Name: במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למד כיצד לכמת microRNAs מחזוריים בנוזלי ביולוגיים באמצעות טכנולוגיית droplet digital PCR. שיטה זו מספקת רגישות גבוהה לזיהוי ביומרקרים לאבחון סרטן בשלב מוקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בתמיכה כספית של האגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC) כדי MF (MFAG 11,676) וכדי MN (לאונקולוגיה קלינית מולקולרית תכנית מיוחדת -. 5 לכל n mille 9980, 2010/15) ומהמשרד של הוראה האיטלקית, האוניברסיטה מחקר FIRB 2011 MN (פרויקט RBAPIIBYNP).

בידוד MicroRNA מ פלזמה או סרום הערה: פלזמה והכנה בסרום הוא צעד רלוונטי במחזור כימות מירנה. לא מקיים הליך מועדף עבור פלזמה והכנה בסרום. הדבר היחיד שחשוב לקחת בחשבון הוא כי כל הדגימות מאותו הניסוי חייבות להיות מעובד באמצעות העבודה בדיוק. התחל 200 μl בסרום או פלזמה. RNA סה&quot;כ יכול להיות מבודד סרום או פלזמה באמצעות ערכות זמינות מסחרי. 1. ניתוק פרוטוקול RNA (כולל מירנה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות סרום / פלזמה להפשיר על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מגיב תמוגה (למשל., QIAzol) 200 μl בסרום / פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי vortexing ומניחים את שפופרת המכילה את homogenate על הספסל ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של פתרון 4.16 ננומטר של cel-miR-39-3p מירנה הסינטטי ג elegans. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של כלורופורם. לנער את הצינור במרץ למשך 15 שניות. ה מקוםצינור דואר על הספסל ב RT במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C כדי להשיג הפרדת שלבים: השלב מהימי העליון מכיל RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השלב המימי לצינור חדש, כ -700 μl, למנוע העברה של כל חומר ביניים לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 100% אתנול ומערבבים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet למעלה 700 μl של המדגם לתוך עמוד ספין מיני דגש על צינור איסוף 2 מ&quot;ל. סגור את המכסה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב זה באמצעות המדגם הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl מאגר RWT לעמודת הספין המיני, לסגור את המכסה ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב XG 12,000 לשטוף את העמודה. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 500 μl הצפת רשתית לתוך טור הספין המיני. סגור את המכסה ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב -12,000 סל&quot;ד. מחק את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמודת הספין המינית במלוא מהירות למשך 2 דקות כדי לייבש את טור הספיןקרום מ אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את טור הספין המיני לצינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש ומי RNase ללא pipet 35 μl על הממברנה של הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 דקות ב XG 12,000 כדי elute רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את RNA ב -80 ° C. הערה: מאז ריכוז RNA לא ניתן לקבוע במדויק, משתמשים באמצעי אחסון קבוע כאמצעי עבור סכום קלט. </li></ol> 2. שעתוק לאחור MicroRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את השעתוק לאחור תערובת מגיבה (RT) מרכיבים: חיץ תגובת 5x, nuclease ללא מים. מערבבים בעדינות היפוך הצינורות ומניחים על קרח. מיד לפני השימוש, להסיר את תמהיל האנזים מהמקפיא ומניחים על קרח. ספין למטה כל חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת מגיב RT על הקרח כמתואר בטבלה 1. הכן לפחות לערבב 10% מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התגובה על ידי pipetting, ולאחר מכן ספין למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 60 דקות ב 42 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים להשבית reverse transcriptase במשך 5 דקות ב 95 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לצנן עד 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את cDNA ב -20 ° C. </li></ol> 3. cDNA דילול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את כמות תבנית cDNA דרושי תגובות ddPCR המתוכננות במים חינם nuclease. לדלל את התגובה cDNA בין 01:50 ו -1: 500 במים, תלוי שפע מירנה היעד. אחסן את cDNA מדולל ב -20 ° C. את cDNA בדילול הוכיח להיות יציב במשך 3 חודשים לפחות ב -20 ° C. </li></ol> דור אגל 4. PCR הערה: דור אגל צריך להתבצע ב -8 דגימות בכל פעם. משכפל טכני אינו נדרש, בשל השחזור הגבוה של טכנולוגיה זו 12,15 .