Name: חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי גידול אנושיים מ-xenografts בעכברים באמצעות מיון תאים מגנטי. טכניקה זו מסירה תאי עכבר מזהמים ומשפרת משמעותית את איכות הניתוח הגנטי במורד הזרם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו אסירי תודה לג'נינה קוהל, נדין צ'ליוס, פטרה קוסמן, לנה וילנו ודורותי לנארד על הסיוע הטכני המצוין.

<ol><li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).</li>
<li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci Rep. 3, 3494(2013).</li>
<li>Sausville, E. A., Burger, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+human+tumor+xenografts+to+anticancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.</a> Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).</li>
<li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+of+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+pre-clinical+model+to+evaluate+adjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).</li>
<li>Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+models+for+cancer+research%3A+human+cancer+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).</li>
<li>Gires, O., Stoecklein, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+EpCAM+expression+on+circulating+and+disseminating+tumor+cells%3A+causes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).</li>
<li>Zhang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+the+gamma-secretase+inhibitor+PF-03084014+and+docetaxel+in+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).</li>
<li>Boven, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+preclinical+drug+screening+in+human+tumor+xenografts%3A+a+first+European+multicenter+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study.</a> Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).</li>
<li>Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgorku%2C+D+%22Depletion+of+mouse+cells+from+human+tumor+xenografts+significantly+reduces+bias+in+molecular+analysis+and+improves+culture+of+target+cells.+Abstract+95%22">Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95</a>. , AACR. (2014).</li>
<li>Agorku, D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgorku%2C+D+%22Next-generation+sequencing+of+human+tumor+xenografts+is+significantly+improved+by+prior+depletion+of+mouse+cells.+Abstract+1455%22">Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455</a>. , AACR. (2015).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+VarScan+2+for+Germline+Variant+Calling+and+Somatic+Mutation+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Aloia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sialyl-glycolipid+stage-specific+embryonic+antigen+4+marks+a+subpopulation+of+chemotherapy-resistant+breast+cancer+cells+with+mesenchymal+features%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features.</a> Breast Cancer Res. 17 (1), 146(2015).</li>
</ol>

דיוויד אגורקו, סטפן טומיוק, סטפן ויילד, סילביה רוברג, ליסה זטריב, אנדראס בוסיו ואולף הארדט הם או היו עובדים של Miltenyi Biotec GmbH, גרמניה. קרסטין קלינגנר וג'וליה שילר הן עובדות של Oncotest GmbH, גרמניה.

פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטיות מיון תא מגנטי. מלבד דלדול של כל התאים בעכבר גם את כמות תאים מתים ופסולת מצטמצם משמעותית בשבריר תא המטרה. יחדיו, שיטה זו משפרת ניתוחים במורד מולקולריים משמעותית וטיפוח התאים סרטניים אנושיים. בניגוד לשיטות חלופיות, אין צורך בידע של סמנים ספציפיים תאים סרטניים, התאמה שונה קומפוזיציות של תאי עכבר או הקמת אלגוריתמים. השיטה המוצגת היא עצמאית של זן העכבר וסוג הגידול. לכן, הטיה דרך בידוד של תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם על בסיס סמנים ספציפיים אנושיים אחת אשר עשוי להשתנות ביטוי, כפי שמוצג על EpCAM 11, היא להימנעed. יתר על כן, זה אינו מוגבל לחומר גידול אך יכול לשמש לכל סוג של רקמת xenotransplanted כתאי עכבר ממוקדים במקום תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם ספציפיים (מידע לא מוצג). הסרה מקיפה של תאי עכבר היא הקלה על ידי מיקוד אפיטופים שטח לידי ביטוי אך ורק על תאים ממוצא עכבר. מלבד השיטה המבוססת היטב עבור דיסוציאציה גידול כפי שהוצג במחקר זה, קיימים נהלים רבים באמצעות סוגים שונים של אנזימים. שימור אפיטופים פני התא הוא תנאי הכרחי שיטה חדשנית זו, אלא גם עבור ניתוחים מדויקים של אוכלוסיות תאים סרטניים אנושיות. לכן, חשוב כי אנזימים עדינים משמשים לעיכול של רקמת גידול. לפיכך, דלדול תא עכבר ניתן להשתמש רק בשילוב עם נהלי עיכול אנזימטי שכנראה אינו משפיעים אפיטופים ממוקדים במהלך הליך שחסך בתאי עכבר. במקרה של ספק זה ניתן לאמת רק על ידי היצרן, בהתאמה. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; שיטה זו עובדת גם עבור תאים סרטניים אנושיים במחזור (CTCs). עם זאת, כמו תדרים של תאי היעד הם בדרך כלל &lt;0.1% סרים של תאי עכבר בנוסף דורש תמוגה תא דם אדום purities של יותר מ -50% לא ניתן לצפות. במקרה זה, דלדול תא העכבר יכול לשמש להעשרת מראש של CTCs ואחריו העשרה באמצעות סמנים חיוביים (מידע לא מוצג). הסרת תאי עכבר משפרת באופן משמעותי את התרבות של תאים סרטניים אנושיים על ידי הימנעות לגדול תרבות של פיברובלסטים עכבר. בנוסף, הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי הרצף של הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי טופל. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר רצף ספציפי אדם ממוקד בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט. יתר על כן, השיטה המוצגת מקלה ACCURAמחקרים מולקולריים te של תת-אוכלוסיות גידול בתוך גידולים אנושיים xenotransplanted. הסרת תאי עכבר ממדגם בהתאמה בשלב הראשון ולאחר מכן מיון תאים סרטניים אנושיים בשתי תת-אוכלוסיות שונות מאפשרת השוואה מולקולרית ישירה של תת-אוכלוסיית הגידול מעניין תאים סרטניים בתפזורת אדם 20. ביטוי גנים דיפרנציאלי בין תת תא גידול ניתן להעריך בצורה מהימנה יותר כפי שהוא אינו מושפע הכלאה צולבת של מולקולות נגזרות עכבר.

