הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ"א הפקת DNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ ברצף RNA ו-DNA מליבות רקמה משובצות פרפין קבועות בפורמלין. זהו פרוטוקול לקצירת ליבות רקמה שממנו נחלץ גם RNA וגם DNA. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא משפר את תפוקות ה-RNA וה-DNA מאזורים ממוקדים במדויק בבלוק הרקמה.

הליך זה מפותח בעיקר ברקמות סרטן הערמונית בארכיון. ניתן ליישם אותו גם על סוגים אחרים של רקמות ארכיון. ההדגמה החזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי ליבת הרקמות אינם בשימוש נפוץ במעבדות מחקר.

רוב מעבדות המחקר משתמשות במקום זאת בחתכים רוחביים, מה שממצה את הרקמות מהר יותר ומוסיף הטרוגניות משמעותית לדגימה. התחל בסקירת שקופית המיקרוסקופ ומתאר את אזור העניין באמצעות סמן קבוע עדין. לאחר מכן, חתכו קטע של סרט פרפין גדול מספיק כדי לכסות את אזור העניין בשקופית המיקרוסקופ.

לאחר מכן, הניחו את הסרט בחוזקה על השקופית, עטפו את הסרט על הקצוות כדי למנוע ממנו להחליק. בעזרת סמן קבוע עדין, מתאר את כל הרקמה ואת אזור העניין בתוך הרקמה. לאחר מכן, הסר את הסרט מהשקף והעביר אותו לגוש הרקמות המתאים.

כוון את הסרט על ידי היפוך או סיבוב כך שקווי המתאר של הרקמה כולה יתאימו לצורה הנצפית של הרקמה בבלוק. לחץ את קטע הסרט בחוזקה אל פני הבלוק כדי למנוע החלקה. בעזרת קצה הסמן הקבוע, צור חריצים רדודים אך גלויים לאורך קווי המתאר של אזור העניין ולאחר מכן הסר את הסרט.

לאחר מכן, נקה את אגרוף הקולטן מהאגרוף של 0.6 מילימטר על ידי טבילת הקצה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של אקונומיקה והחלקת האגרוף למעלה ולמטה מספר פעמים. חזור על הכביסה עם הצינור המכיל 70 אחוז אתנול, ולאחר מכן מים. כעת לחץ על האגרוף הנקי לאזור העניין לעומק של שלושה מילימטרים ומשוך.

שחרר את הליבה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בעל קשירה נמוכה על ידי דחיפתה החוצה מהאגרוף עם החרט. הוסף מיליליטר אחד של קסילן לצינורות המיקרופוגה המכילים את ליבות הרקמה והמערבולת במרץ למשך עשר שניות. לאחר מכן מניחים בגוש חום המוגדר ל 50 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר במהירות מרבית. לאחר הצנטריפוגה, הניחו את הליבות על קרח למשך חמש דקות כדי למצק את שאריות השעווה. כעת, הסר בזהירות את הפרפין שהצטבר סביב המניסקוס יחד עם הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה.

לאחר מכן, חזור על הטיפול בקסילן. לאחר הסרת תערובת הפרפין קסילן, הוסיפו מיליליטר אחד של 100 אחוז אתנול ומערבולת במרץ למשך עשר שניות. לאחר צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך שתי דקות, השליכו בזהירות את האתנול.

חזור על שטיפת האתנול פעם נוספת לפני תחילת ההומוגניזציה. השעו מחדש את הליבות המפורקות ב-700 מיקרוליטר של 100 אחוז אתנול לפני ההומוגניזציה. השתמש בהומוגנייזר רקמות ממונע על הגדרה בינונית כדי לטחון את הליבות לחלקיקים עדינים.

נדרשת הומוגניזציה יסודית של ליבות הרקמה לתפוקת DNA ו-RNA אופטימלית. לאחר מכן, מלאו צינורות נפרדים של 15 מיליליטר בכעשרה מיליליטר אקונומיקה, תמיסת נטרול RNase ו-70 אחוז אתנול. לאחר הומוגניזציה של הדגימה, יש לשטוף את בדיקת ההומוגנייזר בכל אחד מתמיסות הניקוי לפי הסדר.