א אין שליטת תבנית (NTC) מדגם צריך לרוץ בכל צלחת עבור כל תנאי ddPCR שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר לאזן את תערובת מאסטר (למשל., מיקס מאסטר EvaGreen), סט פריימר microRNA ו cDNA ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ה מיקס מאסטרoroughly על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. ספין למטה כל חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת ddPCR כמתואר בטבלה 2. כאשר התגובות ddPCR מרובים מבוצעות, להכין ddPCR לערבב-פתרון עובד. הכן לפחות 10% בתמהיל יעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההרכבה, ומערבבים היטב ומסובב תמהיל ddPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 12 μl של ddPCR לערבב לתוך צלחת 96-היטב PCR או צינורות PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של תבנית cDNA מדולל על צינור אחד / היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחסנית גנרטור אגל לתוך מחזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העביר 20 μl של כל דגימה מוכנה בארות המדגם (בשורה אמצעית) של מחסנית גנרטור אגל בזהירות תוך הימנעות בועות אוויר בתחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל באר נפט (בשורה התחתונה) עם 70 μl של שמן גנרטור רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוק אטם על בעל מחסנית ולהכניס לתוך הגנרטור רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה כדי להתחיל דור אגל על ​​פי יחסי הציבור של היצרןotocol. כאשר דור אגל סיים, לפתוח את המכסה, הסר את האטם הפנוי. הבארות העליונות של המחסנית להכיל את הטיפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet לאט חלקה 40 μl של התוכן שמונה הבארות העליונות (הטיפין) לתוך עמודה אחת של צלחת 96-היטב PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת PCR ברדיד מיד לאחר העברת טיפות כדי למנוע אידוי. השתמש חותמות צלחת רדיד לנקבה התואמות את המחטים בקורא רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכיבת תרמית (PCR) בתוך 30 דקות של איטום הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את פרוטוקול האופניים לפי טבלה 3. </li></ol> 5. קריאה אגל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח על הקורא רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת מן Cycler התרמית לקורא רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת ה- PCR 96-היטב המכיל את טיפות שלאחר PCR לתוך הבסיס של בעל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החלק העליון של בעל צלחת על צלחת PCR. קש הוא לשוניות השחרור היטבמטה כדי לאבטח את הצלחת ה- PCR במחזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה ממחשב המערכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הגדרה כדי להגדיר את הניסוי (כימותים מוחלטים) ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי להתחיל בקריאת רביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קריאת האגל הושלמה, לחץ על &quot;נתח&quot; כפתור כדי לפתוח ולנתח את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש העלילה משרעת 2D בתוכנת הניתוח כדי לבחור את הטיפין החיוביות (כלי הלאסו) (איור 1 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכרטיסיית האירועים כדי לבדוק את מספר טיפות חיוביות ומוחלטות. מספר כולל של 18,000 - 21,000 טיפות מושג בדרך כלל עם probeless ddPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפין החיוביות נבחרות, לייצא את ערכי ריכוז מירנה באמצעות אפשרות .csv היצוא מכרטיסיית הריכוז. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

