Name: הגנום עריכה Astyanax mexicanus שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למד עריכת גנים ממוקדת בדגי מערות Astyanax mexicanus באמצעות TALENs. שיטה זו מאפשרת לחקור את הבסיס הגנטי של הסתגלויות אבולוציוניות במערות ולבחון את תפקוד הגנים ביצורים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לגנטיקה, פיתוח ביולוגיה של התא ו איווה סטייט ועל ידי EY024941 מענק NIH (WJ) .Dr. ג&#39;פרי Essner ספק הערות על כתב היד.

<ol><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).</li>
<li>Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+mutation+contributes+to+adaptive+beach+mouse+color+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern.</a> Science. 313 (5783), 101-104 (2006).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+means+of+an+easy+TALEN+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy.</a> J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).</li>
<li>Bannister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs+mediate+efficient+and+heritable+mutation+of+endogenous+genes+in+the+marine+annelid+Platynereis+dumerilii%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii.</a> Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+Xenopus+embryos+using+engineered+transcription+activator-like+effector+nucleases+%28TALENs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Ansai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+medaka+using+custom-designed+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases.</a> Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+doublesex-+and+mab-3-related+transcription+factor+6+and+its+involvement+in+spermatogenesis+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia.</a> Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+origin+of+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">The complex origin of Astyanax cavefish.</a> BMC Evol Biol. 12, 105(2012).</li>
<li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax+fasciatus+%28Characidae%2C+Pisces%29+-+support+for+the+neutral+mutation+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li>
<li>Teyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+in+neuromasts+of+the+blind+cave+fish+Astyanax+hubbsi+and+the+sighted+river+fish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus.</a> Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetische+Untersuchungen+zur+Evolution+des+Geschmacksapparates+bei+cavernicolen+Fischen%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zool+Syst+Evolutionforsch%22%5BJournal%5D)">Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen.</a> Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).</li>
<li>Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggressive+behavior+of+an+epigean+population+of+Astyanax+mexicanus+%28Characidae%2C+Pisces%29+and+some+observations+of+three+subterranean+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Processes%22%5BJournal%5D)">Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations.</a> Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).</li>
<li>Parzefall, J., Fricke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarm+reaction+and+schooling+in+population+hybrids+of+Astyanax+fasciatus+%28Pisces%2C+Characidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoires+e+Biospeologie%22%5BJournal%5D)">Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae).</a> Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Genetics+of+Feeding+Behavior+in+the+Cave+Fish+Astyanax+mexicanus+F.+anoptichthys%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Tierpsychol%22%5BJournal%5D)">Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys.</a> Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).</li>
<li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li>
<li>Protas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-trait+evolution+in+a+cave+fish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus.</a> Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).</li>
<li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).</li>
<li>Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+adaptive+behavior+and+its+sensory+receptors+promotes+eye+regression+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish.</a> BMC Biol. 10, 108(2012).</li>
<li>Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+in+feeding+posture+occurs+through+different+genetic+loci+in+independently+evolved+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schooling+Behavior+in+Cavefish+through+Sight-Dependent+and+Sight-Independent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms.</a> Curr Biol. , (2013).</li>
<li>Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+craniofacial+changes+in+blind+cave-dwelling+fish+are+mediated+by+genetically+symmetric+and+asymmetric+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci.</a> Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+controls+eye+degeneration+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish.</a> Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).</li>
<li>Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+benefit+of+albinism+in+Astyanax+cavefish%3A+downregulation+of+the+oca2+gene+increases+tyrosine+and+catecholamine+levels+as+an+alternative+to+melanin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis.</a> PLoS One. 8 (11), e80823(2013).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).</li>
<li>Primer3 v. 0.4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ ">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ </a> (2015).</li>
<li>Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3- new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).</li>
<li>Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf</a> (2011).</li>
<li>Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: <a target="_blank" href="http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf">http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf</a> (2012).</li>
<li>Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection">https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection</a> (2009).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FokI+dimerization+is+required+for+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FokI dimerization is required for DNA cleavage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).</li>
<li>Elipot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+enzyme+monoamine+oxidase+explains+part+of+the+Astyanax+cavefish+behavioural+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome.</a> Nat Commun. 5, 3647(2014).</li>
<li>McGaugh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nat Commun. 5, 5307(2014).</li>
<li>Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li>
<li>Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system--keeping+zebrafish+gene+targeting+fresh%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh.</a> Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289 (5479), 631-633 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

