שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לפתח גישה פשוטה לבידוד מהיר של ליפופרוטאינים מטוהרים בצפיפות גבוהה מפלזמת הדם האנושית לצורך ניתוח מיקרו RNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהפטולוגיה וקרדיולוגיה, כגון הבנת המנגנונים המולקולריים ותפקודי ההגנה של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה. כמה יתרונות עיקריים של טכניקה זו הם שמיקרו RNA HDL מטוהר מגיע מבודד מראש מנפח קטן יותר של דגימות תוך פרק זמן קצר.

בפרוטוקול זה, פלזמה מתקבלת מדגימות דם ורידיות היקפיות בצום על ידי שלבי צנטריפוגה מרובים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. העבירו את הפלזמה לצינור חדש. ולמדוד את צפיפות הפלזמה באמצעות מד צפיפות בטמפרטורת החדר, לפי הוראות היצרן.

כדי להסיר את האקסוזומים המסתובבים המייצגים מקור לזיהום מיקרו RNA, הוסף 252 מיקרוליטר של תמיסת משקעים אקסוזומים למיליליטר אחד של פלזמה. ולדגור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת למשך 30 דקות כדי להוציא את האקסוזומים.

העבירו מיליליטר אחד של הסופרנטנט שנוצר לצינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט להמשך עיבוד, כפי שמודגם בקטע הווידיאו הבא. בידוד של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה, או HDL, מושג על ידי פרוטוקול אולטרה-צנטריפוגה בצפיפות שיפוע של שלושה שלבים, הכולל בידוד רציף של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד, או VLDL, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, או LDL, ו-HDL. יש להכין את שלושת פתרונות הצפיפות השונים, A, B ו-C, טריים, בהתאם להליך המתואר בטקסט הפרוטוקול.

בצינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט בנפח 6.5 מיליליטר, מערבבים מיליליטר פלזמה ו-200 מיקרוליטר שומן אדום 7B נטול נוקלאז. לאחר מכן, שכבו בזהירות חמישה מיליליטר של תמיסה A על גבי התערובת. במידת הצורך, הוסיפו עוד Fat Red 7B על גבי תמיסה A כדי לאזן את המשקל של כל צינור.

טען את הצינורות לרוטור מקורר מראש. הכניסו את הרוטור לצנטריפוגה רצפתית וצנטריפוגה למשך שעתיים. בסוף הריצה, שתי שכבות צריכות להיות גלויות.

הסר 1.5 מיליליטר מהשכבה העליונה, המייצגת את שבר ה- VLDL. ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה כדי להעביר ארבעה מיליליטר מתחתית הצינור לצינור חדש של 50 מיליליטר.

זה מכיל את שבר ה-LDL וה-HDL. השלב הבא הוא בידוד ה-LDL. מערבבים שני מיליליטר של תמיסה B ו-100 מיקרוליטר שומן אדום 7B נטול נוקלאז לתוך הצינור המכיל את מקטע ה-LDL וה-HDL.

שים קרח למשך חמש עד עשר דקות. העבירו 6.5 מיליליטר מהדגימה המעורבת לצינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט. טען את הצינור לרוטור וצנטריפוגה מקוררים מראש למשך שלוש שעות.

בסיום הצנטריפוגה, הסר 1.5 מיליליטר מהשכבה העליונה, המייצגת את שבר ה- LDL ושמור על ארבע מעלות צלזיוס. העבירו ארבעה מיליליטר מתחתית הצינור, המכילים את שבר ה- HDL לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. השלב השלישי הוא בידוד HDL.

מערבבים שני מיליליטר של תמיסה C, 100 מיקרוליטר שומן אדום 7B נטול נוקלאז, ו-15 מיקרוליטר של 98% מרקפטואתנול בטא לתוך הצינור, המכיל את חלק ה-HDL. בדוק את צפיפות התערובת. טען את הצינור לרוטור וצנטריפוגה מקוררים מראש למשך שלוש שעות.

לאחר מכן, הסר שני מיליליטר מהשכבה העליונה, המייצגת את שבר ה- HDL, ושמור על ארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר עודף מלח משברי הליפופרוטאין כדי למנוע הפרעה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-PCR לאחר מכן. בסרטון זה יודגמו התפלה וריכוז רק עבור חלק ה-HDL.

הוסף 13 מיליליטר PBS קר לשבר ה-HDL והעביר למכשיר מסנן צנטריפוגלי עם חיתוך המשקל המולקולרי של 10K. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד, ב-4000 פעמים גרם, וארבע מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות. יש להמליח את שבר ה- HDL, בפעם השנייה, באמצעות 13 מיליליטר PBS קר, וצנטריפוגה כמו קודם.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הליפופרוטאין המכיל מומסים, ושמור על ארבע מעלות צלזיוס. כדי להעריך את האיכות והטוהר של הליפופרוטאינים המבודדים, בוצעה אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עם תקני ליפופרוטאין אנושיים, הכלולים כהתייחסות לגודל. תוצאות מייצגות מבידוד, ללא בטא מרקפטואתנול, הראו כי מקטע ה-HDL נטול כל זיהום של VLDL ומציג ניידות אלפא טיפוסית.

עם זאת, חלק ה-HDL מראה גם עקבות של ניידות בטא עקב זיהום בליפופרוטאינים. תוספת של בטא מרקפטואתנול לתמיסה C, במהלך שלב הצנטריפוגה האחרון, מסירה למעשה את כל הליפופרוטאינים המזהמים מחלק ה- HDL. כדי להדגים את ההיתכנות של כימות מיקרו RNAs, הנישאים ב-HDL אנושי, מטוהרים בשיטה זו, שני מיקרו-RNA שונים הוגברו על ידי PCR כמותי בזמן אמת.

בעלילות הגברה אלה, הקווים האופקיים מייצגים את סף הזיהוי. נתוני PCR מייצגים בזמן אמת מ-HDL מבודד, שהתקבלו משש דגימות, הראו זיהוי עקבי של שני המיקרו-RNAs. לבסוף, ניתוחי עקומת ההיתוך מראים בבירור שיא יחיד מובהק עבור שני המיקרו-RNA, התואם את ההגברה הספציפית ב-PCR הקודם.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך תשע שעות, יחד עם הליכי ההתפלה, אם היא נעשית כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעבוד בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס, בכל עת. ולהתאים את הצפיפות של כל שבר ליפופרוטאין לפני אולטרה-צנטריפוגה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו טוהר ה-HDL. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תאפשר לחוקרים, בתחום התסמונת המטבולית, לחקור מיקרו RNA הקשורים ל-HDL כסמנים ביולוגיים, בבני אדם עם חשד למחלת כבד שומני. זה עשוי לשמש גם כדי להבין טוב יותר את תפקודו של HDL ואת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם הוא משנה את הביולוגיה של התא.