miRNAs במחזור הנוכחים בדם בריכוזים נמוכים מאוד וכמות רנ&quot;א שיכול להיות מופקת דגימות פלזמת בדם היא נמוכה. מסיבה זו, הם קשה לכמת עם טכניקות אחרות כגון microarray וסדר RNA. יתר על כן, קיימת חוסר כללי של הסכם על נורמליזצית נתונים ואת הנוכחות של miRNAs &quot;ייחוס&quot; אנדוגני בדם. בהקשר זה, טכנולוגיה רגישה כמו אגל דיגיטלי PCR, מסוגל לספור את מספר העותקים מירנה לכל מ&quot;ל של סרום או פלזמה גם אם נמוך מאוד, הוא מאוד אטרקטיבי. אנחנו לזווג טכנולוגיה זו עם מערכת cDNA אוניברסלית הפוכו...

MicroRNAs (miRNAs) משתחררים למחזור הדם על ידי כל תאי האורגניזם, כתוצאה משחרור פעיל או תהליכים נמקיים ואפופטוטיים. miRNAs נטולי תאים זוהו בזרם הדם כמולקולות יציבות חופשיות או מקושרות לליפופרוטאינים או עטופות בתוך אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות 1-3. מאמינים שהם מתפקדים כמתקשרים תא לתא 4, וכמותם משתנה בנוכחות סרטן, הפרעות לב או מחלות אוטואימוניות 5-7. הכימות המדויק והניתן לשחזור שלהם הוא הבסיס להערכתם כסמנים ביולוגיים של מחלות. עם זאת, מכמה סיבות שכבר תוארו במקום אחר 8,9, כימות miRNA בסרום או בפלזמה, כמו גם בנוזלי גוף אחרים, יכול להיות מאתגר מאוד 10,11. לאחרונה פיתחנו שיטה לכימות מוחלט של miRNAs במחזור הדם, המבוססת על פריימרים LNA ספציפיים ל-miRNA וטכנולוגיית PCR דיגיטלית של טיפות צבע קושרות DNA (ddPCR) 12. מתודולוגיה זו יושמה לאימות סמנים ביולוגיים של סרטן השד miRNA 13,14. 
לאחר החלוקה של כל מולקולת miRNA מתועתקת הפוכה בתוך טיפה בגודל ננו-ליטר, ניתן לספור את מספר העותק של כל miRNA בכל דגימה, ובעצם לספור את מספר הטיפות הפלואורסצנטיות הירוקות, ולכן החיוביות. ברגע שמתרחשת תגובת PCR, מושגת ספירה חיובית, ללא צורך בקביעת עקומה סטנדרטית או התחשבות ביעילות PCR בחישוב כמות היעד, כפי שקורה עם RT-PCR כמותי (RT-QPCR). בנוסף, ddPCR הוכיח את עצמו כרגיש ומדויק יותר מ-RT-qPCR בכימות miRNA במחזור 15. במאמר זה אנו מציגים את הפרוטוקול המפורט של מתודולוגיה זו, דנים בשלבים הרלוונטיים ביותר ובפרט בהתחשב בדגימות קליניות בסרום ובפלזמה.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>עמודות עבור RNA כולל, כולל miRNA, מיצוי מסרום/פלזמה</td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> רצף <td>מותאם</td><td>אישית: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>ערכת סינתזת cDNA אוניברסלית II, ערכת 203301 Exiqon 8-64 rxns</td><td></td><td></td><td>לשעתוק הפוך של microRNA</td></tr><tr><td>סט פריימר MicroRNA LNA PCR&NBSP;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx ו-2100000-21xxxxx</td><td>פריימרים להגברת miRNA בתוך טיפות</td></tr><tr><td>מחולל טיפות QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>מכשיר המשמש לקריאת טיפות</td></tr><tr><td>קורא טיפות QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>מכשיר המשמש ליצירת טיפות</td></tr><tr><td>תוכנת QuantaSoft BioRad</td><td></td><td>186-3007</td><td>תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים</td></tr><tr><td>אוטם צלחת PX1 PCR</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>אוטם צלחות</td></tr><tr><td>DG8 מחסניות מחולל טיפות ואטמים</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>מחסניות המשמשות לערבוב דגימה ושמן ליצירת טיפות</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen supermix</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td><td>PCR supermix</td></tr><tr><td>QX200 טיפות מחולל שמן עבור EvaGreen צבע</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>שמן לייצור טיפות</td></tr></tbody></table>

במחזור כימות microrna שימוש dna מחייבת כימיה דיי pcr דיגיטלי אגל

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

במחזור (של תא-חינם) מיקרו-רנ&quot;א (miRNAs) משתחררים מתאי לתוך זרם הדם. סכום של מיקרו-רנ&quot;א ספציפי במחזור נקשר למצב המחלה ויש לו פוטנציאל לשמש סמן ביולוגי למחלה. שיטה רגישה ומדויקת עבור מחזורי כימות microRNA באמצעות כימיה מבוססת לצבוע צַחצוֹחִית טכנולוגית PCR דיגיטלית פותחה לאחרונה. באופן ספציפי, באמצעות נעול חומצות גרעין (LNA) מבוססות פריימרים ספציפי מירנה עם צבע DNA מחייבת פלואורסצנטי ירוק במערכת PCR דיגיטלית תואמת אגל אפשר להשיג כימות המוחלטת של miRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים כיצד לבצע בטכניקה זו כדי להעריך כמות מירנה נוזלים ביולוגיים, כגון פלזמה ו בסרום, הוא גם ריאלי אפקטיבי.

הסכום המוחלט של miRNAs ספציפי לכל מיליליטר של פלזמה או בסרום ניתן לקבוע באמצעות צבע DNA מחייבת ניאון ירוק אַגְלִיל הטכנולוגיה PCR דיגיטלי. איור 1 מציג את התהליך של סלקציה חיובית-טיפות, אשר קובע את הריכוז מירנה הסופי (עותקים / μl ) ב תגובת ההגברה מחושבת על ידי תוכנת הניתוח. הסכום של כל מירנה בדם שונה מאוד, להיות כמה מיני מירנה שופעים יותר מאחרים. באמצעות cDNA 01:50 מדולל התגובה ddPCR אפשר להשיג מספר מספיק של טיפות חיוביות ושליליות. ...