צעדים גדולים נעשו בשנים האחרונות כלפי בהבנת הבסיס הגנטי של האבולוציה של תכונות. בעוד גני מועמדים שבבסיס האבולוציה של מספר התכונות זוהו, היא נותרה מאתגרת לבדוק גנים אלה in vivo בשל חוסר העקיבות גנטית של מינים המעניינים ביותר מבחינה אבולוציונית. כאן אנו מדווחים על שיטה לעריכה הגנום א mexicanus, זן לשמש כדי לחקור את האבולוציה של בעלי חיים במערה. מיפוי גנטי לומד 1,21,23 ו גן מועמד גישות 19,40 זיהה מספר גני מועמדים לאבולוציה של תכונות בצורת המערה...

הבנת הבסיס הגנטי של אבולוצית תכונה היא מטרת מחקר ביקורתית של ביולוגים אבולוציוניים. התקדמות ניכרת כבר עשתה בזיהוי לוקוסים שבבסיס האבולוציה של תכונות ואיתור גני מועמדים בתוך לוקוסים אלה (למשל 1-3). עם זאת, מבחינה תפקודית לבחינת התפקיד של הגנים הללו נותר מאתגרים כמו אורגניזמים רבים המשמשים ללימוד האבולוציה של תכונות אינן כיום גנטי צייתניות. הופעתו של טכנולוגיות עריכת הגנום גדלה מאוד manipulability הגנטי של מגוון רחב של אורגניזמים. Nucleases מפעיל מפעיל דמוי תמלול (TALENs) ומקובצים interspaced בקביעות חזרות palindromic קצר (CRISPRs) שימשו כדי ליצור מוטציות ממוקדות בגנים בכמה אורגניזמים (למשל 4-11). כלים אלה, הוחלו על מחשב רלוונטי מבחינה אבולוציונית, יש פוטנציאל לחולל מהפכה באופן שבו ביולוגים אבולוציוניים ללמוד את הבסיס הגנטי של אבולוציה. Astyanax mexicanus הוא מין של דג כי קיים בשתי צורות:. צורת משטח שוכני נהר (דגי שטח) וצורות המערה שוכני מרובים (cavefish) א cavefish mexicanus התפתח מאבותיהם דגי משטח (הנסקרת ב 12). אוכלוסיות של cavefish התפתחו מספר תכונות לרבות אובדן העיניים, להפחית או אובדן פיגמנטציה, גדל מספרם של בלוטות הטעם ואת neuromasts גולגולתי, ושינויים בהתנהגות כגון אובדן של התנהגות לימוד, תוקפנות מוגברת, שינויים האכלה ביציבה hyperphagia 13 -19. Cavefish ודגי שטח הם interfertile, וניסויי מיפוי גנטיים בוצעו לזיהוי גני לוקוסים ומועמד עבור תכונות מערות 1,20-26. כמה גני מועמדים נבדקו עבור תפקיד פונקציונלי בתרומת תכונות במערת תרבית תאי 1,19, באורגניזמים מודל של מינים אחרים 21 או על ידי ביטוי יתר 27 או מציאה חולפת uלשיר morpholinos 28 ב א mexicanus. עם זאת, כל אחת מהשיטות הללו יש מגבלות. היכולת ליצור אללים מוטנטים של גנים אלה א mexicanus הוא קריטי להבנת תפקידם באבולוציה של cavefish. לכן, א mexicanus הוא אורגניזם מועמד אידיאלי עבור יישום של טכנולוגיות עריכת הגנום. כאן אנו מתארים שיטה לעריכה הגנום א mexicanus באמצעות TALENs. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך דגי מייסד מוזרק פסיפס עבור פנוטיפים ו לבידוד קווי דג עם מוטציות יציבות בגני עניין 29.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הזרקת תחנת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'ל מכשיר</td><td></td><td></td><td></td>ג'ל</tr><tr><td>מושך</td><td></td><td></td><td></td>מחט</tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם</חזק></td><td><חזק> Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הערה: ככל הידוע לנו, ניתן להשתמש באספקה מחברות שונות אלא אם כן צוין</td><td></td><td></td><td></td>אחרת</tr><tr><td>Golden Gate TALEN ו-TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנטים LB אגר, מילר (מגורען)</td><td>פישר</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנטים מיקרוביולוגיה מדיה: מרק LB, מילר</td><td>פישר</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 ב-50% EtOH</td><td>Teknova (הוזמן דרך פישר)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>ספקטינומיצין דיהידרוכלוריד, פישר ביו-ריאגנטים</td><td>פישר</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>סופר אמפיצילין (פי 1,000 פתרון)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, מוכן לשימוש</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (הוזמן דרך פישר)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, פישר ביו-ריאגנטים</td><td>פישר</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>פישר</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (הוזמן דרך פישר)</td><td>50-812-203</td><td>השתמש ב-BsaI, לא ב-BsaI-HF (כמתואר בפרוטוקול Golden Gate TALEN ו-TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>סיפקה אנזימי</td><td></td>הגבלה</tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (הוזמן דרך פישר)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (הוזמן דרך פישר)</td><td>PRM7123</td><td>ניתן להשתמש ב-Taq אחר, אך יש להתאים את התגובה בהתאם</td></tr><tr><td>ערכת קשירה מהירה</td><td>New England Biolabs (הוזמן דרך פישר)</td><td>50-811-728</td><td>אנו משתמשים ב-Quick Ligase לכל תגובות ההרכבה של TALEN</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemical Qualified E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>ניתן להשתמש בתאים מוכשרים אחרים מבחינה כימית או בתאים מוכשרים תוצרת בית</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (הוזמן דרך פישר)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>DNase Epicentre תלוי ATP בטוח לפלסמיד</td><td>(הוזמן דרך פישר)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>יש להשתמש בערכת Qiagen להכנת הפלסמיד הראשונית (כמתואר בפרוטוקול Golden Gate TALEN ו-TAL Effector Kit)</td></tr> <tr><td>ערכת טיהור QIAquick PCR Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE מתמוסס במהירות Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (הוזמן דרך פישר)</td> <td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute ערכת ניקוי</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly טעינת דגימה צבע&nbsp;</td><td>אמביון (הוזמן דרך פישר)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (הוזמן דרך פישר)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד חד פעמי סודה-ליים זכוכית פסטר פיפטס</td><td>פישר</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית סטנדרטיים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס Eppendorf Femtotips עבור Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (הוזמן דרך פישר)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>פישר</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

