השוואת שיטות להסרת Cell חלבון מארח טבק ידי לבנת צמחים שלמים או על ידי טיפול בחום של תמציות

המטרה הכללית של מערך ניסויים זה היא להשקיע חלבונים של תאי מאכסן צמחיים באמצעות חום. בכך תCופשט טיהור כרומטוגרפי עוקב של חלבונים ביו-פארמצבטיים רקומביננטיים. שיטה זו יכולה לסייע בייעול פיתוח התהליך ובהגברת יציבות המוצר, למשל על ידי הפעלת פרוטאזות של המאכסן.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא קלה ליישום בתוך פרוטאזות קיימות וניתנת להתאמה מהירה לחלבוני מטרה שונים. את הפרוצדורה תדגים חנה גרוצ'ו (Hannah Gruchow), סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. לצורך השקעת חלבוני תא המארח באמצעות חימום.

לדוגמה מעלי טבק. לאחר גידול צמחי טבק בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו אמבט מים בנפח עבודה של שמונה ליטרים בתוך דלי קצף פוליסטירן מבודד תרמית. העבירו את המכל כולו למגנט סטירר (ערבב מגנטי), והניחו מגנט בתוך אמבט המים.

לאחר מכן, הקיפו את מוט הבחישה בלוח תמיכה לא-מגנטי הגבוה מהמוט בכשני סנטימטר אחד. על לוח זה יונח מאוחר יותר במהלך הפרוצדורה סל פוליפרופילן. הוסיפו שמונה ליטרים של תמיסת בופר למכאם המים.

לאחר מכן, הניחו סל פוליפרופילן בגודל 23 על 23 על 23 סנטימטר על אריחי התמיכה. ודאו שהתמיכה אינה מפריעה לסבסוב של מוט הבחישה ושהסל שקוע לחלוטין בנוזל. לאחר מכן, הוציאו את הסל.

השתמשו בתרמוסטט מתכוונן כדי להביא את מקבץ המים ל-70 °C. המתינו לפחות 15 דקות לאחר הגעת המערכת לטמפרטורה הרצויה כדי להבטיח שכל המכלול הגיע לשיווי משקל תרמי. לאחר מכן, הכינו מנות של 150 גרם מעלי טבק.

הניחו מנה אחת (aliquot) בסל תוך כדי הימנעות מדחיסה בלתי הפיכה ומנזק לעלים, למשל על ידי קריעה. טבלו את הסל בזהירות אך במהירות בנוזל החם והניחו אותו על אריחי התמיכה.

לאחר מכן, הניחו בלוק פלדה אל חלד על גבי הסלסילה כדי למנוע ציפה. הדגירו את העלים במשך חמש דקות בנוזל החליטה. לחלופין, בחרו זמן המתאים למערך הניסוי.

יש לנטר את טמפרטורת הנוזל לאורך כל תקופת האינקובציה. לאחר האינקובציה, הוצאו בזהירות את הסל מהנוזל לחליטה והניחו לעלים להתנקז במשך 30 שניות. לאחר מכן, הוציאו את עלי הצמח מהסל, העבירו אותם לבלנדר והתחילו מיד בתהליך המיצוי בהתאם לפרוטוקולים הכתובים.

לחימום משקעים של HCPs בכלי ערבוב. העבירו אמבט מים על גבי פלטת ערבוב מגנטית והניחו כלי פלדה אל חלוד בנפח של שני ליטר בתוך אמבט המים, כך שמרכז הכלי יהיה מיושר למרכז פלטת הערבוב. הניחו מגנט ערבוב בתוך כלי הפלדה אל החלוד.

מלאו את הכלי בתמיฬת מיצוי. לאחר מכן, מלאו במים דה-יוניזים. מלאו את מקבץ המים עד לגובה של חמישה סנטימטרים מתחת לקצה העליון של כלי הנירוסטה.

השתמשו במכסה קצף פוליסטירן כדי לכסות אותו. לאחר מכן, הכניסו מדחום לתוך כלי הפלדה אל-חלודה דרך חור ייעודי במכסה. לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת מקבץ המים ל-78 °C והדגירו את המערכת כולה למשך 15 דקות עד להגעה לשיווי משקל תרמי.

כאשר המערכת תגיע לשיווי משקל, רוקנו את הכלי ושפכו לתוכו 300 milliliters של תמצית בעודו בתוך אמבט המים והפעילו את הטיימר. ערבבו את התמצית במהירות של 150 rpm תוך כדי דגירה למשך חמש דקות. ודאו שהתמצית מגיעה לטמפרטורה של 70 °C למשך שתי דקות לפחות במהלך תקופת הדגירה.

לאחר הדגירה, הסירו את מקבץ המים החמים מהמערבל המגנטי. הוציאו את כלי הפלדה שאינה חלודה והניחו אותו בדלי עם מי קרח. לאחר מכן, הניחו את הדלי על לוח הערבוב.

יש לוודא שההומוגנאט של הצמח מעורבל היטב במהירות של 150 rpm. מקם את מדחום בתוך התמצית והדגה אותה עד שתגיע לטמפרטורה של 20 degrees Celsius או לטמפרטורה המצוינת. לאחר הכנת שני מקבתי מים בנפח עבודה של שמונה ליטרים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש במים דאיוניים למילוי המקבת הראשונה.