גידולים אנושיים מוצקים מורכבים פיסיולוגי רב כמו גם סוגי תאי ממאירה. הם יוצרים רקמות הטרוגנית עם מבנים ביולוגיים מורכבים. תהליכים ביולוגיים כמו הגידול היווצרות, התקדמות ותגובות כלפי טיפולים עדיין אינם מובנים במלואם. מודלים תרבית תאים במבחנה ב מייצגים כלי שימושי ללמוד ולהבין ביולוגיה הגידול. עם זאת, הם יכולים רק חלקית לשקף מבנים ותהליכים נמצאים ברקמות גידול. במודלים פרה אמינים ויציבים של גידולים בבני אדם הם תנאים הכרחיים לפיתוח תרופות אנטי גידול וטיפולי 4,6 וכן להבנת ביולוגית גידול ואת האינטראקציה של תאים סרטניים לבין סביבתם. מודלים אנושיים xenograft גידול שמקורם בגידולים מטופלים עיקריים להראות יחסים גבוהים לרקמות ממוצא לגבי אדריכלות היסטולוגית, אינטראקציות עם מבנים מיקרו-סביבה, פוטנציאל גרורתי ותגובות לתרופות 7 </sup&gt;. גם כאשר xenografts גידול נגזר תאים בתרבית או שורות תאים הוא לחקות באופן הדוק יותר גידולים חולים, ולכן מראת תוקף גבוה ברוב המבחנים לעומת דגמי תרבית תאים במבחנה. תכונות אלו הופכות אותם תקן הזהב של במודלים פרה 4. מלבד היישום שלה בחקר הסרטן, השתלה שלא מבן-מינו של תאים אנושיים בעכברים גם משמש לעתים קרובות במחקר תאי גזע כדי לקבוע את פוטנציאל stemness והבחנה של אוכלוסיית היעד 8. הוכח כי microvasculature האדם ותאי חיסון אנושיים מוחלפים על התפשטות in vivo של גידולים אנושיים 2,9. גורמים כגון תת סוג הגידול, קצב צמיחה, ואת האזור של השתלה יש השפעות משמעותיות על ברמה הגלובלית של חדירה וכן בהרכב סוגי תאי עכבר נמצא. עם זאת, גם כאשר הגורמים אלה נשמרים קבועים, בסך ורכב תאי עכבר הם משתנים מאוד. ניתוחי Downstream של רקמות xenografted לעתים קרובות מאותגרים על ידי תאים ממוצא בעכברים. תרבויות עיקריות של תאים סרטניים אנושיים מן xenografts הם מגודלים לעתים קרובות על ידי פיברובלסטים. מלבד פגע הדור של שורות תאים סרטניים במבחנה, מבחנים במורד כגון בדיקות או הפרמקוקינטיקה cytotoxicity תרופה מוטים מאז בתיקון סיליקון עבור תופעות שמקורן זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. מעבר לכך, ההצטלבות הובהרה באופן חלקי בלבד בין פיברובלסטים עכבר ותאי גידול אנושיים יש השפעה ישירה על תוצאות ניסוי של מחקרים 10. יתר על כן, הווריאציה הצפויה הנרחב ביותר של הסתננות בתאי עכבר מחריף ניתוחים במורד מולקולרי מדויקים. ב NGS או proteome מנתח כל אות עכבר נגזרות נמדדה במקום אות גידול אנושית פוחתת רגישות רצף ישירות. גם מנתח הביטוי מבוסס microarray מאותגרים על ידי nuc murineחומצות leic ואולי והכלאה צולבת בדיקות אדם. על מנת לעקוף את המכשולים של זיהום תאי עכבר בניתוחים במורד זרם של תאים סרטניים אנושיים ממודלי xenograft גישות שונות הוצעו. במחקרים רבים תאי יעד רצויים לניתוח במורד זרם מבודדים על ידי ניצול סמנים או שילובים של סמנים לידי ביטוי אך ורק על תאים סרטניים אנושיים. עם זאת, העדר סמנים האמינים זיהוי חיובי של תאים סרטניים אנושיים לעתים קרובות מייצג מכשול גדול. אפילו רחבת סמנים הביעו, כגון EpCAM על קרצינומות אדם, לעתים קרובות להראות הבדלי ביטוי מהותי גידול 11. זה מגביר את הסיכון כי נמוך subpopulations להביע, למשל, תאים סרטניים שעברו אפיתל-to-mesenchymal המעבר, הם איבדו במהלך הבידוד. בנוסף, המחייב הישיר של סוכן בחירה לתא היעד עלול להשפיע על תוצאות הניתוח שלאחר מכן. ניסיונות של ומכלת תאי עכבר על ידיבאמצעות שילוב של נוגדנים ספציפיים עבור CD45 murine ו אפיטופים אני בכיתה MHC גם נעשו 12. עם זאת, שילוב סמן זה רק מזהה תת קבוצה של תאי עכבר. גישה נוספת היא לשפר תהליכי ניתוח על ידי תוכנה. אף על פי כן, כל הגישות הללו הן גם לא מתאימות לכל סוג של התקנה ניסיונית או לכל ישות גידול ושיטת השתלה. במחקר זה אנו מציגים רומן שיטה מהירה עבור ומכלה בתאי עכבר מקיף מרקמות xenografted העצמאיות של זן העכבר ורקמות מוצא. בהקרנות על איברים ורקמות יעד מרובים להשתלה של xenografts (כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד) הצלחנו לזהות שילוב של נוגדנים המאפשרים לגילוי תאי עכבר באופן מקיף. נוגדנים אלה היו מצמידים לחלקיקים פאראמגנטי, טיטרציה אופטימיזציה עבור דלדול באמצעות מיון התא מגנטי. כפי ספציפי עכבר בלבדנוגדנים משמשים, תאי יעד אדם להישאר &quot;נגעו&quot; והשיטה אינה מוגבלת רקמת גידול xenotransplanted. אנו מראים כי תאי עכבר הסרה מקיפה ממדגם גידול xenografted סטנדרטיזציה ומקלים בתרביות תאים סרטניים אנושיים. יתר על כן, אנו מראים כי הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי רצף הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר ספציפי אדם רצף בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט. יחדיו, הסרת תאי עכבר באמצעות שיטה חדשנית זו מקלת טיפוח של תאים סרטניים אנושיים משפרת באופן משמעותי את הניתוחים במורד הזרם של xenografts הסרטני האנושי.

