranes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis.</a> Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).</li>
<li>Charuvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection+Conferred+by+Changes+in+Photosynthetic+Protein+Levels+and+Organization+during+Dehydration+of+a+Homoiochlorophyllous+Resurrection+Plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant.</a> Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).</li>
<li>Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Mechanisms+of+Desiccation+Tolerance+in+Selected+Angiosperm+Resurrection+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants.</a> Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).</li>
<li>Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalther%2C+P+%22Biological+Low-Voltage+Scanning+Electron+Microscopy%22">Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy</a>. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).</li>
<li>Walther, P., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+field-emission+cryo-scanning+electron+microscopy--present+state+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications.</a> Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).</li>
<li>Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+high-resolution+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy.</a> J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).</li>
<li>Hess, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+methodology+for+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation methodology for plant cell biology.</a> Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).</li>
<li>Nevo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+Thylakoid+Membrane+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Photosynth%22%5BJournal%5D)">Architecture of Thylakoid Membrane Networks.</a> Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשר חקירה של ממברנות-שבר הקפאת בהקשר של השתמרו היטב רקמות הצמח קפוא בלחץ גבוה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים קריו-סריקה. היתרון העיקרי של שימוש נהלים אלה הוא כי הכנת מדגם היא פיזית גרידא; שום צעדי שימוש בחומרים כימיים או התייבשות נחוצים. לכן, זה מאפשר לימוד מבנים ביולוגיים בכל מדינה כמעט טבעית 26,32. היתרון של שימוש ברקמות עלה הוא כי ניתן לקבל מידע על הארגון הסלולר הכוללת, כמו גם ממברנות ספציפיים מחקר, כגון ממברנות תילקואיד, בתוך ההקשר הפיזיולוג...

פוטוסינתזה חמצנית, שמקורם כחוליות עתיקות, ירשה אצות וצמחים קרקע על ידי אירועי endosymbiotic שהובילו להתפתחות של אברון הכלורופלסט. בכל phototrophs חמצנית ימינו, הובלת האלקטרונים פוטוסינתטיים והדור בכוח פרוטון-מניע כוח צמצום מתבצעות בתוך שלפוחית ​​דמויי השק פחוס כינה &#39;תילקואיד&#39; ממברנות. ממברנות אלה לשכן את קומפלקסי חלבוני המבצעות תגובות מונחים-האור של פוטוסינתזה ולספק בינוני עבור תמרת אנרגיה. הממברנות תילקואיד של צמחים ובעלי (חלק) אצות הם מובחנים