הגנום עריכה<em&gt; astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול activator דמוי מפעיל nucleases (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

זיהוי אללים של גנים העומדים בבסיס השינוי האבולוציוני חיוני להבנת כיצד ומדוע מתרחשת אבולוציה. לקראת מטרה זו, עבודות רבות שנעשו לאחרונה התמקדו בזיהוי גנים מועמדים לאבולוציה של תכונות במגוון מינים. עם זאת, עד לאחרונה היה מאתגר לאמת פונקציונלית גנים מועמדים מעניינים. כלים שפותחו לאחרונה להנדסה גנטית מאפשרים לבצע מניפולציות על גנים ספציפיים במגוון רחב של אורגניזמים. יישום טכנולוגיה זו באורגניזמים רלוונטיים מבחינה אבולוציונית יאפשר תובנה חסרת תקדים לגבי תפקידם של גנים מועמדים באבולוציה. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) הוא מין של דג בעל צורות שוכנות על פני השטח ומערות. קווים עצמאיים מרובים של צורות שוכני מערות התפתחו מדגי שטח קדומים, שהם פוריים זה עם זה ועם דגי פני השטח, מה שמאפשר הבהרת הבסיס הגנטי של תכונות המערות. A. mexicanus שימש למספר מחקרים אבולוציוניים, כולל ניתוח קישורים לזיהוי גנים מועמדים האחראים למספר תכונות. לפיכך, A. mexicanus היא מערכת אידיאלית ליישום עריכת גנום לבדיקת תפקידם של גנים מועמדים. כאן אנו מדווחים על שיטה לשימוש בנוקלאזות אפקטור דמויות מפעיל שעתוק (TALENs) למוטציה של גנים במשטח A. mexicanus. עריכת גנום באמצעות TALENs ב-A. mexicanus שימשה ליצירת מוטציות בגנים של פיגמנטציה. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי להעריך את תפקידם של גנים מועמדים למספר תכונות אחרות שהתפתחו בצורות מערות של A. mexicanus.