<table><tbody><tr><td>ערכת דיסוציאציה של גידולים,</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>אנושית מכילה אנזימים H, R ו-A; ראה גיליון נתונים להוראות בנייה מחדש</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator עם תנורי חימום</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer (70 ומיקרו; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שונים אזמל</td><td>ערכת</td> דלדול תאי עכבר שונים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> שימוש <td>שונה</td><td></td><td>1x PBS עבור מאגר PEB</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3610</td><td>השתמש בריכוז סופי של 2 מ"מ במאגר PEB</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>או השתמש ב-5 מ"ג/ליטר BSA במאגר PEB</td></tr><tr><td>עמודות MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מסנני PreSep (70 ומיקרו; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>CD326-FITC, Human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-301</td><td>השתמש ב-1:40 לצביעה אימונופלואורסצנטית&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן נגד וימנטין</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי-עכבר IgG-Alexa488</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי-ארנב IgG-Alexa594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>מדלל לריכוז סופי של 0.1 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-0.1 M נתרן ביקרבונט&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת כתמים פנימית</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-477</td><td>InsideFix מערכה זו יכולה לשמש לשלב קיבוע במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>FcR מגיב חוסם, עכבר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100g</td><td></td></tr><tr><td>Nextera ערכת העשרה ללכידה מהירה</td><td>Illumina</td><td>FC-140-1000</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

