Name: זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי במבחנה RNA הנפתח ב adipocyte תרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול RNA pull-down לזיהוי חלבונים קושרי RNA בחומן חום. השיטה משתמשת ב-AR 3-Prime UTR כדי לאחזר RBPs מלייזט של adipocytes חומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק סינגפור NRF (NRF-2011NRF-NRFF001-025) וכן CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

הערה: RNA של עניין בהקשר של מחקר זה הוא שבר של AR 3&#39;UTR. 1. הכנת RNA ביוטין שכותרתו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את RNA, להגביר T7-AR-אוליגו על ידי PCR, ואחריו ב שעתוק במבחנה באמצעות ערכה מסחרית ובעקבות הוראות יצרן 11. הערה: צבעי יסוד PCR מפורטים בטבלה 4: T7-AR-F ו- T7-AR-R. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת שליטה מחייב הלא ספציפית, להגביר רצף חלקי של בלוציפראז גחלילית (פל) DNA על ידי PCR מן הפלסמיד psiCHECK-2, ואחריו שעתוק במבחנה. הערה: צבעי יסוד PCR מפורטים בטבלה 4: hluc (+) - T7-בדיקה-F ו hluc (+) - בדיקה-R לוח 4 רצפים של תבנית פריימרים עבור הגברת PCR... </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תגובת PCR 50 μl, לערבב 50 ng DNA (אוליגו או פלסמיד), 4 dNTPs μl (2.5 מ&quot;מ של כל dNTP בודדים), 5 μl 10x חיץ התגובה, 1 μl 2.5 U / &amp; #181; l DNA פולימרז, 2 μl 10 מיקרומטר פריימר קדימה, 2 μl 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, ו nuclease ללא מים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הגברת PCR ב Cycler תרמית באמצעות התכנית הבאה. Step1: מחזור אחד של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; Step2: 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (AR) או 60 שניות (פל); שלב 3: מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז RNAs biotinylated באמצעות ערכת שעתוק במבחנה הבאה הוראות יצרן 11. בניסוי זה, להשתמש במוצרי PCR כתבניות סינתזת RNA. עבור התגובה שעתוק 20 μl במבחנה, לערבב 200 DNA ng PCR מוגבר, 2 μl של כל NTP הפרט, 1 μl 10mm ביוטין-CTP, 2 μl חיץ התגובה 10x, ו- RNA פולימראז 2 μl T7. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שעתוק במבחנה, תערובת התגובה פינוק עם 1 μl 2 U / μl DNase ב 37 &amp; #176; צלזיוס למשך 15 דקות כדי לבזות DNA תבנית. לבסוף, לדלל את RNA biotinylated כדי בהיקף כולל של 60 μl עבור הטיהור הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר RNAs biotinylated להסיר מלחים נוקלאוטידים מאוגדים באמצעות עמודות טיהור הבאים הוראות היצרן 12. מדוד ריכוז חנות RNA ב -80 ° C עבור מבחני הנפתח שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח מבנה תיכון נאות עבור RNA של עניין האינטראקציה RNA חלבון, חום 50 μl RNA biotinylated (50 PM) על 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ומקררים על קרח במשך 2 דקות, ולאחר מכן לספק עם 50 μl חיץ מבנה RNA 2x (לוח 3), ולאפשר עבור RNA מתקפל ב RT למשך 30 דקות 13,14. </li></ol> 2. הכנת חרוזים RNA מצומדות הערה: השתמש עמדה מגנטית להפרדה של חרוזים המגנטיים supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend החרוזים המגנטיים צופה streptavidin בבקבוקון המקורי על ידי vorte הקצרXing הבא הוראות היצרן. העבר 150 μl resuspended חרוזים לצינור 1.5 מ&quot;ל. מניחים את הצינור על המגנט דקות 1. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז. הערה: מבחני הנפתח RNA, כאשר aliquoting חרוזים resuspended מן הבקבוקון המקורי, השתמש 50 חרוזים μl עבור assay ואחריו המערבי סופג, ו -200 חרוזים μl עבור assay ואחריו MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעם על ידי גלולה חרוז השעיית מחדש עם 1 מ&quot;ל של W &amp; B 1x המומלץ על ידי היצרן (כריכה, כביסה) חיץ (לוח 3), ואחריו סיבוב הצינור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ב הכתף. