הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח

הקריוספירה מאפשרת גישה לאורגניזמים שנשמרו והישרדו תחת תנאי סביבה של העבר. המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחשוף מגוון ביולוגי נסתר באמצעות איסוף והסרה מוצלחים של חומרים אקסוגניים מליבות קפואות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות היסטוריות בעלות ערך לגבי תקופות זמן נבחרות, וזאת על ידי זיהוי אורגניזמים שחולצו מקרח קרחוני ומפרמפרוסט.

איסוף ליבה סטרילית בשטח הוא מאתגר בהינתן ההסתברות הגבוהה להחדרת זיהומים. לכן, היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהסרת הזיהומים מתבצעת בסביבת מעבדה מבוקרת. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית, שכן את שלבי הגרידה ודה-קונטמינציה עשוי להיות קשה ללמוד.

מדובר במשימה שדורשת שתי אנשים, ולכן היא דורשת סבלנות רבה ועבודת צוות במיוחד. את הפרוצדורה ידגימו שני מדעני תמיכה מהמעבדה שלי, Karen Foley ו-Robert Jones. פרוטוקול זה דורש רמת ניקיון קפדנית.

השתמשו בתנור המוגדר ל-450 °C כדי לאפות את הפריטים הבאים למשך ארבע שעות: מדפי מתכת סטריליים נקיים מחומצות גרעין, כלי זכוכית, פינצטות מתכת וצמר זכוכית. השתמשו בעטיפת רדיד אלומיניום עבה כדי למנוע זיהום חוזר.

בשלב הבא, בצעו סטריליזציה באמצעות סינון של אתנול 85% ומים אולטרה-טהורים באמצעות מסננים של 0.22 מיקרון. נוזלים אלו חייבים להישמר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס או פחות, אחרת הם יסביקו את הדגימה, דבר המקל על זיהומה. אחסנו את האתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס.

יש לאחסן את המים בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, יש לעקר סרגל פלסטי באמצעות 70% ethanol, ולאחריו תמיסת דה-קונטמינציה ל-DNA ותמיסת דה-קונטמינציה ל-RNase. יש להסיר כל תמיסה מיד לאחר יישומה.

לאחר מכן, אחסנו את הסרגל בשקית Whirl-Pak סטרילית הנקיים מחומצות גרעין. לאחר מכן, הכינו את חלל החדר הקר על ידי קרצוף ראשוני של הקירות, הרצפות ושולחן עבודה ממתכת בתוכו עם 1% bleach. לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת החדר לכ- 11- מעלות צלזיוס.

לאחר ההכנה, יש ללבוש חליפות עבודה קלות, כפפות ניטריל ומסכות בעת השהייה בחדר הקירור, כדי להפחית כל סיכוי לזיהום של החדר או של הדגימות. פרוצדורה זו דורשת עבודה של שני אנשים במקביל. הדבר עשוי להיות מאתגר בהתחשב בהזדמנויות הרבות לזיהום חוזר.

כדי להבטיח הצלחה, אנו מפקחים זה על זה, מתקשרים ומחליפים כפפות בתדירות גבוהה. לאחר שהכל מוכן, העבירו את החומרים המעוקרים ואת הדגימות לחדר הקירור, וסדרו אותם על השולחן שנקי עם תמיסת הלבנה. זה כולל תרביות מוכנות של S.marcescens.

ראשית, מניחים את ליבת הפרמפרוסט (permafrost) על גבי גיליל מוכן של נייר אלומיניום. לאחר מכן, מחדירים בעדינות תרבית מהולה של S.marcescens לחלק החיצוני של הליבה באמצעות פקק ספוג סטרילי. לאחר מכן, מניחים את הליבה על מעמד מתכת סטרילי מעל מגש.

כעת, להב המיקרוטום מפלדת אל-חלד מנוקה באופן סטרילי עם 70% ethanol, תמיסה לדיקונטמינציה של DNA ותמיסה לדיקונטמינציה של RNase. לאחר מכן, חוקר A מנקה את כפפות הניטריל שלו באופן דומה. לאחר מכן, A מחזיק את הגליל בזווית של 45 מעלות מעל המגש.