השימוש במודלים שורת תאים במבחנה לחקר הסרטן כבר כלי שימושי. עם זאת, הוכח כי מודלים אלה אינם מצליחים לחקות גידולים המטופל באופן אמין מבחני שונות 1. Xenografts גידול האנושי מייצג את תקן הזהב ביחס ביולוגית גידול, גילוי תרופות, ומחקר גרורות 2-4. Xenografts גידול יכול להיגזר סוגים שונים של חומרים כמו שורות תאים סרטניים, רקמת גידול מגידולים מטופלים עיקריים 4 או גידולים המושתלים באופן סדרתי. כאשר מופצות in vivo, רקמות xenografted הוא שחדר ו vascularized ידי תאים ממוצא העכבר. גורמים רבים כגון ישות הגידול, מקורם של חומר xenografted, קצב צמיחה באזור ההשתלה להשפיע על הרכב וכמות תאי עכבר נוכחים xenografts גידול. עם זאת, גם כאשר גורמים אלה נשמרים קבועים, מידת זיהום העכבר התא הוא משתנה מאוד. שיתוףבתאי עכבר ntaminating משמעותיים לפגוע ניתוחים במורד זרם של xenografts הסרטני האנושי. כמו פיברובלסטים עכבר להראות efficacies גבוהה ציפוי ושיעורי התפשטות, הם נוטים לגדול יותר תרבויות של תאים סרטניים אנושיים, במיוחד מתרבים subpopulations לאט. תא עכבר נגזר DNA, ה- mRNA, ורכיבים חלבון יכול ניתוח ביטוי גנים הטיה במורד הזרם, רצף של הדור הבא, כמו גם proteome ניתוח 5. כדי להתגבר על המגבלות האלה, פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטית עם Dissociator המעבדתיים רקמות מיון תא מגנטי. כאן, אנו מראים כי תאי מטרה אנושיים יכולים להיות ניתן להשיג עם purities גבוה מ -96% בתוך פחות מ -20 דקות תלויות בסוג הגידול.