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשבית RNase על חרוזים, לשטוף חרוזים פעמים, בכל פעם מחדש על ידי השעיית גלולה חרוז עם 400 μl חיץ א הצפה הוא פתרון אלקליין המכיל 0.1 M NaOH ו 0.05 M NaCl (לוח 3). סובב את הצינור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ב הכתף. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז. </li> &lt;li&gt; כדי להסיר NaOH אמנות עשויים חרוזים, לשטוף חרוזים פעמיים, בכל פעם על ידי גלולה חרוז השעיית מחדש עם 400 B חיץ μl (לוח 3), ואחריו סיבוב הצינור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ב הכתף. supernatant מחק. שמור גלולת חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוז גלולה עם 300 μl 2x W &amp; B חיץ, חרוזים להתחלק שווה בשווה ולהעביר לשלושה צינורות 1.5 מ&quot;ל (100 חרוזים μl לכל צינור). לספק את צינורות המכילים חרוז עם 100 μl מים חינם RNase, 100 μl biotinylated RNA FL ו 100 μl biotinylated AR 3&#39;UTR RNA, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תערובת חרוזה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר עם סיבוב. מניחים צינורות על מגנט דקות 1. מחק את כל supernatant. שמור כדורי חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים לשטוף חרוזים, בכל פעם מחדש על ידי השעיית כל גלולה חרוז עם 400 μl 1x W &amp; B חיץ, ואחריו סיבוב צינורות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות על מגנט דקות 1. מחק את כל supernatant. Resuspend כל Pelle חרוזt עם 50 חיץ בידוד גרעיני μl (לוח 3). </li></ol> 3. בידוד Preadipocyte ו Adipogenesis אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שתואר בפרסומים קודמים 5, לנתח preadipocytes מפנקס שומן חום interscapular (עכברי סוג בר C57BL6, 3 שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול במבחנה להבדיל בין preadipocytes 5. התאים מוכנים יישום במורד הזרם 4-5 ימים לאחר תחילת בידול. </li></ol> 4. הכנה הסלולרית Lysate מ adipocytes הראשי הערה: ודא כי כל הנהלים של הכנת lysate התא נעשית על קרח, וכל המאגרים קפואים על קרח. homogenizers זכוכית dounce טרום צמרמורת על הקרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ולבדל preadipocytes ב 15 מנות ס&quot;מ 5 (ראה סעיף 3.2). כל מנה מספקת תאי נאות עבור assay הנפתח RNA אחד. ביום 4 או 5 ימים של בידול, תרבית תאים בינוניים שנזרקו, ולשטוף ceLLS פעם עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור תאים, להוסיף 10-15 מ&quot;ל 1x PBS לתאים, לגרד לאסוף תאים צינור 50 מ&quot;ל, ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב RT. בטל supernatant באמצעות פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תא גלול ב 2 מיליליטר חיץ hypotonic (לוח 3), ו דגירת תאים על קרח במשך 15 דקות. העברת התאים homogenizer זכוכית 15 מ&quot;ל dounce, ותאי גזירה מכנית על קרח עם 20 משיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גרעיני תאים על ידי צנטריפוגה ב 3,300 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. שמור גלולה גרעינים על קרח לשימוש נוסף (ראה סעיף 4.6). העברת supernatant צינורות 1.5 מ&quot;ל, להוסיף 3M KCl כדי supernatant כדי לקבל ריכוז סופי של 150 מ&quot;מ, ו ספין על 20,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר בזהירות lipidlayeron לפסגה באמצעות 1 מ&quot;ל פיפטה, ולאסוף supernatant כמו lysate הסלולר cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה גרעינים (ראה סעיף 4.4) ב 1 מ&quot;ל חיץ בידוד גרעיני. Tגרעיני ransfer על homogenizer זכוכית 15 מיליליטר dounce באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, גרעיני גזירה על קרח מכאני עם 100 חבטות. גלולת פסולת גרעינית על ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולאסוף supernatant כמו lysate הסלולר הגרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או לשלב את lysates הסלולרי הגרעיני cytoplasmic, או להשתמש בכל חלק בנפרד, עבור יישום הנפתח במורד זרם. בניסוי בהדגמה זו, שברים אלה שני של lysate התא אוחדו ביחס נפח של 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מעכב RNase כדי lysate התא unfractionated זה כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 U / μl. מניחים בצד 100 μl של lysate התא כשליטה קלט במשך 15 המערבי סופג. </li></ol> 5. עקידת Elution של RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysate תא פיצול לשלוש aliquots שווה (lysate תא 1ml בצינור 1.5 מ&quot;ל), ו דגירה עם ריק, FL RNA מצומדות ו AR 3&#39;UTR RNA מצומדות חרוזים (ראה סעיף 2.8), בהתאמה, עבור 3 שעות ב 4 ° Cעם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות על מגנט דקות 1. איסוף supernatant בעזרת פיפטה 1 מ&quot;ל, ואחריו בידוד RNA מן supernatant כדי לאשר integrality RNA. לבודד RNA באמצעות פתרון thiocyanate-פנול guanidinium החומצה הבא הוראות היצרן (טבלה 2). להעריך את תקינות RNA באמצעות ניתוח יחידות משנת 28S ו 18S של רנ&quot;א ריבוזומלי. שמור כדורי חרוז על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים מגנטי שש פעמים, בכל פעם על ידי resuspending כל גלולה חרוז עם חיץ בידוד גרעיני 1 מ&quot;ל המכיל 40 U RNase מעכב ו -0.25% IGEPAL, ואחריו סיבוב צינורות למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר הכתף. השתמש לעמוד מגנטי להפרדה של חרוזים מגנטיים supernatant. מחק את כל supernatant. שמור כדורי חרוז על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשלבים הבאים כדי elute מתחמי RNA חלבון מן חרוזים עבור המערבי סופג. ראשית, resuspend כל גלולה חרוז 75 חיץ בידוד גרעיני μl; אז, להוסיף 25 buf טעינת כתם המערבי 4x μlfer (המכיל SDS) כדי להשיג בנפח כולל של 100 μl. לבסוף, להרתיח חרוזים בתמיסה 100 μl זה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הערה: השתמשו ביצוע שלבים כדי elute מתחמי RNA חלבון מן החרוזים עבור MS. Step1: resuspend כל גלולה חרוז 100 חיץ elution μl (טבלה 3); Step2: דגירת דגימות חרוזות במשך 2-3 שעות בטמפרטורת חדר עם סיבוב; שלב 3: צנטריפוגה ולאסוף supernatant חלבון המכיל; Step4: להתרכז פתרונות חלבון 20-30 μl לפני ההגשה עבור MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל 100 μl של מדגם חרוז ב XG 12,000 למשך 30 שניות ב 4 ° C, ולאסוף supernatant. Aliquot 15 supernatant μl לניתוח כתם המערבי (ראה סעיף 6.1 ו -6.2). לחקור את הקרום המתקבל עם נוגדן חד שבטי בדילול חור העכבר (1: 1,000 דילול), לילה. </li></ol> 6. המערבי סופג עבור אימות של RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBPs נפרדת על ידי SDS-PAGE באמצעות טכניקות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל לנוסופג שטרן באמצעות טכניקות סטנדרטיות על ידי חיטוט עבור RBPs הקשורים RNA של עניין. הערה: בניסוי בהדגמה זו, חד שבטי עכבר חור נוגדן שמש את immunodetection של חלבון חור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הממברנה המתקבלים עם נוגדן החור המדולל (1: 1,000 דילול) ב 5% w / חלב יבש נ שומן, 1x TBS, 0.1% Tween - 20 ב 4 ° C עם רעד עדין, לילה. לשטוף שלוש פעמים הממברנה עם 1x TBST. דגירה הממברנה עם נוגדן המשני (עז נגד העכבר IgG-HRP) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. הממברנה לשטוף. לפתח אות שיא. </li></ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973(2013).</li>
<li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li>
<li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HADHB%2C+HuR%2C+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li>
