במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת מיקרו-רנ"א במחזור ונוזלים ביולוגיים, כגון פלזמה או סרום, באמצעות טכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפתית. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הביומרקט. על ידי זיהוי סרטן אבחנתי ופרוגנוסטי, ביו-שיווקי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ברגישות הגבוהה. ניתן להשתמש בו כדי לכמת גם את המיקרו-רנ"א הפחות נפוצים מבלי לדרוש גן ייחוס אנדרוגיני. ההשלכות של שיטה זו משתרעות על אבחון סרטן מכיוון שיש לה פוטנציאל לזהות אנשים עם סרטן בשלב מוקדם.

ניתן ליישם אותו גם על מחלות אחרות כמו הפרעות נוירולוגיות או לבביות. בדרך כלל, אנשים צריכים לשים לב למניפולציה של טיפות לפני שלב הרכיבה התרמית כדי למנוע את ההפרעה שלהן. לפיכך, הדגמה ויזואלית של יצירת הטיפות היא קריטית מכיוון שניתן להשמיד את הטיפות על ידי מניפולציה רשלנית או פיפטינג מהיר מדי.

התחל הליך זה על ידי בידוד מיקרו-RNA פלזמה או סרום. לאחר מכן תמלול הפוך ודילול שלהם כמתואר במסמך הנלווה. הסר את ערכת הפריימר של EvaGreen master mix microRNA ו-cDNA מהמקפיא ואפשר להם להפשיר בטמפרטורת החדר.

לאחר ההפשרה, הפוך את צינור התערובת הראשי מספר פעמים. ואז מסובבים את כל הריאגנטים. הכן פתרון עבודה דיגיטלי של droplet או ddPCR mix בהתאם להוראות במסמך הנלווה.

התכוננו מספיק לעד שמונה דגימות עם בקרה ללא תבנית לכל מצב בתוספת עודף של 10%לאחר ההרכבה, ערבבו היטב וסובבו את תערובת ה-ddPCR. שימו לב כי אין צורך בשכפולים טכניים בשל יכולת השחזור הגבוהה של טכנולוגיה זו. לאחר הסיבוב, הוציאו 12 מיקרוליטר של תערובת ddPCR לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות.

הוסף שמונה מיקרוליטרים של תבנית cDNA מדוללת לכל באר. לאחר מכן הכנס את מחסנית מחולל הטיפות למחזיק המחסנית. לשורה האמצעית של מחסנית מחולל הטיפות, העבירו בזהירות 20 מיקרוליטר מכל דגימה מוכנה.

הימנע מהכנסת בועות אוויר לתחתית הבאר. מלאו כל אחת מבארות הנפט בשורה התחתונה ב -70 מיקרוליטר שמן מחולל טיפות. חבר את האטם מעל מחזיק המחסנית.

הכנס למחולל הטיפות וסגור את המכסה כדי להתחיל ביצירת הטיפות. לאחר סיום ייצור הטיפות, פתח את המכסה, הסר את המחסנית ממחולל הטיפות והסר את האטם החד פעמי. הבארות העליונות של המחסנית מכילות את הטיפות.

העבירו לאט ובצורה חלקה 40 מיקרוליטר מכל אחת משמונה הבארות העליונות לעמודה אחת של לוחית PCR של 96 בארות. אטום מיד את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע אידוי. תוך 30 דקות מאיטום הצלחת, התחל ברכיבה תרמית באמצעות פרוטוקול PCR המתואר בטבלה 3 של המסמך הנלווה.

הפעל את קורא הטיפות. לאחר מכן העבר את הצלחת מהמחזור התרמי לקורא הטיפות. הנח את לוחית ה-PCR בעלת 96 הבארות המכילה את הטיפות שלאחר ה-PCR בבסיס מחזיק הצלחת בקורא הטיפות.

הנח את החלק העליון של מחזיק הצלחת על לוחית ה-PCR. לחץ בחוזקה על שתי לשוניות השחרור כלפי מטה כדי להדק את לוחית ה-PCR במחזיק. הפעל את תוכנת QuantaLife ממחשב המערכת. לחץ על Setup ופתח את קובץ נתוני התבנית הכולל מידע על הדגימות, גני היעד והבדיקות.

בסרגל הניווט הימני, בחר הפעל. יופיע חלון אפשרויות הפעלה. מתפריט Dye Set, בחר EVA ולחץ על OK כדי להתחיל בקריאת ה- droplet.

לאחר השלמת הריצה, השתמש בתרשים המשרעת הדו-ממדית בתוכנת הניתוח כדי לבחור את הטיפות החיוביות. לבחירת הטיפות החיוביות, השתמשו בכלי לאסו מסרגל הניווט השמאלי. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה אירועים כדי לבדוק את מספר הטיפות החיוביות והכוללות.

מספר כולל של 18,000 טיפות מושג בדרך כלל עם ddPCR ללא בדיקה. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה ריכוז כדי לדמיין את הדגימה הסופית של הריכוז. לבסוף השתמש בלחצן ייצוא.

CSV כדי לייצא את ערכי ריכוז המיקרו-RNA. ה-mRNA miR-181a-5p כומת בשתי דגימות פלזמה, S1 ו-S2, תוך שימוש בריכוז פריימר של 0.5 ומיקרוליטר אחד בטמפרטורות חישול של 58 ו-60 מעלות צלזיוס. איור זה מציג את העותקים של מיקרו-רנ"א למיקרוליטר בתגובת ההגברה עבור כל מצב.

טיפות PCR חיוביות עבור כל דגימה מוצגות בכחול, וטיפות שליליות מוצגות בשחור. כפי שניתן לראות כאן, בדגימת הביקורת אין טיפות חיוביות כצפוי. ביצוע ה-PCR ב-60 מעלות צלזיוס עם שימוש ב-0.5 או מיקרוליטר אחד של פריימר הביא להפרדה טובה יותר של טיפות חיוביות ושליליות.

באיור זה, קווי השגיאה מייצגים את מרווח הסמך של פואסון 95%. וכאן, מספר הטיפות החיוביות שמוצג בכחול מושווה למספר הכולל של הטיפות, שמוצג בירוק. יחד, נתונים אלה מדגימים כי ניתן להשתמש ב-PCR הדיגיטלי הטיפות כדי לקבוע את המספר המוחלט של עותקים של מיקרו-RNA למיקרוליטר של נוזל ביולוגי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כימות mRNA באמצעות PCR דיגיטלי טיפתי. לאחר השליטה, ניתן לנתח 96 דגימות תוך שעות ספורות בלבד, וזו תפוקה אופטימלית לסביבה קלינית. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו סוללת את הדרך לתחום הביופסיה הנוזלית כדי לחקור מיקרו-רנ"א וחומצות גרעין אחרות כסמנים ביולוגיים של מחלות.