גישות שונות הוצעו כדי לזהות אותך או לרוקן בתאי עכבר המופקים מגידולים אנושיים xenografted, למשל שילוב של נוגדנים ספציפיים העכבר נגד CD45 ואני בכיתה MHC עם זאת, רק תת-אוכלוסיות של תאים עכבר התגלו באמצעות שילובים אלה ואילו השילוב המוצע זוהה CD45 ו MHC אני בכיתה לבטא בתאי עכבר, כמו גם את שאר תאי העכבר נמצאים ברקמות יעד להשתלה (איור 1). ניצול שילוב הרומן הזה של נוגדנים עבור מיון תא מגנטי, תאים סרטניים אנושיים יכולים להיות מבודדים עצמאיים של סוג גידול (איור 2). תאי מתקבל הסרת עכבר מבוסס תאי הליך הפרדת תא מגנטית יכולים להיות מתורבתים, מה שמוביל תרבויות טהורות של תאים סרטניים אנושיים (איור 4). בנוסף, תאי עכבר קיימא יכולים להיות מושגת ותרבותית מןמדגם זהה. מלבד הסרת תאי עכבר, גם פסולת הוסרה על דלדול תא עכבר (MCD) (איור 3). הדלדול המקיף של תאי עכבר כמו גם להוביל הסרת פסולת לניתוחים במורד מולקולרי השתפרו. זה הודגם על ידי השוואת תוצאות המתקבלות רצף exome כולו (WES) בוצעו על חתיכות גידול בכמויות דגימות מדולדלות עכבר תא משלושה נגזרות חולות שונים מודלי גידול xenograft (איורים 5 - 9). הנתונים שלנו מצביעים כי הסרת תאי עכבר לפני ביצוע WES על דגימות גידולי xenograft לא רק מגבירה באופן משמעותי את הסכום הכולל של קורא (איור 5), אלא גם מפחיתה באופן משמעותי את מספר המארח נגזר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי (איור 6). כפי בטעות ממופה אלה העכבר קורא להפריע לעתים קרובות באמצעות שיחות SNP, צפינו ירידה חזקה של שקר חזהSNPs לאחר MCD (איורים 7 - 8). לבסוף, הראינו כי הסרת סיליקון ב של העכבר הנגזר קוראה בשיטות ביואינפורמטיקה לא יכול להחליף את ההליך הניסיון לחלוטין, כמו משימה מבוססת רצף חד משמעית מיני ממוצא לא הייתה אפשרית עבור כל הקורא. יתר על כן, בהליך סיליקון לא יכול נכון עבור איכות משופרת וכיסוי לקרוא במקביל גבוה של דגימות מדולדלות חוץ גופייה (איור 9). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig1.jpg" /> איור 1. הקמת קוקטייל נוגדן הכרה כל תאי העכבר פני 14 איברים מרובים. הקרנות באיברים רבים, כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד, בוצע. איברים אלה מייצגים את רקמות יעד מרכזיות עבור השתלה שלא מבן-מינית. צירופים כגון אלה mou ההכרהse CD45 ו MHC בכיתה אני אפיטופים כבר שימשו כדי לרוקן בתאי עכבר לאחר השתלה שלא מבן-מינו. עם זאת, שילובים סמן אלה מוכרים רק קבוצת משנה של תאי עכבר בכל הרקמות המנותחות. בשנת הקרנות קודמות שילוב של חמישה נוגדנים זוהה המאפשר זיהוי המקיף של כל התאים ממקור עכבר. לוח זה כולל תאי דם אדומים הוא עצמאי של רקמת מוצא (A, B, ו מידע לא מוצג). שונה מ 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig2.jpg" /> איור 2. דלדול מהיר ואמין של תאי עכבר 15. Conjugates של שילוב הנוגדן עם n פאראמגנטיanoparticles שמש לפתח פרוטוקול אופטימיזציה עבור דלדול של תאי עכבר xenografts הסרטני האנושי על ידי תא מגנטי מיון (פרדת תא מגנטית) (א). פרוטוקול הרומן הזה מותר לשם מניעה&gt; 99% של זיהום בתאי עכבר בתוך פחות מ -20 דקות, ללא קשר לסוג הגידול. שברים ניידים המתקבלים הליך הפרדת תא מגנטי תויגו עם הקוקטייל של נוגדני הפאן עכבר נוגדן ספציפי אדם נגד CD326 (EpCAM) (B). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig3.jpg" /> בידוד איור 3. של אדם תאי Glioblastoma. ערכת שחסך בתאי עכבר שמש לבודד תאי גליובלסטומה אדם מן mous המבוגרמוח דואר. במהלך דיסוציאציה של כמויות גדולות של רקמה עצבית פסולת נוצרת בדרך כלל. MCDK מכלת תאים מתים ביעילות פסולה כפי שניתן לראות על ידי העלילה מראה גודל תא מול גרעיניות תא. עם קוקטייל המצומד זה, אפשר היה לחסל&gt; 99% של תאי עכבר זיהום ו&gt; 60% של הפסולת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig4.jpg" /> דלדול איור 4. עכבר תאי מקלת תרבויות Downstream של תאים סרטניים אנושיים 14. פיברובלסטים העכבר לעתים קרובות לעכב את הטיפוח של תאים סרטניים אנושיים לאחר הניתוק של רקמות מושתלות או להוביל תרבויות הטרוגנית. פיברובלסטים לצרף ולהרחיב ביעילות רבה יותר, ובכך overgrowing ג היעד<html> אמות. זה מדאיג מבחני תרבית תאים במבחנה (בדיקות רעילות למשל, תרופה), מאז תיקון מתמטי תופעות נובעות זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. הצד השלילי (B) והשברים חיוביים (C) לאחר דלדול עכבר תא היו בתרבית למשך שלושה ימים, קבוע מוכתם עבור סמן פיברובלסטים עכבר ספציפי (vimentin) ואת סמן הגידול האנושי ספציפי CD326 (EpCAM). כביקורת, השבר המקורי המכיל תאי unseparated (א) היה מתורבת ומוכתם גם כן. גם לאחר שלושה ימים של תרבות, אוכלוסייה טהורה כמעט של תאים סרטניים אנושיים נצפתה השבר השלילי (ב), ואילו את החלק היחסי הממוין (א) היה כמעט מגודל על ידי פיברובלסטים. רק חלק קטן של תאי היעד אבד החלק החיובי (C). השתנה מ -14.