<li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+binding+of+HuR+and+poly%28C%29-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3%C2%B4+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li>
<li>König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-RNA+interactions%3A+new+genomic+technologies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li>
<li>Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein-lncRNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li>
<li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יש lncRNAs ו RBPs תפקידים חיוניים בבריאות ובחולי, אולם המנגנונים המולקולריים של מולקולות אלה הם הבינו היטב. זיהוי של חלבוני אינטראקציה עם מולקולות lncRNA הוא צעד מפתח לקראת הבהרת מנגנוני הוויסות. העשרת RBPs ידי מערכת assay הנפתח RNA מבוססת על ב-פתרון לכיד של אינטראקציה מורכבת כך חלבונים מן lysate תא ניתן לחלץ סלקטיבי באמצעות פיתיונות RNA biotinylated חייבים חרוזים מגנטיים streptavidin. כמה שיטות אחרות כגון הצרצור, צ&#39;ארט RAP יכולות להשיג את אותה המטרה, אולם שיטות אלו לוקחות יות...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs הם חלבונים אשר נקלטות על ידי RNA גדילי כפול או יחיד בתאים ולהשתתף ביצירת קומפלקסים-חלבון RNA. RBPs עלול להיקשר מגוון מיני RNA, כולל ה- mRNA ו RNAs noncoding הארוך (lncRNAs) ובין השאר השפיעו ברמות שלאחר התעתיק. RBPs ו lncRNAs שניהם מתעוררים רגולטורי רומן כפי בפיתוח שומן ולתפקד 1,2,3. כדי להבין את המנגנון של RBP- ורגולציה בתיווך lncRNA של מסלולים הסלולר, זה לעתים קרובות יש צורך לזהות את האינטראקציה בין מולקולת RNA ספציפי אחד או כמה RBPs, ו, לפעמים, לזהות את מלוא הספקטרום של שותפים חלבון של RNA תמליל. עם זאת, הניסוי יכול להיות מאתגר בשל התכולה הגבוהה של שומני adipocytes. פרוטוקול RNA הנפתח המתואר כאן יכול להיות מועסק על מנת לאחזר שותפי החלבון של RNA מסוים מן lysates adipocyte של תרבויות העיקריות 4,5. הרציונל פרוטו זהcol מסוכמת כדלקמן. פיתיון RNA הוא במבחנה עבדה מתבנית DNA, ביוטין שכותרתו מצומדות כדי חרוזים מגנטיים צופה streptavidin 4. הפיתיון RNA הוא מודגרות עם lysates הסלולר כדי לאפשר היווצרות של מתחמי RNA חלבון, אשר לאחר מכן הם משכו מטה על מעמד מגנטי. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול הנפתח RNA המתואר להלן להשתמש שבר RNA מן AR 3&#39;UTR כפיתיון כדי לאחזר חלבון חור, RBP כבול הביע אוניברסלי 3&#39;UTR של תעתיקי 6,7, מ theadipocytelysate של התרבות העיקרי. כדי לבדוק את הספציפיות מחייב של assay זה, שאינו רלוונטי RNAas גם חרוזים streptavidin ריק כלול כמו שליטה. פרוטוקול זה תואם מערבי סופג או ספקטרומטריית מסה (MS) כדי לאשר את לכידתו של RBP ספציפי או לזהות את הרפרטואר המלא של RBPs שנתפס, בהתאמה 8. טכניקות קיימות מספר לחקור את האינטראקציה RNA חלבוןים. כדי לחשוף RNAs כבול נתון RBP, RIP (immunoprecipitation RNA) CLIP (crosslinking UV ו immunoprecipitation) יכול להיות מיושם. לעומת זאת, לזהות שותפי חלבון של RNA נתון, נפתח RNA, צרצור (בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA), תרשים (ניתוח כלת לכידתו של מטרות RNA) RAP (טיהור antisense RNA) יכול להיות מיושם. לשם השוואה עם אלה מאוחר יותר, טכניקה נפתחת RNA לוקחת פחות מאמצת להקים. זה יכול להיות מועסק על מנת ללכוד חלבונים במבחנה ובחי. הגישה vivo של RNA הנפתח, אשר מבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר עמיתו במבחנה שלה, שומרת אינטראקציות חלבון RNA על ידי crosslinking בתאים, לוכדת RNAs מתויג aptamer עניין מתאי, ולאחר מכן מזהה RBPs כבול. RNA הנפתח ניתן להשתמש כדי להעשיר RBPs בשפע נמוך, וכדי לבודד ולזהות את המתחמים-חלבון RNA שיש תפקידים פונקציונליים מגוונים בשליטת רגולציה הסלולר 9,10 </sעד&gt;.

