גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לשפר את היעילות של יצירת נגיף החיסון המוטנטי על ידי שימוש בטכנולוגיית CRISPR-Cas9. שיטה זו יכולה לסייע ביצירת וקטורים חדשים של נגיף החיסון למחקר ביולוגי ומחקר רפואי, במיוחד לטיפול גנטי וחיסון. הדגמה ויראלית בשיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה לבצע זיהוי ואיסוף של פלאקים חיוביים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משפרת באופן דרמטי את היעילות בהפיכת המוטציה שלנו לנגיף החיסון. החל מתאי CV-1 שנקטפו, התאם את ריכוזם ל-100,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן זרעו שני מיליליטר מהמתלה לכל באר של צלחת שש בארות לצורך העברה.

למחרת, העבירו את התאים עם 0.5 ננוגרם של פלסמיד gRNA-N2 ו-0.5 ננוגרם של פלסמיד pSTCas9. ואז דגרו אותם למשך 24 שעות. 24 שעות לאחר מכן, החלף את המדיום.

לאחר מכן, הכן את נגיף VVL15. לדלל את נגיף VVL15 בעמוד השדרה עם DMEM ל-200,000 PFU למיליליטר. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של הנגיף המדולל לכל באר של תאי CV-1 שעברו טרנספטציה.

שעתיים לאחר מכן, העבירו את התאים עם מיקרוגרם אחד של וקטור תורם המעבורת לביטוי HR, ודגרו על התאים למשך 24 שעות. למחרת, נתק את תאי ה-CV-1 שעברו טרנספטציה באמצעות מגרד תאים. לאחר מכן אוספים את תרחיף התאים לקריוביאל ומאחסנים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

כדי להתחיל את הסבב הראשון של טיהור ה-VV המותאם, זרעו 15 צלחות של שש בארות עם 300,000 תאי CV-1 לא מותאמים לבאר. למחרת, הפשירו את התרחיף הקפוא של תאי CV-1 שעברו טרנספטציה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן מערבלו במרץ את התרחיף למשך 30 שניות כדי ליז את התאים. ואז לדלל מיקרוליטר אחד של הליזאט בשלושה מיליליטר DMEM.

הוסף חצי מיליליטר מהדילול הזה לכל באר צלחת של תאי CV-1 ללא שינוי. לאחר מכן החזירו את הצלחות לחממה למשך יומיים. יומיים לאחר מכן, זהה פלאק חיובי ל-RFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ניתן לזהות אותם עם יעד פי 10. כאשר הם מזוהים, סמן במדויק את הלוחות מתחת לצלחת באמצעות עט טוש. כעת הכינו קריוביאל המכיל 200 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום עבור כל רובד חיובי לקציר.

לאחר מכן, חשוב לשאוף את כל המדיום מהבארות עם לוחות מסומנים. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר המוגדרת לשאיבת 30 מיקרוליטר, טען חלקית את הפיפטה עם 10 מיקרוליטר מדיום מהקריוביאל, ולאחר מכן גרד את הלוח ושרטט את התאים עם השאיפה שנותרה. הוצא את זה לתוך הקריוביאל וחזור על הליך זה פעמיים נוספות, תוך התמקדות באותו רובד חיובי ל-RFP כדי לאסוף כמה שיותר תאים.

אחסן את האוספים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, או, אם יש לבצע את סבב הטיהור השני באופן מיידי, הקפיאו את הקריוביאלים על קרח יבש למשך 10 דקות. הסיבוב השני של טיהור ה-VV המותאם מתבצע בדיוק כמו הראשון באמצעות התאים הקפואים מהסיבוב הראשון. עם זאת, ניתן לבחור יותר משישה לוחות חיוביים ל-RFP עבור כל שורה חיובית ל-RFP.

חזור על תהליך הבחירה עד שכל הפלאקים שנוצרו מרובד חיובי אחד יהיו חיוביים ל-RFP מה שמצביע על כך שהפלאק טהור, מה שיכול לקחת שלושה עד חמישה סיבובים נוספים. יום מראש, הכינו צלחת בעלת שישה קירות עם חצי מיליון תאי CV-1 לבאר. למחרת, הפשירו את הפלאק המטוהר הקפוא ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

לאחר מכן מערבב את הלוח במרץ למשך 30 שניות כדי ליצור ליזאט. הוסיפו את כל הליזאט, כולל פסולת התאים, לבאר של תאי CV-1, ודגרו על הצלחת למשך שלושה ימים. אל תשתמש בחמש הבארות האחרות.

בדוק את התאים מדי יום במיקרוסקופ. כאשר יותר ממחצית התאים נראים ציטופתיים, קצרו את התאים הנגועים. באופן אידיאלי כל התאים צריכים להיות ציטופתיים.

השתמש במגרד תאים כדי לאסוף את התאים בצינור של 15 מיליליטר עם מדיום תרבית. לאחר מכן גלולה את התאים ב -300 גרם למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנטנט והמשיכו להשתמש ב-PCR כדי לאמת את השינוי של ה-VV המוטנטי, או הקפיאו את כדור התא ב-80 מעלות צלזיוס שליליות כדי לעשות זאת מאוחר יותר.

השיטה המתוארת משפרת את יעילות הרקומבינציה ביותר מפי 100 בהשוואה לפרוטוקולים קונבנציונליים. לדוגמה, ה-VV N1LG היה מיועד לשינוי. כפי שתואר, פלזמות המבטאות Cas9 ו-gRNA ספציפי ל-N1L הועברו יחד לתאי CV-1 כדי לשפר את יעילותם לרקומבינציה הומולוגית.

יום אחד לאחר הטרנספקציה, RFP התבטא בתאי CV-1. לאחר מכן, תאי CV-1 נדבקו בכל הליזאט מהרקומבינציה ההומולוגית. פלאק חיובי ל-RFP ושלילי נצפו שניהם בתאי CV-1.

בעקבות פרוטוקול הטיהור התקבל רקומביננט טהור. כל הפלאקים לאחר הדבקה בליזאט התא שמקורו ברובד טהור עם נגיף החיסון המוטנטי הציגו אות RFP. נעשה שימוש ב-PCR כדי לאמת את מחיקת הגן הממוקד.

הנגיף השונה הראה אות חיובי ל-RFP, וללא אות ל-N1L, בניגוד לבקרת ה-N1L השלמה. כולם היו חיוביים לגן הלא ממוקד A52R. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור במהירות וקטור חדש של וירוס חיסון.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 10 ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המדעים הביו-רפואיים לחקור וקטורים נגיפיים חדשים בפיתוח חומרים ביולוגיים לטיפול ומניעת סרטן ומחלות זיהומיות.