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת microRNAs במחזור ובנוזלים ביולוגיים, כגון פלסמה או סרום, באמצעות טכנולוגיית droplet digital PCR. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות בתחום הביומרקרים, על ידי זיהוי סממנים אבחנתיים ופרוגנוסטיים לסרטן.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הרגישות הגבוהה. ניתן להשתמש בה כדי לכמת גם microRNAs בעלי שכיחות נמוכה, ללא צורך בגן ייחוס אנדרוגיני. יישומי שיטה זו רחבים עד לרבדי אבחון לסרטן, מכיוון שיש לה פוטנציאל לזהות אנשים עם סרטן בשלב מוקדם.ניתן ליישם זאת גם על מחלות אחרות, כגון הפרעות נוירולוגיות או לבביות. באופן כללי, יש להקפיד על מניפולציית הטיפות לפני שלב המחזור התרמי כדי למנוע את פירוקן. לפיכך, הדגמה חזותית של יצירת הטיפות היא קריטית, שכן הטיפות עלולות להיהרס כתוצאה ממניפולציה רשלנית או משימוש מהיר מדי בפיפט.התחילו את הפרוצדורה על ידי בידוד microRNAs מפלסמה או סרום. לאחר מכן, בצעו שעתוק הפוך ודילול כפי שמתואר במסמך המצורף. הוציאו מהמקפיא את מערכת הפריימרים ל-microRNA של ה-EvaGreen master mix ואת ה-cDNA והניחו להם להפשיר בטמפרטורת החדר.לאחר הפשרה, הפכו את מבחנת תערובת המאסטר (master mix) מספר פעמים. לאחר מכן, סובבו (spin down) את כל הרכיבים. הכינו תמיסת עבודה של תערובת ddPCR (droplet digital PCR) בהתאם להוראות במסמך המצורף.הכינו כמות מספיקה לעד שמונה דגימות, כולל בקרת ללא תבנית (no-template control) לכל תנאי, בתוספת עודף של 10%. לאחר ההכנה, ערבבו היטב וסובבו (spin down) את תערובת ה-ddPCR. שימו לב שאין צורך בחזרות טכניות בשל רמת השחזור הגבוהה של טכנולוגיה זו. לאחר הסבב, חלקו 12 µL מתערובת ה-ddPCR לכל באר בלוח PCR בעל 96 בארות.הוסיפו שמונה µL של תבנית cDNA מדוללת לכל באער. לאחר מכן, הכניסו את מחסנית מחולל הטיפות למחזיק המחסניות. העבירו בזהירות 20 µL מכל דגימה שהוכנה לשורה האמצעית של מחסנית מחולל הטיפות.הימנעו מהחדרת בועות אוויר לתחתית הבאר. מלאו כל אחת מבארי השמן בשורה התחתונה ב-70 µL של שמן ליצירת טיפות. התקינו את האטם על תומך המחסנית.הכנס את המחסנית למחולל הטיפות וסגור את המכסה כדי להתחיל ביצירת הטיפות. עם סיום יצירת הטיפות, פתח את המכסה, הוצא את המחסנית ממחולל הטיפות והסר את האטם החד-פעמי. הבארות העליונות של המחסנית מכילות את הטיפות.העבירו באיטיות ובחלק 40 µL מכל אחת משמונה הבארות העליונות לעמודה אחת בלוח PCR בעל 96 בארות. אטמו מיד את הלוח בעזרת רדיד אלומיניום כדי למנוע התאיידות. בתוך 30 דקות מסגירת הלוח, התחילו את מעגל התגבוב התרמי (thermal cycling) בהתאם לפרוטוקול ה-PCR המתואר בטבלה 3 במסמך המצורף.הדליקו את קורא הטיפות (droplet reader). לאחר מכן, העבירו את הפלטה מהמעגל התרמי (thermal cycler) לקורא הטיפות. הניחו את פלטת ה-PCR בעלת 96 הבארים המכילה את טיפות הפוסט-PCR בבסיס מחזיק הפלטות של קורא הטיפות.הנח את החלק העליון של מחזיק הפלטה על פלטת ה-PCR. לחץ בחוזקה על שתי לשוניות השחרור כלפי מטה כדי לקבע את פלטת ה-PCR במחזיק. הפעל את תוכנת ה-QuantaLife מהמחשב של המערכת. לחץ על Setup ופתח את קובץ נתוני התבנית המכיל מידע על הדגימות, הגנים המטרה והבדיקות.מסרגל הניווט בצד שמאל, בחרו Run. ייפתח חלון Run Options. מתפריט Dye Set, בחרו EVA, ולחצו על OK כדי להתחיל את קריאת הטיפות.עם סיום ההרצה, השתמש בתרשים ה-2D Amplitude בתוכנת הניתוח כדי לבחור את הטיפות החיוביות. כדי לבחור את הטיפות החיוביות, השתמש בכלי הלסו (lasso tool) מסרגל הניווט בצד שמאל. לאחר מכן, לחץ על לשונית ה-Events כדי לבדוק את מספר הטיפות החיוביות ואת סך כל הטיפות.בבדיקת ddPCR ללא גששים מושגים בדרך כלל סך כולל של 18,000 טיפות. לאחר מכן, לחצו על לשונית ה-Concentration כדי להציג את ריכוז הדגימה הסופי. לבסוף, השתמשו באפשרות ה-Export.קובץ CSV לייצוא ערכי ריכוז ה-microRNA. ה-mRNA miR-181a-5p כומת בשתי דגימות פלזמה, S1 ו-S2, תוך שימוש בריכוזי פריימר של 0.5 ו-1 µL בטמפרטורות התא붙ה (annealing) של 58 ו-60 °C. איור זה מציג את מספר העותקים של microRNA ל-µL בתגובת ההגברה עבור כל תנאי.טיפות PCR חיוביות עבור כל דגימה מוצגות בכחול, וטיפות שליליות מוצגות בשחור. כפי שניתן לראות כאן, לדגימת הביקורת אין טיפות חיוביות, כצפוי. ביצוע ה-PCR בטמפרטורה של 60 °C תוך שימוש ב-0.5 או ב-1 µL של פריימר הוביל להפרדה טובה יותר בין טיפות חיוביות לשליליות.באיור זה, פסי השגיאה מייצגים את רווח הסמיכות של 95% לפי התפלגות פואסון. וכאן, מספר הטפטפות החיוביות המוצגות בכחול, מושווה למספר הטפטפות הכולל, המוצג בירוק. יחד, נתונים אלו מוכיחים שניתן להשתמש ב-droplet digital PCR כדי לקבוע את המספר המוחלט של עותקי microRNA ל-µL של נוזל ביולוגי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ביצוע כימות mRNA באמצעות droplet digital PCR. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לנתח 96 דגימות תוך שעות ספורות בלבד, דבר המהווה תפוקה אופטימלית עבור סביבה קלינית. עם כל התפתחות, טכניקה זו סוללת את הדרך לתחום הביופסיה נוזלית (liquid biopsy) לצורך חקר microRNA וחומצות גרעיניות אחרות כסמנים ביולוגיים למחלות.