<table><tbody><tr><td><חומרים חזקים>עיקריים ששימשו במחקר זה.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת MEGAscript</td><td>&nbsp; אמביון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-14-CTP&nbsp;</td>טורי ספין <td>של Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway&nbsp;</td><td>אמביון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&nbsp;</td>נוגדן חד שבטי <td>לעכבר Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) (sc-5261)&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG-HRP (sc-2005)&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure ביולוגיה מולקולרית כיתה מים (ללא נוקלאז)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט בופר מלח (1& פעמים; PBS)</td><td>&nbsp; מעכב HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase&nbsp;</td>מעכב <td>פרוטאז ביוליין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu טורבו DNA פולימראז&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טרישור</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>ציוד עיקרי ששימש במחקר זה.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R צנטריפוגה&nbsp;</td>צנטריפוגה <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 מחזור תרמי&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ננו-דרופ 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO מסובב Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורזה של ג'ל חלבון ומנגנון ספיגה&nbsp;</td><td>מגנט Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2&nbsp;</td><td>טכנולוגיות</td><td></td><td></td> חיים</tr></tbody></table>

זיהוי של חלבונים קושרי rna על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; rna הנפתח ב adipocyte תרבות

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

חלבוני קושרי RNA (RBPs) הם מתעוררים כשכבה רגולטורית ההתפתחות והתפקוד של שומן. RBPs לשחק תפקיד מפתח בוויסות ביטוי גנים ברמות posttranscriptional ידי המשפיע על יעילות יציבות translational של mRNAs היעד. טכניקה הנפתח RNA כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה RNA חלבון, אשר יש צורך להבהיר את המנגנון שבבסיס RBPs &#39;וכן RNAs ללא קידוד ארוך &quot;(lncRNAs) פונקציה. עם זאת, שפע השומנים הגבוה ב adipocytes מציב אתגר טכני בביצוע הניסוי הזה. הנה פרוטוקול נפתח RNA מפורט מותאם לתרבות adipocyte העיקרית. מקטע RNA מן של קולטן האנדרוגן (AR) 3 &#39;באזור מתורגמים (3&#39;UTR) המכיל elementwas adenylate-uridylate עשירי כדוגמא כדי להדגים כיצד לאחזר שותף RBP שלה, חלבון חור, מן lystate adipocyte. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי לזהות את יחסי הגומלין ביןRBPs ו RNAs noncoding, כמו גם בין RBPs ו RNAs קידוד.

בניסוי בהדגמה זו, מקטע AR RNA שימש כפיתיון כדי ללכוד חלבון מחייב שלה חור. שניהם הפיתיון RNA FL כי הוא בלתי רלוונטי חלבון חור ואת aliquot של חרוזים streptavidin ריק unconjugated שימש בקרות שליליות. אינטראקציות RNA חלבון יכולות להתרחש גם בגרעין או בציטופלסמה, ופרוטוקול נפתח זה יכול להיות מיושם גם הכולל או מופרד (גרעיני או cytoplasmic) lysates תא. ניתוח של חלבונים על ידי מערבי סופג מראה כי במדגם של 15 lysate תא unfractionated μl (ראה סעיף 4.8), כמו לא...

פרוטוקול RNA הנפתח הוא מותאם כאן לגילוי של אינטראקציות בין חלבונים קושרי RNA (RBPs) ו noncoding וכן RNAs קידוד. מקטע RNA מן לקולטן האנדרוגן (AR) שימש כדוגמה כדי להדגים כיצד לאחזר RBP שלה lystate של adipocytes חום ראשוני.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבודד חלבונים נקשרי-RNA של תמלול RNA מרקמה שומנית חומה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום זה, כגון, מהם מנגנוני הבקרה של RNA מקודד ארוך-חיים והחלבונים הקשורים ל-RNA. היתרון המרכזי של טקטיקה זו הוא שהיא קלה לביצוע.ה-RNA המשמש להדגמת פרוצדורה זו הוא מקטע מהאזור הבלתי מתורגם של הקצה ' (3-Prime Untranslated Region) של קולטן האנטיגן, אשר יכונה להלן AR 3-Prime UTR. התחל בהגברה של ה-T7 AR oligo ושל הרצף החלקי של ה-DNA של לוציפרז גחליליים מתוך פלסמיד psiCHECK-2. הפריימרים והפרמטרים שבהם נעשה שימוש מפורטים במסמך הנלווה.לאחר ההגברה, השתמש בתוצרי ה-PCR כתבניות לסנתזה של RNAs מביוטין באמצעות ערכה לתעתוק in vitro, בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הדגר את התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות. לאחר התעתוק in vitro, הוסף 1 µL של Dnase לתגובה והדגר אותה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות כדי לפרק את ה-DNA המשמש כתבנית.לאחר מכן, הגדילו את הנפח הכולל ל-60 µL באמצעות מים. יישמו את ה-RNAs הביוטיניליים על עמודי טיהור כדי להסיר את המלח ואת הנוקלאוטידים שאינם מאוחדים. לאחר מכן, לאחר מדידת ריכוז ה-RNA, אחסנו את ה-RNase בטמפרטורה של 80- °C עבור בדיקות pull-down עתידיות.ביום הבדיקה, הפסיקו את הקפאת ה-RNA הביוטינילי על קרח. לאחר מכן, כדי להבטיח של-RNA המבוקש יהי

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

למדו פרוטוקול RNA pull-down לזיהוי חלבונים קושרי RNA בחומן חום. השיטה משתמשת ב-AR 3-Prime UTR כדי לאחזר RBPs מלייזט של adipocytes חומים.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי

גלה סרטונים נוספים