זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי במבחנה RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאחזר חלבונים קושרי RNA של תעתיק RNA מרקמת שומן חומה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום זה, כגון, מהם מנגנוני הבקרה של RNA מקודד לחיים ארוכים, וחלבוני RNA קשורים. היתרון העיקרי של טקטיקה זו הוא שהיא קלה לביצוע.

ה-RNA המשמש להדגמת הליך זה הוא שבר של האזור הלא מתורגם של קולטן האנטיגן 3-Prime, המכונה להלן AR 3-Prime UTR. התחל בהגברת האוליגו T7 AR והרצף החלקי של ה-DNA של לוציפראז הגחלילית מהפלסמיד psiCHECK-2. הפריימרים והפרמטרים בהם נעשה שימוש מפורטים במסמך הנלווה.

לאחר ההגברה, השתמש בייצור ה-PCR כתבניות לסינתזה של RNA ביוטיניל באמצעות ערכת שעתוק במבחנה, בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר שעתוק במבחנה, הוסף מיקרוליטר אחד של דנאז לתגובה ודגר אותו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לפגוע ב-DNA של התבנית.

לאחר מכן, הביאו את הנפח הכולל עד 60 מיקרוליטר עם מים. החל את ה-RNA הביוטיניל על עמודות הטיהור כדי להסיר את המלח והנוקלאוטידים הלא משולבים. לאחר מכן, לאחר מדידת ריכוז ה-RNA, אחסן את ה-RNase במינוס 80 מעלות צלזיוס לבדיקות משיכה לאחר מכן.

ביום הבדיקה, יש להפשיר את ה-RNA הקפוא עם ביוטינילציה על קרח. לאחר מכן, כדי להבטיח של-RNA המעניין יש את המבנה המשני המתאים, יש לחמם 50 מיקרוליטר ממנו ב-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. מצננים על קרח במשך שתי דקות.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר מבנה RNA 2X ואפשר ל-RNA להתקפל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השעו מחדש חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין בבקבוקון המקורי שלהם על ידי מערבולת קצרה שלהם. לאחר מכן, העבירו 150 מיקרוליטר מהחרוזים התלויים לצינור של 1.5 מיליליטר.

הנח את הצינור במעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד בין החרוזים המגנטיים לבין הסופרנטנט. השתמש בפיפטה כדי להסיר ולזרוק את הסופרנטנט. שמור את כדור החרוזים.

שטפו את החרוזים פעם אחת על ידי השעיית כדור החרוזים במיליליטר אחד של מאגר הכריכה והכביסה המומלץ על ידי היצרנים, ולאחר מכן הנח את הצינור על סיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים עם מאגר A ומאגר B פעמיים. לאחר הדגירה, השליכו את הסופרנטנט ושמרו את כדור החרוזים.

לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר כביסה וכריכה פי 2. חלקו את החרוזים באופן שווה לשלושה צינורות של 1.5 מיליליטר עם 100 מיקרוליטר חרוזים לכל צינור. הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא RNase, 100 מיקרוליטר של RNA לוציפראז גחלילית ביוטיניל ו-100 מיקרוליטר של RNA AR 3-Prime UTR ביוטיניל.

דוגרים על כל תערובת חרוזים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב. לאחר מכן, הנח את הצינורות על המגנט למשך דקה אחת. הסר והשליך את הסופרנטנט.

שמור את כדורי החרוזים. לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעמיים, בכל פעם השעו מחדש את כדורי החרוזים עם 400 מיקרוליטר של מאגר כביסה וכריכה 1X, ולאחר מכן הניחו אותם על הסיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את הצינורות על מגנט למשך דקה.

לאחר מכן, הסר והשליך את כל הסופרנטנט. השעו מחדש כל כדור חרוז ב-50 מיקרוליטר של מאגר בידוד גרעיני. לקראת החלק הבא של הפרוטוקול, ודא שכל המאגרים, כמו גם הומוגנייזרים מזכוכית dounce מקוררים על קרח.

הכנת הליזאט של התא צריכה להמשיך על קרח. עבור כל בדיקת RNA נפתחת לביצוע, הכינו מנה אחת של 15 סנטימטר של פרה-אדיפוציטים מובחנים מעכברי C57 Black Six בני שלושה שבועות. ארבעה עד חמישה ימים לאחר מכן, כדי לקצור את התאים, הוסיפו 10 עד 15 מיליליטר PBF ולאחר מכן השתמשו במגרד תאים כדי להוציא את התאים מהצלחת.

העבירו אותם לצינור של 50 מיליליטר ואז גלולו אותם על ידי צנטריפוגה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשאוף ולהשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא בשני מיליליטר של חיץ היפוטוני ודגרו את התאים על הקרח למשך רבע שעה.