כוון את התרמוסטט ל-74.5 °C והדגר את המערך למשך 15 דקות כדי להגיע לשיווי משקל תרמי. הכן כלי אחסון מבודד על ידי הנחת כלי זכוכית (beaker) מפלסטיק בנפח 0.5 ליטר בתוך כלי זכוכית מפלסטיק בנפח ליטר אחד. השתמש בחומר בידוד כגון צמר גפן כדי למלא את המרווחים.

באמצעות צינור LS24, חברו את מחליף החום למשאבה פריסטלטית בקצה אחד, ולצינור יציאה בקצה השני. הניחו את שני קצוות הצינור יחד עם המדחום בתוך כלי האחסון המבודד. מלאו אותו ב-300 millimeters של תמיסת סחף (extraction buffer).

בשלב הבא, הניחו את מחליף החום באמבט המים החמים, והפעילו את משאבת הפריסטלטיקה בקצב של 300 milliliters per minute. לאחר שלוש דקות, ודאו שהטמפרטורה שהתקבלה בכלי היא 70 °C. ערך זה נמוך בכ-4.5 °C מנקודת הset point של אמבט המים.

שפכו את בופר המיצוי מהכלי המבודד, והכינו מנות (aliquots) של 300 מיליליטר של תמצית הצמח. לאחר מכן, מלאו את הכלי המבודד באמצעות מנה אחת. כעת, הזרים את תמצית הצמח דרך מחליף החום בקצב של 300 מיליליטר לדקה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, ודאו כי טמפרטורת התמצית היא 70 °C לאחר שלוש דקות, או שמאזנת לטמפרטורה המופיעה במערך הניסוי. לאחר חמש דקות, העבירו את מחליף החום לאמבט מים קרים עם קרח. ודאו שטמפרטורת התמצית נמוכה מ-30 °C לפני המשך התהליך.

הסר את צינור הכניסה המחובר למשאבה הפריסטלטית מהכלי המבודד. המשך בשאיבה כדי לאסוף את שאריות תמצית הצמחים ששקעה כתוצאה מהחימום מתוך מחליף החום. לאחר מכן, עצור את המשאבה.

כדי לבצע סינון בשקיות של תמצית הצמח, התקינו מסנן שקית בסל התמיכה המתאים המורכב בתוך בית הסינון. הניחו כלי בנפח של ליטר אחד מתחת לסל והעבירו את מנות התמצית לשקית בקצב של 150 milliliters לדקה. לאחר הסינון, השתמשו בטורבידומטר כדי למדוד את העכירות של דילול של 1:10 של התסנן בבופר מיצוי.

העבירו מנה של דגימה בנפח של 1 ml ועבדו את התסנין מהשקיות. לדוגמה, באמצעות סינון עומק (depth filtration) וכרומטוגרפיה. נתחו את הדגימה בהמשך בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

השקעה תרמית של חלבוני תא המאכסן באמצעות חליטה (blanching) מפחיתה את סך החלבון המסיס או TSP ב-96 פלוס או מינוס 1%. החליטה שחזרה עד 83 פלוס או מינוס 1% מ-DsRed ו-51% מחלבון המטרה Vax8, ובכך הגבירה את טהורתו מ-0.1% ל-1.2% לפני הפרדה כרומטוגרפית.

קיבולת המסנן ירדה בטמפרטורות הלבנה הגבוהות מ-63 °C. ניתן לטפל בכך על ידי הוספת פלוקולנטים לאחר חילוץ חלבונים ועזרי סינון לאחר סינון בשקיות. כלי ערבב להשקיעה תרמית הסיר מקסימום של 84 ± 1% HCPs.

השגת רמת טוהר של 0.33 פלוס או מינוס 0.02 אחוזים עבור Vax8 ו-20.2 פלוס או מינוס 1.4 אחוזים עבור DsRed. בניגוד לחליטה ולהגדרת מחליף החום, השקעת HCP בכלי הגבירה את קיבולת סינון העומק במורד הזרם פי 2.5. הדבר משקף כוחות גזירה נמוכים יותר בכלי בהשוואה לשאיבת תמצית דרך מחליף החום או הומוגניזציה לאחר חליטה.

כ-88.3 פלוס או מינוס 0.7 אחוזים מתכולת ה-HCP הוסרו באופן עקבי מהתמצית באמצעות מחליף חום בין 60 ל-70 מעלות Celsius. הושגה רמת טוהר של 0.31 פלוס או מינוס 0.01 אחוזים עבור Vax8, ו-27.6 פלוס או מינוס 2.0 אחוזים עבור DsRed.

לבסוף, מחליף החום השיג גם את קיבולת מסנן העומק הנמוכה ביותר במורד הזרם. הוא הצליח לנקות רק 13.5 פלוס או מינוס 6.0 ליטרים למטר רבוע לפני הסתימה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-50 דקות בתוספת זמן הדגימה, במידה והיא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע שיטה זו, חשוב לזכור לוודא שהחלבון המטרה יציב בחום. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון כרומטוגרפיה כדי לטהר את המוצר עוד יותר לרמה הנדרשת. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הצמחים לשימוש בטכנולוגיה לבחינת טיהור של חלבונים מועמדים למסענקים ובמינים של nicotiana.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשקיע חלבונים של תאי מאכסון צמחיים באמצעות חליטה, מיכל עם בקיע או מחליף חום.