לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לחקור את הארגון העל-מולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק-קריו של דגימות רקמת עלים שבורות בהקפאה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון אפיון מורפולוגי של תאים ואברונים, התפלגות קומפלקסים של חלבונים אינטגרליים ממברנה ולוקליזציה של ביו-מינרלים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששבר הקפאה מבוצע על רקמות העלים, וכך נחקרת אורגנציה על-מולקולרית של קרום תילקואיד בתוך האברון המקומי וההקשר התאי.

בעוד ששיטה זו מודגמת כאן עבור דגימה ביולוגית, ניתן ליישם אותה גם על ג'לים, פולימרים ומערכות אספקת תרופות. בדרך כלל, אנשים חדשים בהליכים אלה צריכים להיות מודעים לכך שלא כל הדגימות יהיו קפואות היטב או שבורות כראוי. כדי לבצע הקפאה של רקמות עלים על ידי הקפאה בלחץ גבוה, התחל בשימוש בפינת סכין גילוח כדי לשרוט את תחתית החלל של 0.1 מילימטר של טסיות אלומיניום בגודל 0.1 עד 0.2 מילימטר.

הכינו לפחות תריסר טסיות דם לשש דגימות. לאחר מכן השתמש באתנול מוחלט כדי לשטוף את טסיות הדם ולשמור אותן בכלי נקי. לאחר הכנת מכונת ההקפאה בלחץ גבוה, מלאו את קופסת הדגימות בחנקן נוזלי.

בעזרת סכין גילוח, חותכים חתיכת עלה קטנה מהצמח ומשתמשים בפינצטה כדי למקם את הרקמה בתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה מלא למחצה בהקסדקן אחד. כדי לחדור לחללים הבין-תאיים של רקמת העלה, הכנס את קצה מכשיר ההסתננות, שהוכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט לתוך החור במכסה של צינור המיקרו-צנטריפוגה, ומשוך את הבוכנה ליצירת ואקום. לאחר כ -30 שניות, שחרר את הבוכנה.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הסר את חתיכת העלה מהצינור. השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך חתיכה קטנה מספיק כדי להתאים לטסית דם. ובמידת הצורך, חתוך את העלה לעובי של פחות מ- 0.2 מילימטרים.

כדי למנוע קריסת רקמות, העלים חודרים בנוזל לפני הקפאה בלחץ גבוה. עובי הדגימה נשמר מתחת ל-200 מיקרון על מנת למקסם את הסיכוי לקבלת דגימה מזוגגת. הנח טסיות נקיות כשצד השריטה כלפי מעלה לתוך מחזיק מכונת ההקפאה.

ואז הניחו את חתיכת העלה החתוכה לתוך הטסיות. השתמש בהקסדקן אחד כדי למלא את החלל הנותר של הטסית לפני השימוש בטסית אחרת כשהשריטות פונות לעלה כדי לסגור את הכריך. סגור והדק את המחזיק.

הקפיאו את הדגימה על ידי לחיצה על כפתור הסילון. לאחר מכן, העבירו במהירות את המחזיק לחנקן נוזלי. השתמש בפינצטה מגניבת מראש כדי להסיר את הכריך מהמחזיק, הקפד לא לשבור אותו.

ישנם שני שלבים קריטיים בהליך:שבר הקפאה, שהוא תהליך אקראי וניתן להעריך את הצלחתו רק בציפוי קריו-SEM ושכבה כפולה, הנדרש להשגת תמונות בהגדלה גבוהה עם נזק מינימלי לאלומה. תוך כדי הכנה ותכנות של מכונת שבר ההקפאה בהתאם להוראות היצרן, הנח את אקדח הפחמן הפלטינה, או אקדח ה-Pt/C, ב-45 מעלות, ואת אקדח הפחמן ב-90 מעלות. יש לקרר את שלב מערכת ההקפאה למינוס 140 או מינוס 160 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן חבר את מעבורת העברת קריו הוואקום למכונה והשתמש בחנקן נוזלי כדי למלא את תא המעבורת. הכנס מחזיק דגימה ששובר בהקפאה לתחנת הטעינה, ועם חנקן נוזלי הציף את תא תחנת הטעינה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה בדרגת דיוק גבוהה, העמיסו כריך קפוא על המחזיק והדקו אותו למקומו.

