השוואת שיטות להסרת Cell חלבון מארח טבק ידי לבנת צמחים שלמים או על ידי טיפול בחום של תמציות

המטרה הכוללת של סדרת ניסויים זו היא לזרז חלבוני תא מארח צמחים באמצעות חום. ובכך מקל על טיהור כרומטוגרפי לאחר מכן של חלבונים ביו-פרמצבטיים רקומביננטיים. שיטה זו יכולה לעזור לייעל את פיתוח התהליכים ולהגביר את יציבות המוצר, למשל על ידי הפעלת פרוטאזות מארח.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה ליישום בפרוטאזות קיימות וניתן להתאים אותה במהירות לחלבוני מטרה שונים. מי שתדגים את ההליך תהיה חנה גרוכוב, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לזרז את חלבוני התא המארח.

למשל מעלי טבק. לאחר גידול צמחי טבק על פי פרוטוקול הטקסט, הקימו אמבט מים בנפח עבודה של שמונה ליטר בדלי קצף פוליסטירן מבודד תרמית. העבירו את כל המכלול על צלחת ערבוב מגנטית, והניחו מוט מגנטי באמבט המים.

לאחר מכן הקיפו את מוט הערבוב באריח תמיכה לא מגנטי מעל מוט הערבוב בכסנטימטר אחד. עליו יונח סל פוליפרופילן בהמשך ההליך. הוסף שמונה ליטר חיץ לאמבט המים.

לאחר מכן הניחו סל פוליפרופילן בגודל 23 על 23 על 23 ס"מ על אריחי התמיכה. הקפדה על כך שהתמיכה אינה מפריעה לסיבוב מוט הערבוב, ושהסל שקוע במלואו בנוזל. ואז הוציא את הסל.

השתמש בתרמוסטט מתכוונן כדי להביא את אמבט המים ל-70 מעלות צלזיוס. המתן לפחות 15 דקות לאחר הגעה לטמפרטורה הרצויה כדי להבטיח שהמכלול כולו הגיע לשיווי המשקל התרמי. לאחר מכן, הכינו 150 גרם עלי הטבק.

מניחים מנה אחת בסל תוך הימנעות מדחיסה בלתי הפיכה ונזק לעלים. למשל, על ידי קריעה. טבלו בזהירות אך במהירות את הסל בנוזל החם והניחו אותו על אריחי התמיכה.

לאחר מכן הניחו גוש נירוסטה על גבי הסל כדי למנוע ציפה. דוגרים את העלים במשך חמש דקות בנוזל הלבנה. או בחר זמן מתאים לתכנון הניסוי.

עקוב אחר טמפרטורת הנוזל במהלך כל תקופת הדגירה. לאחר הדגירה, הוציאו בזהירות את הסל מנוזל ההלבנה ותנו לעלים להתנקז למשך 30 שניות. לאחר מכן הוציאו את עלי הצמח מהסל, העבירו אותם לבלנדר והתחילו מיד במיצוי על פי פרוטוקולי הטקסט.

כדי לחמם את ה-HCPs בכלי מעורבב. העבירו אמבט מים על צלחת ערבוב מגנטית והניחו כלי נירוסטה של שני ליטר לתוך אמבט המים כך שמרכז הכלי מיושר למרכז צלחת הערבוב. הנח מוט ערבוב מגנטי בכלי הנירוסטה.

מלאו את הכלי במאגר מיצוי. ואז עם המים נטולי היונים. מלאו את אמבט המים עד חמישה סנטימטרים מתחת לקצה העליון של כלי הנירוסטה.

השתמש במכסה קצף פוליסטירן כדי לכסות אותו. לאחר מכן, הכנס מדחום לכלי הנירוסטה דרך חור מרגיע במכסה. לאחר מכן הגדר את טמפרטורת אמבט המים ל 78 מעלות צלזיוס ודגר את כל המכלול למשך 15 דקות כדי להגיע לשיווי משקל תרמי.

כאשר המכלול הגיע לשיווי משקל, רוקנו את הכלי ושפכו 300 מיליליטר תמצית לתוך הכלי כשהוא עדיין באמבט המים והפעל את הטיימר. ערבבו את התמצית ב-150 סל"ד במשך חמש דקות. ודא שהתמצית מגיעה לטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות לפחות במהלך תקופת הדגירה.

לאחר הדגירה הסירו את אמבט המים החמים מהבוחש המגנטי. הוציאו את כלי הנירוסטה והניחו אותו בדלי עם מים קרים כקרח. לאחר מכן הניחו את הדלי על צלחת הערבוב.

ודא שהומוגנט הצמח נסער היטב ב -150 סל"ד. מניחים את המדחום בתמצית ומדגרים אותו עד שהוא מגיע לטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או לטמפרטורה שצוינה. לאחר הקמת שתי אמבטיות מים בנפח עבודה של שמונה ליטר על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במים נטולי יונים למילוי האמבטיה הראשונה.