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig5.jpg" /> איור 5. כל הפריטים Exome רצף (WES) של דגימות גידולים לפני ואחרי דלדול תא עכבר (MCD) 15. ערכנו WES על שלושה מודלים xenograft שונים נגזר כליה אנושית, ריאות וסרטן שלפוחית ​​השתן על מנת להעריך את ההשפעה של MCD על איכות נתוני רצף של הדור הבא. DNA מגידולים בתפזורת מתאי גידול מבודד לאחר שחסך בתאי העכבר היה השתמש כדי ליצור ספריות רצף שנתפס exome החלת ערכה ללכוד exome. עבור סידור על מכשיר ברצף שולחן עבודה, ערכה מגיבה ברצף שולחן עבודה 150 מחזורים, נוצל כדי ליצור 75-נ&quot;ב לזווג סוף הקורא. עלייה משמעותית (p &lt;0.05) בצפיפות אשכול (א) וכן aveזעם עלייה בספירת קריאה של 33% (ב) ​​נצפתה על הדגימות המדולדלות של בתאי עכבר, המציין איכות מדגם השתפרה. במקביל, ירידה חזקה של פסולת תאים מתים על MCD יכולה גם לבוא לידי ביטוי על ידי ניתוח תזרים cytometry (ראה איור 3). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig6.jpg" /> דלדול Cell איור 6. עכבר (MCD) בתוקף מפחית המספר בטעות הממופה העכבר קורא אחרי כל פריטי Exome רצף (WES) 15. כפי oligonucleotides ללכוד המשמש להעשרה ממוקדת של רצפי מקודדי חלבונים נועדו מבוסס על גנום האדם, גידול טרום ראשוני העשרת קטעי דנ&quot;א של fr ממקור אנושיom את התערובת של עכבר תאים אנושיים הייתה צפויה. על מנת להעריך את מספר oligonucleotides לכידת שעשוי לחצות להכליא עם הדנ&quot;א הגנומי העכבר, ערכנו חיפושים תפציץ של כל בדיקה exome ללכוד מהירה אחת נגד גנום העכבר. פרמטרי היישור וכתוצאה ששמשו לקביעת הכלאה צולבת אפשרית. (.. אורך יישור, לא של חוסר התאמה, לא פערים) בהתאם ספי הבחירה, אנו חזינו תגובתיות צולבת של 5 - 10% של בדיקות ללכוד עם תמלילי עכבר (מידע לא מוצג). לאחר גזיר מתאם (trimmomatic v0.32 16), אנו מייפים את הקורא של כל הדגימות נגד הגנום אנושי ועכבר (v0.7.12 BWA 17) וקבענו מהמוצא המשוער שלהם בהתבסס על פרמטרי יישור בהתאמה (פגז LINUX, שורת פקודה פרל) (א). בממוצע 12% של הקורא נגזר דגימות גידולים בתפזורת יוחס בתאי עכבר. סכום זה יכול להיות מופחת ל -0.3% על ידי דלדול מראש של תאי עכבר (B </strong&gt;). כמו ב -15% ממוצעים של עכבר נגזר קורא ממופית בטעות את הגנום האנושי, המקביל ל -1.9% בסך הכל קורא בדגימות הגידול בכמויות 0.04% בתאים הסרטניים הבודדים, השפעה חיובית חזקה של דלדול תא עכבר על ניתוחים במורד זרם ניתן לצפות. איור 6 מדגים את המשימה לקרוא מפורטת גידול בכמויות תאים סרטניים אנושיים מבודדים נגזרים xenograft סרטן שלפוחית ​​השתן. שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig7.jpg" /> איור 7. MCD בתוקף מפחית את מספר SNPs חזוי שווא 15. על מנת לקבוע את ההשפעה של העכבר קורא ממופה הגנום האנושי, קבענו את מספר predicteSNPs ד עבור דגימות xenograft לפני ואחרי MCD. מאחר שלא רקמה בריאה היה זמין עבור השוואה, SNP הוגדרה הבדל בין המדגם רצף ואת הגנום הפניה (hg19). לאחר הסרת כפולים קורא, SNP וקראו INDEL נערך 18 ו הוגבל באזורים אליהם מכוון ערכת ללכוד exome. 63 ± 10% מכלל SNPs ניבאו עבור דגימות גידול בכמויות הגדולות אינה אותרו כבר לאחר שחסך בתאי עכבר, 18 ± 1% היו ספציפיים עבור התאים הסרטניים האנושיים המבודדים (א). בעוד שהראשונים נגרמו בעיקר על ידי עכבר ממופה בטעות קורא את זה האחרון נראה להתגלות בשל ספירת קריאה גבוהה וכיסוי בהתאם גבוה בתוך דגימות תאים סרטניים האנושיות המבודדות. אפקט זה היה גלוי גם עבור indels חזה (B). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה</a><html> דמות. <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig8.jpg" /> איור 8. MCD משפר את חיזוי מרשימות SNPs 15. (א) השפעת MCD על חיזוי SNP בתוך אקסון המקודדים חלבונים של הגן POLA1 19 מודגם. בעוד העכבר ממופה בטעות קורא גרם למספר SNPs ניבא באופן שקרי ב xenograft סרטן הכליה בתפזורת, SNPs אלה חסרים לאחר MCD. בנוסף, MCD גם שיפרה את התחזית של השפעה גבוהה SNPs. לדוגמא, עכבר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי במדגם גידול בתפוצה הרחב גרם להרס חזה בטעות של קודון ההתחלה של גן GRIA3 (B). שונה מ 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> s = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig9.jpg" /> איור 9. סיליקו דלדול של עכבר נגזר קורא לא יכול מלא להחליף לי n Vitro 15 MCD. קורא צפוי להיות ממוצא העכבר הוסרו מחשוב מנתוני הרצף, וקראו SNP חזר על עצמו. לפי גישה זו, מספר SNPs ניבא עבור דגימות גידולים בתפזורת הופחת באופן משמעותי מ -63% ל -8.5% של המספר הכולל של SNPs (להשוות עם איור 8). עם זאת, זה בגישת סיליקון לא יכול להחליף לחלוטין את במבחנת MCD, במיוחד אם איכות המדגם המשופרת והעלייה במקביל בספירה לקריאה והכיסוי נחשב. שונה מ 15.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי.