circulating-microrna-quantification-using-dna-binding-dye-chemistry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

בסרטון זה, אנו מציגים הליך שלב אחר שלב ליצירת ננו-טיפות מתחלבות לזיהוי חומצות גרעין מטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית או dPCR.

תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית: שיטה ליצירת תגובות PCR ננו-טיפתיות לאיתור מוטציות סרטניות נדירות

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ה-PCR הדיגיטלי הדו-צדדי (ddPCR) – שינוי של טכניקת ה-PCR המסורתית השימושית בזיהוי שני סמנים גנטיים שונים בו זמנית. תגובת PCR יחידה מחולקת לטיפות מתחלבות בגודל ננוליטר המועצמות באופן עצמאי, וזיהוי אותות הגברה פלואורסצנטיים בצבעים שונים מחלק הטיפות משמש לחישוב הריכוז ההתחלתי של רצפי המטרה.

PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

מחזורי מיקרו Rna הראו הבטחה כמו סמנים ביולוגיים עבור infarctions אוטם אקוטי ומחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול miRNA החילוץ, שעתוק במהופך של PCR דיגיטלי עבור כימות מוחלטת של miRNAs בנסיוב של חולים עם מחלות לב וכלי דם.

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

פרוטוקול זה מתאר את השיטה המפורטת של טיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) לכימות מדויק של רמות RNA מעגלי (circRNA) בתאים באמצעות פריימרים מסתעפים.

כימות רנ"א מעגלי באמצעות טיפות דיגיטליות PCR

למד כיצד לכמת microRNAs מחזוריים בנוזלי ביולוגיים באמצעות טכנולוגיית droplet digital PCR. שיטה זו מספקת רגישות גבוהה לזיהוי ביומרקרים לאבחון סרטן בשלב מוקדם.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

גלה סרטונים נוספים