לשני תחומים מורפולוגיים ברורים: אזורים קרום appressed בחוזקה שנקרא &#39;Grana&#39; וממברנות unstacked בו מקשרים בין Grana, שנקרא &#39;lamellae stroma&#39; 1. להקפיא שבר שונים מחקרים של צמח וממברנות תילקואיד אצות נערכו, החל בשנות ה -1970 המוקדמות. כאשר שבר-הקפאה, ממברנותלפצל יחד Core 2 הידרופובי שלהם, יצירת פנים exoplasmic (EF) ופנים protoplasmic (PF), תלוי בתא הסלולר אשר לגבולות חצי קרום, כפי שטבע במקור על ידי Branton et al. יש ב -1975 3 צמחים תילקואיד אץ ארבעה פרצופים שברים שונים:. מקדמי פליטה, EFu, PFS ו Pfu, עם &#39;s&#39; ו &#39;U&#39; &#39;מוערם&#39; ו &#39;unstacked&#39; קרום אזורים מציינים, בהתאמה. מתחמי חלבון הממברנה, אשר אינם לפצל או שבורים, יש נטייה להישאר עם או E או P צד של הממברנה. התצפיות הראשוניות כי פניהם שבר השונים של תילקואיד מכילים חלקיקים בגדלים שונים וצפיפות 4, ואת חקירות רבות שלאחר מכן, הובילו לזיהוי קורלציה בין החלקיקים הנצפים ואת קומפלקסי חלבונים בממברנה מבצעות תגובות האור 5-13 (ראה גם ביקורות 14,15). freEze-שבר ניסויים של ממברנות תילקואיד בדרך כלל מבוצעים על הכנות של כלורופלסטים או ממברנות תילקואיד המבודדות (אך ראה 16,17), בסיכון של כל שינוי ב מבני ו / או ארגון מולקולרי אשר עלול להתרחש במהלך ההליך בבידוד. בעקבות שבר, העתקים מוכנים ידי אידוי של פלטינה / פחמן (Pt / C), ולאחר מכן על ידי שכבה עבה של פחמן (C), ולבסוף עיכול של החומר הביולוגי 18. רפליקות הם דמיינו ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM). הטכניקה להקפיא שבר-ההעתק המסורתית ממשיכה לשמש ככלי חשוב ללימוד הארגון המולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיים והתאמתנו שונים, למשל., אור, תנאי 19-23. במחקר האחרון שלנו של צמח תחיית homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, אנו בקשנו לבחון את השינויים שחלו o הארגון המולקולריממברנות תילקואיד f, כמו גם בארגון הסלולר הכוללת, במהלך התייבשות התייבשות. ייחודו של מיני תחייה homoiochlorophyllous הוא שהם מסוגלים לשרוד בתנאים של יובש ברקמות וגטטיבי שלהם (עלים), תוך שמירה על מנגנון הפוטוסינתזה שלהם. ברגע שמים זמינים, הצמחים האלה להתאושש ולהמשיך בפעילות פוטוסינתטיים בתוך שעות עד מספר ימים 25. לצורך המחקר, EM-סריקת קריו (SEM) הדמיה של דגימות עלים שבר הקפאה אוחדה עם בלחץ גבוה קופא-וקיבוע קריו מדגם. נהלים אלה לספק אמצעי לדמיין דגימות ביולוגיות קפוא hydrated בכל מדינה קרובה למצב הטבעי שלהם 26. יתרון עיקרי אחת הוא כי דגימות נבחנות ישירות לאחר שבר הקפאה וציפוי ללא מדרגות רצופות. זה רלוונטי במיוחד לחקירת צמחים תכולי מי ביחס שונה (RWC), כמדינת הידרציה שלהם נשמרת במהלך הכנה. אֵיךפעם, חיסרון קריטי אחד הוא כי דגימות קפואות-hydrated עלולים לסבול מנזק הקורה במהלך ההדמיה, במיוחד כאשר סרק בהגדלה גבוהה, נדרש עבור מדידה מדויקת של גודל של מתחמי פוטוסינתטיים. כדי להתגבר על זה, שיטה הנקראת &#39;ציפוי שכבה כפולה &quot;(DLC) 27,28 בשילוב עם תנאי הדמית קריו-SEM ספציפיים נוצלו. אלה באו לידי ביטוי דגימות כי הם פחות קורה רגיש ואפשרנו להבהרת מידע רב ערך על ארגון פוטוסינתטיים חלבון מולקולרי ומרכיבים תאיים אחרים של הצמח ותחייתו ג pumilum בהגדלה גבוהה באתרו.