כוונו את התרמוסטט ל-74.5 מעלות צלזיוס ודגרו על המכלול למשך 15 דקות כדי להגיע לשיווי משקל תרמי. הכן כלי אחסון מבודד על ידי הנחת פלסטיק של 0.5 ליטר לכוס פלסטיק של ליטר אחד. והשתמש בחומר בידוד כמו צמר גפן כדי למלא את החסר.

באמצעות צינורות LS24, חבר את מחליף החום למשאבה פריסטלטית בקצה אחד, ולצינור יציאה בקצה השני. הנח את שני קצוות הצינורות יחד עם המדחום בכלי האחסון המבודד. ומלא אותו ב-300 מילימטרים של מאגר מיצוי.

לאחר מכן, הכניסו את מחליף החום לאמבט המים החמים, והפעל את המשאבה הפריסטלטית בקצב של 300 מיליליטר לדקה. לאחר שלוש דקות, ודא שהטמפרטורה המתקבלת בכלי היא 70 מעלות צלזיוס. כ-4.5 מעלות צלזיוס מתחת לנקודת ההגדרה של אמבט המים.

השליכו את מאגר המיצוי מהכלי המבודד, והכינו 300 מיליליטר של תמצית הצמח. ואז עם אליקוט אחד, מלא את הכלי המבודד. כעת שאבו את תמצית הצמח דרך מחליף החום במהירות של 300 מיליליטר לדקה למשך חמש דקות.

לאחר מכן ודא שטמפרטורת התמצית היא 70 מעלות צלזיוס לאחר שלוש דקות או שווה לטמפרטורה שיש למצוא בתכנון הניסוי. לאחר חמש דקות, העבירו את מחליף החום לאמבט המים הקרים כקרח. ודא שטמפרטורת התמצית נמוכה מ-30 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך.

הסר את צינור הכניסה המחובר למשאבה הפריסטלטית מהכלי המבודד. והמשך לשאוב כדי לאסוף תמצית צמחים משקעת חום שיורית מתוך מחליף החום. ואז עצור את המשאבה.

כדי לבצע סינון שקיות של תמצית הצמח, התקן מסנן שקית לתוך סל התמיכה המתאים המותקן בבית המסנן. מניחים כלי ליטר אחד מתחת לסל ומורחים את התמצית על השקית בקצב של 150 מיליליטר לדקה. לאחר הסינון, השתמש במד עכירות כדי למדוד את העכירות של דילול של 1 עד 10 של סינון במאגר מיצוי.

בחר דגימה של מיליליטר אחד ועבד את תסנין השקית. לדוגמא, באמצעות סינון עומק וכרומטוגרפיה. נתח עוד את המדגם על פי פרוטוקול הטקסט.

משקעי חום של חלבוני תא מארח על ידי הלבנה מפחיתים את סך החלבון המסיס או ה-TSP ב-96 פלוס מינוס אחוז אחד. הלבנה החזירה עד 83 פלוס או מינוס אחוז אחד של DsRed ו-51 אחוז מחלבון המטרה Vax8. הגדלת טוהר הגוף מ-0.1 אחוז ל-1.2 אחוז לפני ההפרדה הכרומטוגרפית.

קיבולת המסנן ירדה בטמפרטורות גבוהות מ-63 מעלות צלזיוס. שניתן לטפל בהם על ידי הוספת פלוקולנטים לאחר מיצוי חלבון ועזרי סינון לאחר סינון השקיות. כלי מעורבב למשקעי חום הסיר מקסימום 84 פלוס מינוס אחוז HCPs.

השגת טוהר של 0.33 פלוס מינוס 0.02 אחוז עבור Vax8 ו-20.2 פלוס מינוס 1.4 אחוז עבור DsRed. בניגוד להלבנה ולהגדרת מחליף החום, משקעי HCP בכלי מגדיל את יכולת סינון העומק במורד הזרם פי 2.5. משקף את הכוחות הנמוכים יותר בכלי בהשוואה לשאיבת תמצית דרך מחליף החום או הומוגניזציה לאחר הלבנה.

כ-88.3 פלוס מינוס 0.7 אחוז מתכולת ה-HCP הוסרו באופן עקבי מהתמצית באמצעות מחליף חום בין 60 ל-70 מעלות צלזיוס. השגת טוהר של 0.31 פלוס מינוס 0.01 אחוז עבור Vax8. ו-27.6 פלוס מינוס 2.0 אחוזים עבור DsRed.

לבסוף, מחליף החום השיג גם את קיבולת סינון העומק הנמוכה ביותר במורד הזרם. הבהרת 13.5 פלוס מינוס 6.0 ליטר למ"ר בלבד לפני הסתימה. לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך פחות מ-50 דקות בתוספת דגימה אם היא מבוצעת כראוי.

כשאתם מנסים את השיטה הזו, חשוב לזכור לוודא שחלבון המטרה יציב בחום. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כרומטוגרפיה על מנת לטהר עוד יותר את המוצר לרמה הנדרשת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הצמח על ידי טכנולוגיה לחקור את הטיהור של חלבונים מועמדים לחיסונים ומיני ניקוטיאנה.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לזרז חלבוני תא מארח צמחי באמצעות הלבנה, כלי מעורבב או מחליף חום.