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד במהירות תאי גידול אנושיים שהושתלו באופן קסנו-טרנספלנטציה מעכברים, כדי לשפר את הניתוחים הבאים של תאי המטרה הרצויים. סילוק תאי העכבר המזהמים בשיטה זו מאפשר הערכה ספציפית של ביטוי גנים בתאי גידול אנושיים או תגובות ישירות in vitro. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד את תאי הגידול האנושיים במהירות ובקלות מבלי להזדקק לזיהוי של סממנים עיליים כלשהם על תאי המטרה.התחילו בשימוש בפינצטה ובסכין מנתח להסרת השומן והאזורים הנמקריים מדגימת הגידול. לאחר מכן, קצצו את הגידול לחתיכות של שני עד ארבעה מילימטרים. בשלב הבא, העבירו את מקטעי הרקמה לשפופרת להפרדת תרחיף תאים בודדים המכילה את תערובת העיכול וסגרו את השפופרת היטב.הנח את המבחנה הפוך על מעמד של מכשיר לפירוק רקמות (tissue dissociator) וודא שפיסות הרקמה נמצאות באזור הרוטור-סטטור. חבר את המחמם למכשיר הפירוק, לאחר מכן לחץ על סמל התיקייה במסך המגע והשתמש בחצים למעלה ולמטה כדי לבחור את מצב פירוק הגידול המתאים. לאחר מכן, בחר את מיקום המעמד שבו נמצא הדגימה והפעל את תהליך הפירוק.לאחר קבלת תרחף של תאים בודדים, סובב את המבחנה במהירות בצנטריפוגה כדי לרכז את התאים בתחתית המבחנה. סנן את התאים דרך מסננת רשת של 70 מיקרון אל תוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר, ושטוף את המסננת עם 20 מיליליטר מצע גידול, תוך איסוף נוזל השטיפה למבחנת הדגימה. לאחר מכן, סובב את התאים בצנטריפוגה ותלה את משקע תאי הסטרומה של עכבר עם גידול אנושי בחמישה מיליליטר של PB buffer.לאחר הספירה, אספו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה נוסף ותלו את המשקע ב-80 µL של PB buffer לכל 1x10⁷ תאים סה"כ. בשלב זה, חשוב להשתמש במיקרוסקופ ולנסות לבצע הדרת צבע כחול (blue exclusion) במקום להשתמש בסופר תאים, כדי להשיג ספירה מדויקת של התאים החיים. סופרי תאים סובלים לעיתים קרובות מבעיות בטיפול בדגימות הטרוגניות לאחר דיסוציאציה של רקמה.בשלב הבא, ערבבו 20 µL של ריאגנט סימון מגנטי לתאי עכבר לתוך תרחיף התאים והדגירו את התאים למשך 15 דקות במקרר. בזמן סימון התאים, הכניסו עמודת LS למגנט מתאים ושטפו את העמודה עם 3 mL של באפר PB. בסיום ההדגרה, הוסיפו 420 µL של באפר כדי להביא את נפח הדגימה הכולל ל-500 µL, ושמרו אליקוט של 50 µL בטמפרטורה של 2 עד 8 °C לצורך ניתוח ציטומטרי או מולקולרי מאוחר יותר.לאחר מכן, העבירו את התאים לעמודה באמצעות מסננת רשת של 70 מיקרון שעברה שיווי משקל. אספו את זרימת המעבר של תאי המטרה שאינם מסומנים. ברגע שהמאגר התרוקן, שטפו את העמודה פעמיים עם 1 mL של בופר, ואספו את האלואנט לאותו שפופרת שבה נאסף פראקציית התאים השליליים.כדי לאסוף את תאי העכבר הקשוריים לחרוזי המגנט, העבירו את העמודה למבחנה קונית חדשה והעבירו שלושה מיליליטר של בופר דרך העמודה. שימוש בשילוב החדש של נוגדנים אנטי-עכבר יעיל באופן משמעותי יותר לזיהוי מקיף יותר של תאי עכבר ברקמות יעד להשתלה זרה (xenotransplantation) מאשר סימון משולב של CD45 ו-MHC class one. למעשה, שימוש בשילוב חדש זה של נוגדנים למיון תאים מגנטי מקל על בידוד של תאי גידול אנושיים ללא תלות בסוג הגידול.בנוסף לסילוק תאי העכבר, פסולת מוסרת אף היא במהלך הפרדת התאים המגנטית. ניתן לאחר מכן לתרבת את תאי הגידול האנושיים הנקיים מתאי עכבר, מה שמוביל להפקת תרביות טהורות של תאי גידול אנושיים. סילוק תאי העכבר לפני ביצוע ריצוף איקסום מלא (whole exome sequencing) של דגימות גידולים ששגרו בשיטת קסנוגרפט לא רק מגדיל משמעותית את כמות הקריאות הכוללת, אלא גם מפחית במידה ניכרת את מספר הקריאות שמקורן במארח הממופות לגנום האנושי הייחוס ואת מספר הפולימורפיזמיים של נוקלאיד בודד (single nucleotide polymorphisms) שנחזו באופן שגוי.הסרה בשיטת in silico של קריאות ממקור עכברי באמצעות שיטות ביו-אינפורמטיות אינה יכולה להחליף באופן מלא את הפרוצדורה הניסיונית, מכיוון ששיוך חד-משמעי של כל הקריאות למין המקור על בסיס רצף אינו אפשרי. כפי שמוצג כאן עבור מספר ה-SNPs החזויים, פרוצדורת ה-in silico אינה יכולה לתקן את האיכות המשופרת ואת כיסוי הקריאות הגבוה הנלווה לכך בדגימות שעברו תהליך depletion in vitro. לאחר רכישת המיומנות הנדרשת, ניתן להשלים את התהליך כולו, כולל הכנת הגידול, הפירוק (dissociation), הספירה וההפרדה המגנטית, תוך שעתיים אם הוא מבוצע כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להכין את דגימת הרקמה כראוי לקראת הדיסוציאציה, להימנע משימוש באנזימים אגרסיביים, ולהקפיד על השגת ספירת תאים מדויקת. לאחר ביצוע הפרוצדורה, ניתן להשתמש בתאי הגידול האנושיים המפוסטים לכל סוג של אנליזה המשכית, טיפוח, או אפילו למיון תאים מגנטי או מבוסס זרימה (flow-based). לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר הסרטן לבחון תאי גידול ותאי גזע סרטניים אנושיים מחולה ומקסנוגרפט חלקי-ישיר, ללא כל הטיה מצד תאי העכבר.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי המהירות והקלות שבה ניתן לשפר את הבדיקות הבאות שלכם (downstream assays) באמצעות עבודה עם אוכלוסיות טהורות של תאי מטרה.