B גורד בעדינות כחמישה מילימטרים מהחלק החיצוני של כל הגליל, כולל הקצוות, באמצעות הלהב הסטרילי, בעוד A מסובב את הגליל לאחר כל גירוד. במידת הצורך, יש לנקות מחדש את הלהב באמצעות שלושת התמיסות. לאחר מכן, B שופך במהירות ובזהירות 95% ethanol שעבר סינון סטרילי על הגליל, בעוד A מסובב את הגליל.

לאחר מכן, שוטפים במהירות את הגליל במים. כעת מחליפים את מתקן המתכת שמעל התבנית, ומניחים את הגליל על המתקן החדש. האחראי מנקה את כפפות הניטריל שלו ולאחר מכן מניח את הגליל על מתקן נקי מעל התבנית.

בינתיים, B מרסס את כל הגליל בתמיסת דה-קונטמינציה של DNA, ולאחר מכן שוטף במים שעברו סינון סטרילי. לאחר מכן, B מרסס את כל הגליל בתמיסת דה-קונטמינציה של RNase, ולאחר מכן שוטף שוב במים. לבסוף, הגליל מוצב בתוך שק Whirl-Pak סטרילי.

התחילו בהנחת מעמד מתכת מעל צלחת זכוכית בתוך מCב ביולוגי בעל זרימה למינרית. לאחר מכן, הניחו את הגליל על מעמד המתכת. אפשרו לשני עד חמישה מילימטרים מהשכבה החיצונית של הגליל להפשיר במשך כ-10 דקות.

במהלך זמן זה, סובב את הגליאן ב-90 מעלות מדי שתי דקות. לאחר ההפשרה, תחוס צמר זכוכית בעזרת פינצטה והשט את כל פני השטח של הגליאן כדי לאסוף חיידקים. לאחר מכן, זרע את שתי הצלחות באמצעות צמר הזכוכית.

בשלב הבא, מדדו את הממדים החיצוניים של הגלילין באמצעות הסרגל, אך הימנעו מ접געו בגלילין. כמו כן, זרעו שתי צלחות נוספות עם התרבית המקורית ששימשה קודם לכן להחדרה לחוץ הגלילין, כדי לוודא שהמועמדים לזריעה היו בני חיים. לאחר מכן, העבירו את הגלילין לשקית סטרילית גדולה ואחסנו אותו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

דגרו את הפלטות המוחדרות בטמפרטורה של 23 degrees Celsius למשך שבוע אחד, ולאחר מכן בחנו אותן לנוכחות של מושבות *S.marcescens* שהופכות לאדומות בטמפרטורה זו. למרות שפרוטוקול זה כולל סדרה של שלבים קריטיים, אחד החשובים שבהם הוא בדיקת הצמיחה של *Serratia Marcescens*. אם אין מושבות נראות של *S.marcescens*, המשיכו לשלב ההפשרה הבא.

אם מופיעות מושבות של S.marcescens, יש לגרד חמישה מילימטרים נוספים מהליבה ולחזור על הפרוצדורה. בדקו האם S.marcescens גדל מהתרבית המקורית שנחשפה לטמפרטורות הנמוכות של החדר הקר. הדגימות נאספו מקרח ופרמפרוסט ממנהרה באורך 110 מטרים הממוקמת ב-Fox, אלסקה.

המנהרה סיפקה גישה לסחרית ואלוביום עתירי קרח. הדגימות נאספו בשלוש חזרות. הפרוטוקולים המתוארים בוצעו במתקנים בניו המפשייר.

גן ה-16S rRNA רצף מדגימות של חיידקים שגודלו מגרעיני הדגימה. מיני Pseudomonas היו דומיננטיים, אך נכחו גם שייכים הקרובים ל-Planctomycetia. בנוסף, נקודת עניין מיוחדת הייתה היעדרם של מיני Serratia, מה שמעיד על כך שפרוטוקול הדה-קונטמינציה הסיר ביעילות DNA חיצוני.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי הדרך לביצוע דה-קונטמינציה מוצלחת של ליבות קרח ופרמפרוסט. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים את שלבי העיבוד בחדר הקירור תוך 30 עד 45 דקות, אם התהליך מבוצע כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, קריטי להיות מודעים לכל דבר ובכל מקום שאתם נוגעים בו.

במקרה של ספק, פשוט החליפו כפפות ועקרו שנית. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון amplicon sequencing ו-shotgun metagenomics כדי לענות על שאלות נוספות, למשל מה היה הרכב המינים באותה תקופה, או אילו תכונות תפקודיות היו דומיננטיות תחת אותם תנאים סביבתיים.