מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה
6 באוגוסט 2018
הפעילות האנזימטית מתרחשת של לקטאז חיוני קטבולי עיבוד דו-סוכר חלב (לקטוז). כאן, הפעילות של לקטאז נמצאו ב תוספי מזון הוא לבדיקה באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים. הדבר מספק לתלמידים פלטפורמה ניסיוני להבנת הפעילות של קינטיקה לקטאז, אנזים.
שיטה זו היא כלי שימושי להכיר לתלמידים את המושגים השולטים בתגובות אנזימים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מתאימה לסטודנטים עם מעט מאוד ניסיון במעבדה רטובה, ומספקת תוצאות חזקות לתלמידים להתבונן ולפרש. כדי להתחיל את הפרוטוקול, סמן מתלה צינור של 15 מיליליטר.
מרסקים טבלית לקטאז אחת המכילה 200 מיליגרם אנזים לאבקה אחידה בעזרת מכתש ועלי. הנח את האבקה המתקבלת לתוך הצינור המסומן והשעיה אותה מחדש ב -10 מיליליטר של מי מלח פוספט 100 מילי-מולרי, או PBS. מערבולת את התמיסה למשך דקה אחת כדי למקסם את מיצוי האנזים.
לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד מהמתלה לצינור של 1.5 מיליליטר וסובבו את הדגימה למשך דקה אחת ב-10,000 פעמים G כדי לשקוע את החלקיקים המוצקים. העבירו 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט לשפופרת נקייה של 1.5 מיליליטר עם הכיתוב תמצית לקטאז. הנח 390 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי PBS לתוך צינור של 1.5 מיליליטר שכותרתו תגובה A.לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ONPG של חמישה מילי-מולרית וערבב היטב על ידי מערבולת.
הוסף 10 מיקרוליטר תמצית לצינור התגובה A ומערבל את התוכן. התבונן בתערובת התגובה לעתים קרובות במשך חמש דקות ושים לב לכל שינוי קולורימטרי של התמיסה. הגדר שני צינורות של 1.5 מיליליטר, אחד מסומן תגובה B, אחד מסומן בקרה.
הוסף 390 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי PBS לצינור התגובה B, 400 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי PBS לצינור הבקרה, ולאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של חמישה מילי-מולרי ONPG לכל צינור. מערבבים את התוכן על ידי מערבולת. הוסף 10 מיקרוליטר תמצית לקטאז לצינור התגובה B, ערבב על ידי מערבולת ואפשר לתגובה להמשיך במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר שחלפה דקה אחת, הוסף 500 מיקרוליטר של נתרן פחמתי מולארי אחד לשני הצינורות כדי לעכב את אנזים הלקטאז על ידי הגדלת ה-pH, ועצירת התגובה. מעבירים 500 מיקרוליטר מכל צינור לקובטות ספקטרופוטומטר נקיות ומודדים את הספיגה ב-420 ננומטר. הגדר שלושה צינורות בקרה ושלושה צינורות תגובה וסמן אותם ארבע מעלות צלזיוס, טמפרטורת החדר ו-37 מעלות צלזיוס.
לאחר הוספת תמצית האנזים, יש לדגור צינור אחד על קרח, אחד בטמפרטורת החדר ואחד ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים שחומם מראש למשך דקה. לאחר מכן עצרו את התגובה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של נתרן פחמתי מולארי אחד לכל צינור. מדוד את הספיגה ב-420 ננומטר עבור כל צינור.