depletion-mouse-cells-from-human-tumor-xenografts-significantly

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי...

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת מודל עכבר xenograft אנושי. עכבר מדוכא חיסון מוזרק עם cyclophosphamide כדי לגרום לדלדול תאי החיסון. תאי גידול שמקורם במטופל מעורבבים עם תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהידרוג'ל מוזרקים תת עורית לעכבר, ויוצרים גידול עם תאי T חודרים.

טכניקה ליצירת מודל עכבר קסנוגרפט אנושי המושתל על ידי PBMC אנושי

xenografts גידול האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים הם כלים רבי ערך כדי ללמוד ביולוגיה בסרטן. פרוטוקולים ספציפיים כדי ליצור xenografts תת עורי וintrahepatic מתאי אנושיים hepatocellular קרצינומה או שברי גידול מתוארים. התחדשות כבד הנגרמת על ידי כריתה חלקית בעכברי נמען מוצגת כאסטרטגיה כדי להקל על קליטתם intrahepatic.

דור של תת עורי וintrahepatic אדם xenografts קרצינומה hepatocellular בעכברים עם מערכת חיסון חלשים

אנו מתארים שיטת תיוג יציב של xenografts נגזרות החולות (PDXs) עם חלקיקי lentiviral להביע כתבי חלבון בלוציפראז ירוקים-ניאון. שיטה זו מאפשרת מעקב צמיחת PDXs המצוי באתר הראשי, כמו גם באיתור גרורות ספונטניות ניסיון באמצעות במערכות הדמית vivo.

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

לימפומה cell מנטל (MCL) היא קשה לטפל הפרעת תא B ולכן לא פחות קשה להקים מודל העכבר xenograft של ראשי MCL ללמוד ולפתח את הרפוי. כאן, אנו מתארים את הקמת MCL xenografts בעכברים כדי לעזור להבין את הביולוגיה כבסיס מוצלחת.

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

פרוטוקול זה מתאר את הדור של עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS) עבור מחקרים אימונו-אונקולוגיים. הוראות ושיקולים בשימוש במודל זה לבדיקת אימונותרפיה אנושית על גידולים אנושיים המושתלים במודל זה מוצגים בדגש על אפיון התגובה של מערכת החיסון האנושית לגידול.

בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לניתוק מהיר של דגימות גידולים אנושיים ועכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי.

דיסוציאציה של דגימות רקמת גידול בבני אדם ובעכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי

למד שיטה לבידוד תאי גידול אנושיים מ-xenografts בעכברים באמצעות מיון תאים מגנטי. טכניקה זו מסירה תאי עכבר מזהמים ומשפרת משמעותית את איכות הניתוח הגנטי במורד הזרם.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

גלה סרטונים נוספים