הפעל את ההומוגנייזר במהירות הגבוהה ביותר במהלך הכביסה שלב. נגב את הגשושית עם טישו ואפשר לבדיקה להתייבש לחלוטין לפני הומוגניזציה של הדגימה הבאה. בדוק ויזואלית את להבי הבדיקה לאיתור חלקי רקמה שיוריים ואם נמצא, נקה שוב את הבדיקה.

לאחר ההומוגניזציה, הביאו את נפח הדגימה למיליליטר אחד עם 100 אחוז אתנול, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות. שאפו בזהירות את האתנול וייבשו את הכדורים באוויר במשך כ-15 עד 20 דקות לפני תחילת מיצוי פרוטאינאז K. השעו מחדש את הכדורים ב-150 מיקרוליטר של מאגר עיכול פרוטאינאז K והעבירו את הצינורות כדי לשחרר את הגלולה.

עיכול פרוטאינאז K בן לילה מומלץ להתאוששות DNA גבוהה יותר. מוסיפים 10 מיקרוליטר חלבון K יציב בטמפרטורה ומערבבים על ידי החלקה. דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם תסיסה קלה.

דגרו את הצינורות על קרח למשך שלוש דקות. לאחר הקירור, צנטריפוגה את הצינור למשך 15 דקות במהירות מרבית. לאחר מכן, מבלי להפריע לכדורים, העבירו בזהירות כל סופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש לטיהור רנ"א.

חלץ RNA ו-DNA באמצעות ההליך האופטימלי בפרוטוקול הכתוב, הכולל זמן עיכול רקמות ממושך למיצוי DNA. ניתן לשחזר RNA ו-DNA מדגימות רקמה ישנות יותר משובצות פרפין קבועות בפורמלין בשיטה זו. חומצות גרעין חולצו מדגימות סרטן הערמונית בטווח שבין שלוש ל-14 שנים בגיל הדגימה.

התפוקה הממוצעת הייתה 2,270 ננוגרם RNA ו-820 ננוגרם DNA. מעניין שלא היה מתאם משמעותי בין גיל דגימת הרקמה להתאוששות חומצות גרעין. בסך הכל, תפוקות RNA ו-DNA היו בקורלציה בין הדגימות, אם כי ברוב המקרים, יותר מפי שניים RNA שוחזר ביחס ל-DNA.

כדי להדגים את הביצועים של DNA גנומי המופק בפרוטוקול זה, תמציות DNA שהומרו בביסולפיט מדגימות סרטן ערמונית בארכיון הוגברו על ידי PCR ספציפי למתילציה. אלמנטים חוזרים של ALU שימשו כבקרת מתילציה והראו שונות מועטה בין הדגימות. GSTP1, גן הידוע כהיפר-מתילציה בסרטן הערמונית, לא הראה הגברה ניתנת לזיהוי על ידי PCR ספציפי למתילציה כאשר נעשה שימוש ב-DNA שהופק מדגימות שפירות.

דגימות DNA מחולים עם סרטן ערמונית אגרסיבי הראו ערכי סף מחזור QPCR הניתנים לזיהוי שהיו נמוכים מאלה של תאי סרטן ערמונית עצלים, מה שמעיד על מתילציה מוגברת של GSTP1 בסרטן ערמונית אגרסיבי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות עבור RNA, ולאחר עיכול לילה, תוך ארבע שעות עבור DNA אם היא מבוצעת כראוי. טכניקה זו אמורה לאפשר לחוקרים בפתולוגיה מולקולרית לחקור סמנים ביולוגיים של DNA ו-RNA אבחנתיים במגוון סוגי סרטן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ליבות רקמה למיצוי DNA ו-RNA מאזורי עניין ממופים במדויק בגושי רקמות ארכיוניים.