רשום את הערכים, והפחית את ערך הבקרה מערך התגובה בכל מקרה. באמצעות הפרוטוקול, הבקרה נשארת ברורה בעוד שתמיסת התגובה המכילה תמצית מטבלית הלקטאז הופכת לצהובה כאשר ONPG עובר הידרוליזה, ומשחרר אורתו-ניטרופנול. לאחר ניתוח דגימות באמצעות הספקטרופוטומטר, ייצור האורתו-ניטרופנול הוא הנמוך ביותר כאשר התגובה מודגרת על קרח והגבוה ביותר כאשר התגובה מתבצעת ב-37 מעלות צלזיוס.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתגובות יהיו בטמפרטורה המתאימה לפני הוספת תמצית האנזים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקה קולורימטרית למדידת הפעילות האנזימטית של לקטאז, החיונית לעיכול לקטוז. השיטה תוכננה עבור סטודנטים עם ניסיון מינימלי בעבודה במעבדה רטובה, ובכך מאפשרת להם לצפות בקינטיקה של אנזימים ולפרש אותה ביעילות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- קינטיקה של אנזימים
- הוראה בטכניקות מעבדה
רקע
- לקטאז הוא אנזים המפרק לקטוז לגלוקוז וגלקטוז.
- הבנת הפעילות האנזימטית היא בסיסית בביוכימיה ובתחומים קשורים.
- בדיקות קולורימטריות מספקות ייצוג חזותי של תגובות אנזימטיות.
- שיטה זו נגישה לסטודנטים בעלי ניסיון מעבדתי מוגבל.
מטרת המחקר
- הכרת קינטיקה של אנזימים עבור סטודנטים באמצעות ניסוי מעשי.
- אספקת שיטה מהימנה למדידת פעילות לקטאז.
- העמקת ההבנה בנוגע לגורמים המשפיעים על תגובות אנזימטיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמצית לקטאז מתוספי תזונה.
- מדידה קולורימטרית של ייצור ortho nitrophenol.
- השוואת פעילות אנזימטית בטמפרטורות שונות.
- שימוש בספקטרופוטומטריה לכימות שינויים בבליעה.
תוצאות עיקריות
- תערובת התגובה הופכת לצהובה כאשר ONPG עובר הידרוליזה על ידי לקטאז.
- פעילות האנזים היא הגבוהה ביותר ב-37 degrees Celsius והנמוכה ביותר על קרח.
- דגימות ביקורת נשארות שקופות, מה שמאשר את הספציפיות של הבדיקה.
- התוצאות מדגימות את השפעת הטמפרטורה על קינטיקה אנזימטית.
מסקנות
- הבדיקה הקולורימטרית מדגימה ביעילות את פעילות הלקטאז.
- שיטה זו מתאימה למטרות לימודיות בביוכימיה.
- הבנת קינטיקה של אנזימים חיונית למחקרים עתידיים בתהליכים מטבוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
פרוטוקול לימודי זה מדגים בדיקת פעילות אנזימטית בסיסית באמצעות לקטאז, מטרה רלוונטית טיפולית בהפרעות במערכת העיכול. השיטה הקולורימטרית מספקת גישה ניתנת להרחבה ולשחזור להוראת עקרונות של קינטיקה אנזימטית, הישימים לתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ולפיתוח בדיקות במחקר ופיתוח של ביו-פארמה. באמצעות קישור התפקוד האנזימטי לסובסטרט בעל משמעות קלינית (ONPG), הבדיקה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית ובביטחון ניבוי באסטרטגיות טיפוליות המכוונות לאנזימים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת תפקוד אנזים הלקטאז וספציפיות לסובסטרט, ובכך תומך בבדיקת היפותזות על מטרות במודלים של מחלות במערכת העיכול.
- ערך תפעולי: משתמש בלקטאז זמין מסחרית מתוספי תזונה, ומספק מערכת נגישה ובעלת עלות נמוכה למחקרי מעורבות מטרה ראשוניים.
- ערך ניבוי: מדידות בולענות כמותיות ב-420 nm מאפשרות הערכה של פעילות האנזים תחת תנאים משתנים, מה שמספק מידע על קשרי מבנה-פעילות ובדיקה של מועמדים מובילים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: התגובה הצבעית המבוססת על ONPG מייצרת תוצר צהוב ניתן למדידה (ortho-nitrophenol), המאפשר קריאות התואמות לסריקה בקיבולת גבוהה (high-throughput) של עיכוב או הפעלה של אנזימים.