זריקות זוג Talen לגרום מחייב של RVDs כדי דנ&quot;א ספציפי ובכך dimerization של תחומי FokI, וכתוצאה מכך הפסקות גדילים כפולות 39 אשר ניתן לתיקון באמצעות קצה שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ). NHEJ לעתים קרובות מציג שגיאות שיוצרות תוספות או השמטות (indels). Indels ניתן לזהות על ידי הגברה באזור המקיף את אתר היעד Talen ושמע את amplicon וכתוצאה עם אנזים הגבלה שחותך בתוך האזור spacer Talen. אללים ללא indel יהיו לעכל תוך אללים המכילים indels...

ג&#39;ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר מוטציות לגנים ספציפיים בדג המערות Astyanax mexicanus. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה האבולוציונית בנוגע לבסיס הגנטי של האבולוציה של תכונות מערות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן כעת לבחון את ההשפעה של אובדן הגן הספציפי ב-Astyanax mexicanus.לאחר תכנון והרכבה של נוקלאזות דמויות אפקטורים של מפעיל תמלול, או TALENs, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-2 µL של Sac1 כדי לעכל 4 µg של תבנית מאומתת רצפית ב-37 °C למשך שעתיים. הריצו 2 µL של הפלסמיד שעוכל על ידי Sac1 על ג'ל אגרוז בריכוז 1.5% ובדקו לקיומה של פס אחת כדי לאמת את העיכול. לצורך ביצוע ייצור T3 mRNA, השתמשו ב-0.5 µg של תבנית לינארית להכנת חצאי תגובות בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי.דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הוסיפו 0.4 µL של DNase ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר טיהור ה-mRNA, כדי לבדוק את האיכות, השתמשו במוצר המסיר זיהום של RNase כדי לנקות את מכשיר הג'ל.לאחר מכן, הכינו ג'ל בריכוז של 1.2%. ערבבו 1 µL של ה-mRNA, 4 µL של מים נקיים מנוקליאז (nuclease-free water), ו-5 µL של צבע טעינה גליוקסל (glyoxal loading dye). דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 50 °C למשך 30 דקות.לאחר מכן, סובבו את המבחנות סבב קצר בצנטריפוגה והניחו אותן על קרח לפני הרצת הג'ל. לאחר בדיק

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי החלפת את אקסון קידוד הראשון של גנים עם מנהלי התקנים של שעתוק. השיטה מבוססת על CRISPR/Cas9 ממקם את רצף transactivator תחת ויסות גנים הוחלף אנדוגני, כתוצאה מכך ומקילה על ההתבטאות transctivator באופן בלעדי בדפוסי ייתכן גנים ספציפיים.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

הציג כאן הוא פרוטוקול לבצע זמן, שטח הגן מוגבל להוריד במיתרי השדרה על ידי הזרקת CAS9-gRNA מורכבות לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation.

גן ישיר לנקוש-החוצה של חוט השדרה בתאי גזע עצביים באמצעות אלקטרופורציה של CAS9 חלבון-gRNA מכלולי

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

היעילות של שיטת עריכת הגנום המשופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD) דומה למיקרו-הזרקה מסורתית, הדורשת איסוף זיגוטה מנקבות תורמות והעברה לנקבות פסאודו-בהריון. פרוטוקול זה מדגים את יעילותו על ידי החדרת מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 ללוקוס ROSA26 בכרומוזום 6.

עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

למד עריכת גנים ממוקדת בדגי מערות Astyanax mexicanus באמצעות TALENs. שיטה זו מאפשרת לחקור את הבסיס הגנטי של הסתגלויות אבולוציוניות במערות ולבחון את תפקוד הגנים ביצורים חיים.

הגנום עריכה

גלה סרטונים נוספים