<table><tbody><tr><td>אתנול abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-hexadecene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0.1/0.2 Platelets</td><td>Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland</td><td>241</td><td>טסיות הדם הן בקוטר 3 מ"מ ובעובי 0.5 מ"מ (סוג A) עם חללים בעומק 0.1/0.2 מ"מ (בקוטר 2 מ"מ). טסיות דם דומות ניתן להשיג מ- Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>פינצטה בדרגת דיוק גבוהה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72706-01</td><td>Dumont (שוויץ) פינצטה בסגנון Durostar #5; ניתן להחליף בפינצטה אחרת ברמת דיוק גבוהה.</td></tr><tr><td>מכונת הקפאה בלחץ גבוה</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>חלופות הקפאה בלחץ גבוה: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>מערכת הקפאה שבר</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>שלב טעינת הכנת קריו</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק דגימה לשבירה בהקפאה חד פעמית</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>מחזיק מהדק לנושאי דגימות בקוטר 3 מ"מ</td></tr><tr><td>מעבורת ואקום להעברת קריו</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SEM stage</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישת תמונה</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>Fiji/Image J, המכון הלאומי לבריאות</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף freeze-שבר ידי cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

קריו סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) של דגימות-שבר הקפאה מאפשר חקירה של מבנים ביולוגיים בתנאי יליד קרובים. כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד הארגון המולקולרי של פוטוסינתטיים (תילקואיד) ממברנות בתוך דגימות עלים. זו מושגת על ידי הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלה, להקפיא-שבירה, ציפוי שכבה כפולה ולבסוף הדמית קריו-SEM. השימוש בשיטה ציפוי שכבה כפולה מאפשר רכישת הגדלה גבוהה (&gt; 100,000X) תמונות עם נזק קרן מינימלי דגימות קפואות-hydrated כמו גם אפקטים טעינה מינימלית. שימוש בהליכים שתוארו חקרנו את השינויים בחלוקה מולקולרית של מתחמי photosystem וחלבון אנטנת אור-קציר המתרחשים במהלך ההתייבשות של pumilum Craterostigma צמח תחייתו, באתרו.

איור 1 מציג קריו-SEM תמונות של טסיות המכיל בלחץ גבוה קפוא, להקפיא-שבר Craterostigma pumilum עלה חתיכות. בדגימות מסוימות, אזורים גדולים של תאים שבר מתקבלים (איור 1 א). במקרים אחרים, פיסת העלה נשארת הדוקה לדיסק העליון והוא יחוסל יחד עם זה (איור 1B). עם זאת, גם במקרה השני, כמה רקמת העלה עשוי נשארים מחוברים חריצים הסכין על טסיות (איור 1B, ראשי חץ) וכן כמות נכבדה של נתונים עדיי...

