שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

המטרה הכללית של שיטה זו היא לפתח גישה מפושטת לבידוד מהיר של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL) מופרדים מפלזמה של דם אנושי לצורך אנליזה של micro RNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ההפטולוגיה והקרדיולוגיה, כגון הבנת המנגנוסים המולקולריים והתפקודים המגנים של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה. כמה מהיתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם ש-micro RNA מ-HDL מופרד מתקבל כשהוא כבר מבודד, מנפח דגימות קטן ובפרק זמן קצר.

בפרוטוקול זה, פלזמה מופקת מדגימות דם ורידיות פריפריות של נבדקים בצום באמצעות מספר שלבי צנטריפוגה, כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול. העבירו את הפלזמה למבחנה חדשה. מדדו את צפיפות הפלזמה באמצעות דנסיטומטר בטמפרטורת החדר, בהתאם להוראות היצרן.

כדי להסיר את האקסוזומים במחזור הדם המהווים מקור לזיהום של micro RNA, הוסיפו 252 µL של תמיסת שקיעה לאקסוזומים ל-1 mL של פלזמה. הדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סובבו את התערובת בצנטריפוגה למשך 30 דקות כדי לשקיע את האקסוזומים.

העבירו 1 mL מהעלייה שנוצרה למבחנה של אולטרסנטריפוגה בעלת דופן עבה מפוליקרבונט לעיבוד המשך, כפי שמוצג בסגמנט הווידאו הבא. בידוד של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה, או HDL, מבוצע באמצעות פרוטוקול אולטרסנטריפוגציה במדרג צפיפות בשלושה שלבים, הכולל בידוד רצופי של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד, או VLDL, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, או LDL, ו-HDL. יש להכין את שלושת תמיסות הצפיפות השונות, A, B ו-C, באופן טרי, בהתאם לנוהל המתואר בטקסט הפרוטוקול.

בתוך מבחנה לאולטרסנטריפוגה בעלת דפנות עבות עשויה פוליקרבונט בנפח 6.5 milliliter, ערבב מיליליטר אחד של פלסמה ו-200 microliters של Fat Red 7B נקי מנוקלאז. לאחר מכן, שכבד בזהירות חמישה מיליליטרים של תמיסה A מעל התערובת. במידת הצורך, הוסף Fat Red 7B נוסף מעל תמיסה A כדי לאזן את המשקל של כל מבחנה.

העבירו את המבחנות לרוטור שקולל מראש. הניחו את הרוטור בצנטריפוגת רצפה וסבבו במשך שעתיים. בסיום התהליך, שניים שכבות צריכות להיות גלויות.

הסיר 1.5 milliliters מהשכבה העליונה, המייצגת את פראקציית ה-VLDL, ואחסן אותה בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. השתמש בפ pipette כדי להעביר ארבעה milliliters מהחלק התחתון של המבחנה למבחנה חדשה בנפח של 50 milliliters.

חלק זה מכיל את הפרקציות של LDL ו-HDL. השלב הבא הוא בידוד ה-LDL. ערבבו שני מיליליטרים של תמיסה B ו-100 מיקרוליטרים של Fat Red 7B נטול נוקלאז לתוך המבחנה המכילה את פרקציית ה-LDL וה-HDL.

הניחו על קרח למשך חמש עד עשר דקות. העבירו 6.5 milliliters של הדגימה המעורבבת לתוך מבחנת אולטרה-צנטריפוגה בעלת דפנות עבות מפוליקרבונט. הכניסו את המבחנה לתוך רוטור שהקרירו מראש וסובבו בצנטריפוגה למשך שלוש שעות.

עם סיום הסנטריפוגציה, הסירו 1.5 milliliters מהשכבה העליונה, המייצגת את פראקציית ה-LDL, ושמרו אותה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. העבירו ארבעה milliliters מהחלק התחתון של המבחנה, המכילים את פראקציית ה-HDL, למבחנה סטרילית של 50 milliliters. השלב השלישי הוא בידוד ה-HDL.

ערבבו שני מיליליטרים של תמיסה C, 100 מיקרוליטרים של Fat Red 7B ללא נוקלאז, ו-15 מיקרוליטרים של 98% beta mercaptoethanol לתוך המבחנה המכילה את פראקציית ה-HDL. בדקו את צפיפות התערובת. העמיסו את המבחנה לתוך רוטור שקולל מראש וסובבו בצנטריפוגה למשך שלוש שעות.

לאחר מכן, הסירו שני מיליליטרים מהשכבה העליונה, המייצגת את פראקציית ה-HDL, ושמרו אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר עודפי מלח מפראקציות הליפופרוטאין כדי למנוע הפרעה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-PCR בהמשך. בסרטון זה, יוצגו תהליכי הסמכת המלח (desalting) והריכוז עבור פראקציית ה-HDL בלבד.

הוסיפו 13 milliliters של PBS קר לשבר ה-HDL והעבירו למכשיר סינון צנטריפוגי עם סף חיתוך של משקל מולקולרי של 10K. סבבו בצנטריפוגה עם רוטור מסוג swinging bucket, במהירות של 4000 times g, ובטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius, למשך 30 דקות. בצעו הסמכה (Desalt) של שבר ה-HDL פעם שנייה, באמצעות 13 milliliters של PBS קר, תוך סבב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן.

לאחר הצנטריפוגציה, יש להוציא את הממסים המכילים ליפופרוטאינים ולשמורם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להעריך את האיכות והטוהר של הליפופרוטאינים המבודדים, בוצעו אלקטרופורזה על ג'ל אגרוזה עם סטנדרטים של ליפופרוטאינים אנושיים, ששימשו כייחוס לגודל. תוצאות מייצגות מבידוד אחד, ללא beta mercaptoethanol, הראו כי פראקציית ה-HDL נקייה מזיהום של VLDL ומציגה ניידות אלפא טיפוסית.

עם זאת, פראקציית ה-HDL מראה גם עקבות של ניידות בטא עקב זיהום בליפופרוטאינים. הוספת beta mercaptoethanol לתמיסה C, במהלך שלב הצנטריפוגציה האחרון, מסירה ביעילות את כל הליפופרוטאינים המזהמים מפראקציית ה-HDL. כדי להוכיח את ההיתכנות של כימות micro RNAs, הנשאים ב-HDL אנושי שזוהרו בשיטה זו, שני micro RNAs שונים הועשרו באמצעות real-time quantitative PCR.

בגרפים של הגברה אלו, הקווים האופקיים מייצגים את סף הגילוי. נתוני real-time PCR מייצגים מ-HDL מבודד, שהתקבלו משישה דגימות, הראו גילוי עקבי של שני ה-micro RNAs. לבסוף, ניתוחי עקומות המסה מראים בבירור שיא בודד ומובחן עבור שני ה-micro RNAs, דבר התואם הגברה ספציפית ב-PCR שבוצע קודם לכן.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשלים אותה תוך תשע שעות, כולל הליכי הסרת המלחים, במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לעבוד בטמפרטורה של 4°C עד 8°C בכל עת, ולהתאים את הצפיפות של כל פראקציית ליפופרוטאין לפני העיפרו-צנטריפוגציה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, כדי להשיב על שאלות נוספות, כמו טהרת ה-HDL. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום התסמונית המטבולית לבחון micro RNAs הקשורים ל-HDL כסממנים ביולוגיים בבני אדם עם חשד למחלת כבד שומני. היא עשויה לשמש גם להבנה טובה יותר של תפקוד ה-HDL ושל המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם הוא משנה את הביולוגיה התאית.