לאחר מכן הפוך את המחזיק כדי לבדוק שהכריך מאובטח במקומו, וחזור על הפעולה לכריך שני. נתק את המעבורת המקוררת ממכונת שבר ההקפאה וחבר אותה לתחנת הטעינה. לאחר מכן פתח את שסתום המעבורת, הכנס את הזרוע הנסוגת לתוך המחזיק, נעל אותה במקומה והכנס מחדש את הזרוע עם המחזיק למעבורת.

לאחר חיבור מחדש של המעבורת למכונת שבר ההקפאה, הכנס את המחזיק לתא, באמצעות הזרוע הנסוגה. כעת יישר את סכין המיקרוטום בהקפאה לגובה כך שהיא תפיל את הטסיות העליונות של הכריכים. בעזרת סכין המיקרוטום שוברים במהירות את הכריכים.

ואז הרם מיד את הסכין כדי למנוע זיהום של הדגימות על ידי פסולת הנצמדת לסכין. מקם את התריס המקורר מעל המישור החדש שנחשף כדי להגן על הדגימות מפני זיהום אפשרי על ידי מולקולות מים בתא. לאחר מכן, כדי לצפות את הדגימות בפלטינה, לחץ על הגדרה כדי להציג את שכבה 1 על המסך.

לאחר מכן הפעל את אקדח ה-Pt/C על ידי לחיצה על כפתור GUN 1 ואחריו כפתור ON. בדוק את קצב האידוי, וברגע שהוא מגיע ל-0.02 עד 0.04 ננומטר לשנייה, לחץ על כפתור המדידה כדי לעקוב אחר עובי השכבה המופקדת תוך חשיפת הדגימות. כדי לצפות בפחמן, בחר GUN 2 ואחריו כפתור ON.

לאחר שקצב האידוי הוא כ-0.1 ננומטר לשנייה, לחץ על כפתור המדידה ובמקביל הזז את התריס כדי לחשוף את הדגימות. בסיום הציפוי, מחממים את הבמה למינוס 120 מעלות צלזיוס. כדי להכין את מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק לעבודת קריו, מהתפריט הראשי בחר שלב, אתחול שלב ואשר.

תחת הכרטיסייה ואקום, לחץ על כפתור האוורור כדי לאוורר את תא המיקרוסקופ. לאחר מכן בחר Tools, Goto Panel ופתח את החלונית Stage Points List. בחר את מיקום CRYO EXCHANGE כדי להעביר את הבמה לקואורדינטות המתאימות לקבלת בעל המדגם.

תוך כדי לבישת זוג כפפות נקיות, פתח את תא הדגימה והכנס את הקריוסטייג' לבמה הראשית של המיקרוסקופ. סגור את החדר, ותחת הכרטיסייה ואקום, לחץ על כפתור המשאבה. לאחר מכן, יש לקרר את המיקרוסקופ על ידי מילוי המיקרוסקופ בחנקן נוזלי.

לאחר שטמפרטורת הבמה יורדת מתחת למינוס 120 מעלות צלזיוס, הפעל את פונקציית החום ביחידת העברת הקריו כדי לחמם את הבמה למינוס 120 מעלות צלזיוס. כעת חבר את מעבורת העברת הקריו למיקרוסקופ והעביר את מחזיק הדגימה באמצעות הזרוע הנסוגת לשלב הקריו של המיקרוסקופ. בעזרת הג'ויסטיק, הזז בזהירות את מחזיק הדגימה קרוב לעדשת האובייקטיב.

בכרטיסייה צמצמים, בחר את הצמצם של 10 מיקרון. לאחר מכן, בכרטיסייה אקדח, לחץ פעמיים על שדה יעד EHT, הזן 10 קילו-וולט עבור יעד EHT ולחץ על אישור. לאחר מכן, כדי להפעיל מתח מואץ, לחץ על הכרטיסייה EHT התחתונה ובחר EHT On.In הכרטיסייה גלאים, בחר InLens מהרשימה הנפתחת. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה סריקה ובחר מהירות סריקה השווה לאחת, שהיא סריקה מהירה כדי למזער נזקי קרן, ורזולוציית חנות של 1024 על 768 פיקסלים.