כאן אנו מתארים הליך לחקר רקמות צמחים שבורות בהקפאה. דגימות עלים קפואות בלחץ גבוה שבורות בהקפאה ומצופות בשכבה כפולה, ומניבות דגימות קפואות-לחות שמורות היטב המצולמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהגדלות גבוהות עם נזק מינימלי לאלומה.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא לחקור את הארגון הסופרא-מולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק בקירור (cryo-scanning electron microscopy) של דגימות רקמת עלה שעברו שבירה בהקפאה (freeze-fracture). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון אפיון מורפולוגי של תאים ואברונים, פיזור של קומפלקסים חלבוניים המשובצים בממברנה, ואיתור מיקום של ביו-מינרלים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהשבירה בהקפאה מבוצעת על רקמות עלה, ובכך נחקר הארגון הסופרא-מולקולרי של ממברנת התילקוֹיד בתוך ההקשר התאי והאברוני הטבעי.בעוד ששיטה זו מודגמת כאן עבור דגימה ביולוגית, ניתן להחילה אותה גם על ג'לים, פולימרים ומערכות להולכת תרופות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בנהלים אלה צריכים להיות מודעים לכך שלא כל הדגימות יקפאו היטב או יישברו כראוי. כדי לבצע קריופיקסציה של רקמות עלים באמצעות הקפאה בלחץ גבוה, התחילו בשריטת תחתית החלל של 0.1 מילימטר בלוחית אלומיניום של 0.1 עד 0.2 מילימטר באמצעות פינת להב תער.הכינו לפחות תריסר טסיות עבור שישה דגימות. לאחר מכן השתמשו באתנול מוחלט לשטיפת הטסיות, ושמרו אותן בצלחת נקייה. לאחר הכנת מכונת ההקפאה בלחץ גבוה, מלאו את קופסת הדגימות בחנקן נוזלי.בעזרת להב תער, חתכו חתיכה קטנה של עלה מהצמח והשתמשו בפינצטה כדי להניח את הרקמה בתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה המלאה עד מחציתה ב-hexadecane. כדי להחדיר את החומר למרווחים הבין-תאיים של רקמת העלה, הכניסו את קצה מכשיר ההחדרה, שהוכן כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, אל החור במכסה של מבחנת המיקרוצנטריפוגה, ומשכו את הבוכנה כדי ליצור ואקום. לאחר כ-30 שניות, שחררו את הבוכנה.בשלב הבא, הוצאו את פיסת העלה מהמבחנה באמצעות פינצטה. השתמשו בלהב תער כדי לחתוך פיסה קטנה מספיק כדי שתתאים ללוחית. ובמידת הצורך, גזרו את העלה לעובי של פחות מ-0.2 millimeters.כדי למנוע קריסה של הרקמה, העלים עוברים חלחול של נוזל לפני הקפאה בלחץ גבוה. עובי הדגימה נשמר מתחת ל-200 microns כדי למקסם את הסיכוי להשגת דגימה מזכוכית (vitrified).לאחר מכן, הניחו את פיסת העלה הגזוזה בתוך הפלטה. השתמשו בהקסדקאן כדי למלא את השטח הנותר בפלטה, לפני השימוש בפלטה נוספת, כאשר השריטות פונות לעלה, כדי לסגור את ה"סנדוויץ'". סגרו והדקו את המחזיק.הקפיאו את הדגימה על ידי לחיצה על כפתור ה-jet. לאחר מכן, העבירו במהירות את התומך לתוך חנקן נוזלי. השתמשו בפינצטה מקוררת מראש כדי להוציא את ה"סנדוויץ'" מהתומך, תוך הקפדה שלא לשבור אותו.ישנם שני שלבים קריטיים בפרוצדורה: שבירה בהקפאה (freeze-fracture), שהיא תהליך אקראי והצלחתה ניתנת להערכה רק ב-cryo-SEM, וציפוי דו-שכבתי, הדרוש להשגת תמונות בהגדלה גבוהה עם נזק מינימלי מהקרן. בעת הכנת ותכנות מכונת השבירה בהקפאה בהתאם להוראות היצרן, מקמו את רובה הפלטינום-פחמן, או Pt/C gun, בזווית של 45 מעלות, ואת רובה הפחמן בזווית של 90 מעלות. קררו את במת מערכת השבירה בהקפאה למינוס 140 או מינוס 160 °C.לאחר מכן, חברו את מעביר הדגימות הקריוגני בוואקום למכונה ומלאו את תא המעביר בחנקן נוזלי. הכניסו מחזיק דגימות לשבירה בהקפאה (freeze-fracturing) לתחנת הטעינה, והציפו את תא תחנת הטעינה בחנקן נוזלי. לאחר מכן, בעזרת פינצטה בדיוק גבוה, טענו "סנדוויץ'" קפוא על המחזיק והדקו אותו במקומו.לאחר מכן הפכו את התפסן כדי לוודא שהסנדוויץ' מקובע במקומו, וחזרו על הפעולה עבור סנדוויץ' שני. נתקו את המעבר המקורר ממכונת ה-freeze-fracture וחברו אותו לתחנת הטעינה. לאחר מכן פתחו את שסתום המעבר, הכניסו את זרוע ההסגה אל התפסן, נעלו אותה במקומה, והחזירו את הזרוע יחד עם התפסן אל המעבר.