העבירו את התאים להומוגניזטור זכוכית של 15 מיליליטר וגזזו את התאים באופן מכני על קרח ב-20 פעימות. גלולה את גרעיני התא על ידי צנטריפוגה ב-3300 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, העבירו את הסופרנטנט לצינורות של 1.5 מיליליטר ושמרו את הכדור על הקרח לשימוש מאוחר יותר.

לסופרנטנט, הוסף אשלגן כלורי 3 מולארי כדי לקבל ריכוז סופי של 150 מילימולר. סובב ב 20, 000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה תהיה שכבת שומנים בחלקו העליון.

השתמש בפיפטה של מיליליטר כדי להסיר אותה בזהירות. לאחר מכן, אסוף את הסופרנטנט של ליזאט תאי ציטופלזמי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, השעו מחדש את גלולת הגרעינים במיליליטר אחד של מאגר בידוד גרעיני והעבירו להומוגניזטור זכוכית של 15 מיליליטר.

גזור את הגרעינים באופן מכני על קרח ב-100 פעימות. גלולה את הפסולת הגרעינית על ידי צנטריפוגה ב-20,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט כליזאט התא הגרעיני.

ניתן לשלב אותם עם הליזאט הציטופלזמי שנאסף קודם לכן או לשמור בנפרד ליישומים מאוחרים יותר. כאן, הדגימות משולבות ביחס של אחד לאחד. הוסף מעכב RNase לליזאט התא הלא מפורק כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 יחידות למיקרוליטר.

לאחר מכן, הניחו בצד 100 מיקרוליטר של ליזאט התא על קרח כבקרת קלט לכתמים מערביים. פצלו את ליזאט התא לשלושה אליקוטים שווים עם מיליליטר אחד של ליזאט תאים בכל צינור של 1.5 מיליליטר ודגרו עם חרוזים מצומדים של גחלילית ריקה, לוציפראז RNA מצומד ו-AR 3-Prime UTR, בהתאמה, למשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. לאחר הדגירה, הניחו את הצינורות על המגנט למשך דקה.

השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לאסוף את הסופרנטנט, ולאחר מכן בודד את ה-RNA והעריך את שלמות ה-RNA כמתואר במסמך הנלווה. שמור את כדורי החרוזים על קרח. שוטפים את החרוזים המגנטיים שש פעמים.

בכל פעם, השעו מחדש את כדורי החרוזים במיליליטר אחד של מאגר בידוד גרעיני המכיל 40 יחידות של מעכב RNase ו-0.25 אחוז איגפאל. סובב את הצינורות למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינורות במעמד מגנטי כדי להפריד בין החרוזים המגנטיים לסופרנטנט.

לאחר דקה אחת, שאפו והשליכו את הסופרנטנט, ואז הניחו את כדורי החרוזים על קרח. כדי לסלק את קומפלקסי חלבון ה-RNA מהחרוזים לצורך כתמים מערביים, ראשית, יש להשעות מחדש כל כדור חרוז ב-75 מיקרוליטר של מאגר בידוד גרעיני. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר טעינת כתמים מערבי פי 4.

המכיל SDS, לקבלת נפח כולל של 100 מיקרוליטר. לבסוף, הרתיחו חרוזים בתמיסה זו של 100 מיקרוליטר בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בצע כתמים מערביים לאימות RBP כמתואר במסמך הנלווה.

בניסוי זה, מקטע RNA של קולטן אנטיגן שימש כפיתיון ללכידת החלבון הקושר שלו, HuR. גם פיתיון RNA של לוציפראז גחלילית שאינו קשור לחלבון HuR וגם חרוזי סטרפטווידין ריקים לא מצומדים שימשו כבקרות שליליות. אינטראקציות חלבון RNA יכולות להתרחש בגרעין או בציטופלזמה, וניתן ליישם פרוטוקול משיכה זה על ליזטים של תאים גרעיניים או ציטופלזמיים כוללים או מקוטעים.

ניתוח על ידי Western Blotting הראה חלבון HuR בליזאט התא הלא מפורק, או קלט, באמצעות הנוגדן החד-שבטי. מקטע חמקמק ה-RNA של קולטן האנטיגן נתן גם הוא תוצאה חיובית, המצביעה על נוכחות של חלבון HuR בליזאט השומן באמצעות חרוזי ה-RNA המצומדים של קולטן האנטיגן לבדיקת ה-RNA הנשלפת. גם שבר פליטת ה-RNA של לוציפראז הגחלילית וגם דגימת החרוז הריק נתנו תוצאות שליליות, מה שמצביע על כך שאינטראקציות לא ספציפיות לא היו ניתנות לזיהוי בגישה זו.

יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהאינטראקציה בין מקטע ה-RNA של קולטן האנטיגן לחלבון HuR הייתה ספציפית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאחזר חלבונים קושרי RNA מתעתיק RNA מרקמת שומן חומה. לאחר השליטה, ניתן לעשות זאת תוך 24 שעות, אם זה מבוצע כראוי.