ברשימה הנפתחת הפחתת רעש, בחר ממוצע שורה, והתאם את הערך של n עד 20 עד 30 שורות לחיפוש. לאחר מכן, על ידי לחיצה על מקשי Control ו-Tab במקלדת, השתמש בפונקציית נקודת המרכז כדי להעביר את הדגימה לאזורי עניין תוך הגדלה בו-זמנית כדי לזהות אזורים עם תאים שבורים. לאחר זיהוי אזורים עם תאים שבורים, סרוק את הדגימה תוך כדי הגדלה כדי למצוא כלורופלסט שבור.

לאחר מכן שנה את ערך ה- n הממוצע של הקו לגדול מ- 100, להפחתת רעש. בכרטיסייה סריקה, לחץ על הקפאה כדי לעצור את הסריקה. על ידי לחיצה על Control Shift Tab במקלדת, פונקציית התכונה המרכזית משמשת להתקרבות לפנים מעניינות של שבר כלורופלסט; ותמונות בהגדלה גבוהה מתקבלות באמצעות אותם פרמטרים כמו קודם.

לבסוף, לחץ על שמור TIFF כפתור כדי לשמור את התמונה. בצע ניתוח תמונה על פי פרוטוקול הטקסט. איור זה מציג תמונת cryo-SEM של טסית דם המכילה חתיכת עלה Craterostigma Pumilum קפוא בלחץ גבוה עם אזור גדול של תאים שבורים.

בדוגמה זו, חתיכת העלה חסרה; אבל נשארה רקמת עלים מסוימת, מחוברת לחריצי הסכין על טסיות הדם. לאחר שנמצא שבר מוצלח, נרכשות תמונות בהגדלה נמוכה של תאים כדי לזהות אזורים מעניינים, כגון כלורופלסטים שבורים. תמונות של כלורופלסטים עם שבירה אחת נרכשות כדי לזהות פנים של שבר בקרום תילקואיד.

מוצגת בדוגמה זו תמונה בהגדלה גבוהה של ממברנות תילקואיד בעלי C.Pumilum. ניתן להבחין בין ארבעת פני השבר השונים. פני השבר האקסופלזמי של ממברנות מוערמות ולא מוערמות, EFs ו-EFu בהתאמה, והפנים הפרוטופלזמיות של ממברנות מוערמות ולא מוערמות, PFs ו-PFu בהתאמה.

Photosystem II, או PS2, ממוקם הן באזורי קרום הגרנה המוערמים EFs והן באזורי הממברנה הסטרומלרית של EFu. כאשר הם לחות, צפיפות ה-PS2 גבוהה פי שלושה ב-EFs מאשר ב-EFu, מה שמבדיל בין שני הפנים. במהלך התייבשות של C.Pumilum, צפיפות ה-PS2 ב-EFs פוחתת בהדרגה, ומגיעה לכמחצית מצפיפותו בתנאי לחות.

יש לציין כי עם התייבשות נוספת לתכולת מים יחסית של 5 עד 10%, מתחמי PS2 מתארגנים בשורות ומערכים. פיתוח טכניקת העתק הקפאה-שבר סלל את הדרך לחקר גודלם של קומפלקסים של חלבוני ממברנה וסידורם בתוך ממברנות ביולוגיות. השילוב של שבר הקפאה עם הקפאה בלחץ גבוה ב-cryo-SEM מאפשר לחקור סוגים שונים של דגימות בכמה קני מידה, מרמת הרקמה והתאים ועד לרמה המקרו-מולקולרית במצב כמעט טבעי.

בנוסף לטכניקה המוצגת כאן, ניתן ליישם שיטות כגון ספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפזרות אנרגיה, EDS, גם ב-cryo-SEM; למשל, עבור ביו-מינרלים אלקליים.