לאחר חיבורו מחדש של המעמקים למכונת השבירה-הקפאה (freeze-fracture), הכניסו את התפס לתא באמצעות זרוע ההסגה. כעת, כווננו את גובה סכין המיקרוטום של השבירה-הקפאה כך שתסיר את הפלטות העליונות של ה"סנדוויצ'ים". בעזרת סכין המיקרוטום, שברו את ה"סנדוויצ'ים" במהירות.לאחר מכן, הרם מיד את הסכין כדי למנוע זיהום של הדגימות על ידי פסולת הדבקה לסכין. מקם את התריס המקורר מעל למישור שנחשף זה עתה כדי להגן על הדגימות מפני זיהום אפשרי על ידי מולקולות מים בתא. כעת, כדי לצפות את הדגימות בפלטינום, לחץ על Setup כדי להציג את Layer 1 על המסך.לאחר מכן, הפעילו את רובה ה-Pt/C על ידי לחיצה על כפתור GUN 1 ולאחר מכן על כפתור ON. בחנו את קצב האידוי, וברגע שהוא מגיע ל-0.02 עד 0.04 nanometers per second, לחצו על כפתור Measure כדי לנטר את עובי השכבה השקועה תוך כדי חשיפת הדגימות. כדי לצפות בפחמן, בחרו ב-GUN 2 ולאחר מכן לחצו על כפתור ON.כאשר קצב האידוי הוא כ-0.1 nanometers per second, לחצו על כפתור ה-Measure ובמקביל הסיטו את התריס כדי לחשוף את הדגימות. עם השלמת הציפוי, חממו את הבמה למינוס 120 °C. כדי להכין את מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק לעבודה בקריו, בחרו מהתפריט הראשי ב-Stage, ולאחר מכן ב-Stage Initialize, ואשרו.בלשונית Vacuum, לחצו על כפתור ה-Vent כדי לשחרר את הוואקום מתא המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחרו ב-Tools, ב-Goto Panel, ופתחו את פאנל רשימת נקודות הבמה (Stage Points List). בחרו במיקום CRYO EXCHANGE כדי להזיז את הבמה לקואורדינטות המתאימות לקבלת מחזיק הדגימה.בעודכם לובשים זוג כפפות נקיות, פתחו את תא הדגימה והכניסו את במת הקריוסטג' (cryostage) אל הבמה הראשית של המיקרוסקופ. סגרו את התא, ותחת לשונית Vacuum, לחצו על כפתור ה-Pump. לאחר מכן, קררו את המיקרוסקופ על ידי מילוי ה-duor של המיקרוסקופ בחנקן נוזלי.ברגע שטמפרטורת הבמה יורדת מתחת ל-120- מעלות צלזיוס, הפעילו את פונקציית החימום ביחידת ההעברה הקריוגנית כדי לחמם את הבמה ל-120- מעלות צלזיוס. כעת חברו את מעברון ההעברה הקריוגני למיקרוסקופ והעבירו את מחזיק הדגימה באמצעות הזרוע הננסגת אל הבמה הקריוגנית של המיקרוסקופ. בעזרת הג'ויסטיק, הזיזו בזהירות את מחזיק הדגימה קרוב לעדשת העדשה.בלשונית Apertures, בחרו במפתח של 10-micron. לאחר מכן, בלשונית Gun, לחצו פעמיים על שדה EHT Target, הזינו 10 kilovolts עבור יעד ה-EHT, ולחצו על OK. לאחר מכן, כדי להפעיל את מתח ההאצה, לחצו על לשונית ה-EHT התחתונה ובחרו ב-EHT On. בלשונית Detectors, בחרו ב-InLens מהרשימה הנפתחת. לאחר מכן לחצו על לשונית Scanning ובחרו במהירות סריקה השווה ל-1, שהיא סריקה מהירה למינימום נזק מהקרן, וברזולוציית שמירה של 1024 על 768 פיקסלים.בתפריט הנפתח של Noise Reduction, בחרו ב-Line Average, והתאימו את ערך ה-n ל-20 עד 30 שורות לצורך החיפוש. לאחר מכן, על ידי לחיצה על מקשי ה-Control וה-Tab במקלדת, השתמשו בפונקציית centerpoint כדי להזיז את הדגימה לאזורי העניין, ובמקביל הגדילו את התמונה כדי לזהות אזורים עם תאים שבורים. לאחר זיהוי אזורים עם תאים שבורים, סרקו את הדגימה תוך הגדלה כדי למצוא כלורופלסט שבור.