- שחזור: מיצוי סטנדרטי מטאבלטים ותנאי דגירה מבוקרים (קרח, טמפרטורת החדר, 37°C) מבטיחים תוצאות עקביות בין חזרות, ובכך תומכים בחוסנה של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: פורמט פשוט מבוסס מבחנות עם זיהוי ספקטרופוטומטרי מאפשר התאמה לפלטפורמות של פלטות רב-בארים לסריקת ספריות של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: חסר בלקטאז קשור ישירות לאי-סבילות ללקטוז, מה שהופך את הבדיקה הזו לכלי רלוונטי להערכת טיפולים להחלפת אנזימים או התערבויות תזונתיות.
- המשכיות תרגומית: פרופיל פעילות תלוי טמפרטורה (הנמוך ביותר על קרח, הגבוה ביותר ב-37°C) משקף תנאים פיזיולוגיים, ומסייע בחיזוי התנהגות האנזים in vivo.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: הבחנה ברורה בין מבחנות התגובה למבחנות הביקורת מאשרת את ספציפיות הבדיקה, ומפחיתה סיכונים לתוצאות חיוביות שגויות בתיקוף טיפולי בהמשך.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקת פעילות הלקטאז משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בתיקוף המטרה באמצעות מדידה תפקודית של האנזים, ומאפשרת פיתוח בדיקות למסעות סריקה המתמקדים במטרות במערכת העיכול.
- ביולוגיה של גילוי: מודד הידרוליזה של ONPG המתווכת על ידי לקטאז כדי להעריך את תפקוד האנזים, ובכך תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של הלקטאז כמטרה טיפולית.
- סריקה: מייצר פלטים כמותיים וקולורימטריים המתאימים להערכת השפעות של מודולטורים בתהליכי עבודה של סריקה ממוקדת אנזימים.
- אנליטיקה: מדידה ספקטרופוטומטרית ב-420 nm מספקת נתונים אובייקטיביים להשוואת פעילות אנזימטית בין תנאים שונים, מה שמאפשר בחירת מובילים (hits) מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פעילות האנזים למטבוליזם של לקטוז, ובכך מחבר ממצאים in vitro לרלוונטיות קלינית בהפרעות ספיגה.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי (vortex, צנטריפוגה, ספקטרופוטומטר), מה שמקל על אימוץ רחב בקרב צוותי גילוי וצוותים פרה-קליניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי אינטראקציות בין אנזים לסובסטרט, מה שמעלה את רמת הוודאות לגבי המטרה ומפחית עמימות בשלבי התיקוף המוקדמים של המטרה.
- ערך תפעולי: עושה שימוש בשלבים חסונים וסטנדרטיים (מיצוי מטבליות, סנטריפוגציה, אינקובציה בטמפרטורה מבוקרת) המבטיחים הדירות ושונות מינימלית.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתוני פעילות כמותיים וברורים המפחיתים את ההסתמכות על סממנים עקיפים או חליפיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של התערבויות המכוונות ל-lactase בהתבסס על פרופילי פעילות אמפיריים בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מיומנויות ביוכימיות בסיסיות בטיפול באנזימים, ספקטרופוטומטריה והכנת תמיסות.
- תלוי בגישה לספקטרופוטומטר המסוגל למדוד בליעה ב-420 nm ובצנטריפוגה להצללת על-נוזל.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת התמצית ותזמון התגובה כדי להבטיח תוצאות עקביות בין משתמשים ומנות שונות.
- התאמה לאנזימים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הסובסטרט והבופר, מכיוון שהספציפיות של ONPG מוגבלת לפעילות גלקטוסידאז.
- שינוי pH באמצעות הוספת נתרבן (sodium carbonate) הוא קריטי לסיום התגובה; השבטה לא מלאה עלולה להשפיע על דיוק הבליעה.
