שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

המטרה הכוללת של שיטת תרבית תאים חדשה זו היא לייצר תאי שומן ממוינים ביעילות רבה יותר. השיטה שלנו עשויה לסייע לחוקרים העובדים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לענות על שאלות מפתח לגבי מספר תהליכים המעורבים בייצור תאים אדיפוגניים, אוסטאוגניים וכונדרוגניים. מכיוון שהיתרון העיקרי של פרוטוקול תרבית התאים שלנו הוא שהוא משפר את איכות תאי ה-DEFAT, הוא עשוי להיות מיושם בעתיד הקרוב כדי לשפר את היישומים הנוכחיים בטיפול בתאים ובהנדסת רקמות.

לאחר הבאת דגימת השומן התת עורי של המטופל למעבדה מחדר הניתוח, יש לשקול את הרקמה ולהניח דגימה של גרם עד שניים של רקמת שומן לתוך שפופרת של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את הדגימה עם חמישה מיליליטר PBS ולאחר מכן העבירו את הדגימה לכלי פלסטיק בגודל 10 סנטימטר. הסר את ה-PBS.

לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר קולגנאז סטרילי של 0.1% לנפח לכלי המכיל את הדגימה. לאחר מכן, השתמש במספריים כירורגיים כדי לטחון את הרקמה עד שהיא מגיעה לעקביות מחית. מעבירים את הרקמה הטחונה ותמיסת הקולגנאז לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ומעכלים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, עם ניעור ב -60 סל"ד.

לאחר העיכול, סנן את הדגימה המעוכלת דרך מסנן 100 מיקרון לתוך צינור טרי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו 10 מיליליטר של מדיום תרבית DEFAT בתוספת 2% FBS דרך המסנן. כדי לבודד את תאי השומן מתרחיף התאים, צנטריפוגה תחילה את התאים המסוננים ב-100 פעמים גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

במהלך הצנטריפוגה, הכינו חמישה מיליליטר DCM בתוספת 2% FBS בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לשאוב את תאי השומן הצפים מהצינור הצנטריפוגה ולהוסיף את התאים לצינור של 15 מיליליטר המכיל מדיום. נענע את הצינור בעדינות כדי לערבב את מדיום ה-DCM עם התאים.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב 100 פעמים גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השתמש במחט בגודל 18 ובמזרק של 20 מיליליטר כדי להסיר את המדיום בתחתית הצינור. לאחר מכן הוסיפו לתאים 10 מיליליטר של DCM בתוספת 2% FBS וערבבו על ידי ניעור עדין של הצינור.

צנטריפוגה את התאים שוב ב -100 פעמים גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל בציפוי, הוסף 41 מיליליטר של DCM או DMEM בתוספת 20% FBS לבקבוק של 12.5 סנטימטר. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב 40 מיקרוליטר של תאי שומן ולהוסיף אותם לבקבוק.

לאחר מכן מלאו את הבקבוק ב-DCM או DMEM בתוספת 20% FBS. זה קריטי שהתאים יתפזרו בכל המדיום. מניחים את הבקבוק על מכסה צלחת פטרי עגולה כדי לשמור עליה שטוחה.

לבסוף, הניחו את הבקבוק בתוך אינקובטור המוגדר ל-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס והשאירו אותו ללא הפרעה למשך שבעה ימים. לאחר שבוע של דגירה, הפוך את הבקבוק ובדוק אם יש תאי שומן לא מובחנים. לאחר מכן, שאפו את המדיה ולאחר מכן הוסיפו לבקבוק חמישה מיליליטר של DCM או DMEM בתוספת 20% FBS.

אפשר לתאי ה-DEFAT לגדול במשך שבוע נוסף לאחר שינוי המדיום. לאחר שבוע, השתמש במונה תאים כדי לספור את מספר תאי ה-DEFAT שנוצרו בתנאי תרבית תאים שונים. תמונה זו מציגה מושבות תאים של DEFAT לאחר 14 יום של תרבית ב-DMEM.

כאן תאי ה-DEFAT מוצגים לאחר 14 יום של תרבית ב-DCM. בכל מקרה, סרגל קנה המידה מייצג 200 מיקרון. התפשטות תאי DEFAT כומתה באמצעות מונה תאים, והושוותה היעילות של DCM ו-DMEM ביצירת תאי DEFAT.

כפי שניתן לראות כאן, התפשטות תאים משופרת נצפית עם השימוש ב-DCM. כאן, תאי DEFAT אנושיים, שנוצרו באמצעות DCM, תורבתו במשך שלושה שבועות באמצעי האינדוקציה המתאים כדי להעריך את יכולות ההתמיינות מחדש וההתמיינות של תאי DEFAT. התאים היו חיוביים ליכולת אוסטאוגנית על ידי צביעת פוספטאז אלקליין ועל ידי צביעה עם Alizarin Red S. לבסוף, יכולת אדיפוגנית הוכחה עם צביעת שמן אדום O.

חשוב מאוד לוודא שקולגנאז עם בידוד בסיסי ותאי שומן מבוצעים שניהם בזהירות מירבית על מנת לייצר בהצלחה תאי DEFAT באיכות גבוהה. באמצעות מאמצים אלה, שיטת תרבית התאים המאומתת שלנו שואפת להקל על מאמצי המחקר הנוכחיים והעתידיים בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית והרפואה הרגנרטיבית.