לאחר מכן, שנו את ערך ה-n של ממוצע השורות לערך הגבוה מ-100, לצורך הפחתת רעשים. בלשונית Scanning, לחצו על Freeze כדי להפסיק את הסריקה. על ידי לחיצה על Control Shift Tab במקלדת, נעשה שימוש בפונקציית ה-center-feature כדי לבצע זום למשטחי שבירה מעניינים של כלורופלסטים; ותמונות בהגדלה גבוהה נרכשות תוך שימוש באותם פרמטרים כפי שבוצעו קודם לכן.לבסוף, לחצו על כפתור Save TIFF כדי לשמור את התמונה. בצעו את ניתוח התמונה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. איור זה מציג תמונת cryo-SEM של פלטה המכילה נתח עלה של *Craterostigma pumilum* שהוקפא בלחץ גבוה ועבר שבירה בהקפאה (freeze-fractured), עם אזור רחב של תאים שבורים.בדוגמה זו, חתיכת העלה חסרה; אך נותר חלק מרקמת העלה, צמוד לחריצי הסכין על הפלטה. לאחר מציאת שבר מוצלח, נרכשים תמונות של תאים בהגדלה נמוכה כדי לזהות אזורי עניין, כגון כלורופלסטים שבורים. תמונות של כלורופלסטים עם שבר בודד נרכשות כדי לזהות את פני השבר של ממברנת הליקואיד.בתמונה זו מוצגת תמונה בהגדלה גבוהה של ממברנות תילקואיד בעלי C.Pumilum. ניתן להבחין בארבעה פני שבירה שונים: פני השבירה האקסופלזמיים של ממברנות מוערמות ולא מוערמות, EFs ו-EFu בהתאמה, ופני השבירה הפרוטופלזמיים של ממברנות מוערמות ולא מוערמות, PFs ו-PFu בהתאמה.פוטוסיסטמה II, או PS2, ממוקמת הן באזורי קרומי הגרנה העמוסים של ה-EFs והן באזורי הקרומים הסטרומאלמלאריים של ה-EFu. במצב של הידרציה, צפיפות ה-PS2 ב-EFs גבוהה פי שלושה בקירוב מאשר ב-EFu, דבר המבדל בין שני הפנים. במהלך דהידרציה של C.Pumilum, צפיפות ה-PS2 ב-EFs פוחתת בהדרגה, עד שהיא מגיעה לכמחצית מצפיפותה בתנאי הידרציה.ראוי לציין כי עם התייבשות נוספת לרמה של 5% עד 10% של תכולת מים יחסית, קומפלקסי PS2 מארגנים את עצמם בשורות ובמערכים. פיתוח טכניקת השכבה המשחזרת של שבירה בהקפאה (freeze-fracture replica) סלל את הדרך לחקר הגודל של קומפלקסי חלבונים ממברנליים והסידור שלהם בתוך ממברנות ביולוגיות. השילוב של שבירה בהקפאה עם הקפאה בלחץ גבוה ב-cryo-SEM מאפשר לבחון סוגים שונים של דגימות במספר סדרי גודל, מרמת הרקמה והתא ועד לרמה המקרו-מולקולרית במצב קרוב למצבו הטבעי.בנוסף לטכניקה המוצגת כאן, ניתן ליישם ב-cryo-SEM גם שיטות כגון ספקטרוסקופיה של קרני X לפיזור אנרגיה, EDS; לדוגמה, עבור ביו-מינרלים בסיסיים.

studying-supramolecular-organization-photosynthetic-membranes-within

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להמחיש דחיסת אן ארעי של כחוליות. טיפוח סינכרונית, פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הקפאה מהירה ו גבוה מתח הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה משמשים. פרוטוקול עבור מתודולוגיות אלה מוצג, יישומים עתידיים ופיתוחים הנדונים.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

התבוננות בחלוקת המים בתוך העצה מספקת מידע משמעותי בנוגע לדינמיקה של זרימת מים בצמחי הודי. במחקר זה, אנו מדגימים את הגישה המעשית להתבונן הפצת מים עצה באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM, אשר מבטלת שינויים מעשיים במצב המים במהלך הכנת המדגם.

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

למד את ארגון הממברנות הפוטוסינתטיות ברקמות צמחים באמצעות קריו-SEM של שברי הקפאה. שיטה זו מאפשרת תיאור מורפולוגי מפורט של תילקואידים והתפלגות מרכיבי חלבון בממברנה.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים