Name: מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: למד כיצד לפתח מעבירים כימיים סינתטיים המאפשרים תקשורת בין חלבונים באמצעות PDGF aptamer ומעכב GST דו-ערכי. שיטה זו מדגימה אפשרויות תרפיות חדשות בהנדסת חלבונים וביוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי קרן מינרווה, ארגון HFSP, ומענק המועצה האירופית למחקר (החל גרנט 338,265).

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling%E2%80%942000+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li>
<li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li>
<li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+signal+transduction+therapy%3A+a+futuristic+approach+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li>
<li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li>
<li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules%3A+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li>
<li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Tango%3A+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li>
<li>Meyer, C., Köhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+T%C3%AAte-%C3%A0-T%C3%AAte+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li>
<li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li>
<li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+signaling+at+will%3A+chemically-inducible+dimerization+%28CID%29+techniques+resolve+problems+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li>
<li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+over+protein-protein+interactions%3A+beyond+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li>
<li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li>
<li>Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li>
<li>Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li>
<li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li>
<li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li>
<li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li>
<li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular%2C+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li>
<li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li>
<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הצגנו שיטה לתכנון ובדיקה של 'מתמר כימי' שיכול לגרום לתקשורת מלאכותית בין שני חלבונים שאינם קשורים באופן טבעי, GST ו-PDGF, מבלי לשנות את החלבונים המקומיים. ניתן לזהות את התקשורת הלא טבעית של GST-PDGF בזמן אמת על ידי שימוש במבחנים אנזימטיים העוקבים אחר השינויים בפעילות ה-GST בנוכחות 'המתמר הכימי' והגדלת ריכוזי ה-PDGF. בנוסף לזיהוי הפעלת GST על ידי PDGF, בדיקות אלה שימשו למעקב אחר השבתת GST על ידי aptamer מתחרה, כמו גם מחשוף בתיווך PDGF של פרו-תרופה אנטי-סרטנית. תוארו קושרי חלבון אחרים הניתנים להחלפה שיכולים לשלוט בפעילות ה...

מסלולי העברת אותות לשחק תפקיד משמעותי כמעט בכל תהליך הסלולר המאפשרים לתא להגיב לאותות סביבתיים במהירות. 1 מסלולים אלה הם בדרך כלל מופעלים על ידי הקשירה של מולקולת איתות קולטן תאי, שתוצאתה הפעלה של אנזימים תאיים. הגברת התפשטות של האיתותים בתוך התא מתווכת על ידי הפונקציה של איתות חלבונים יוצרים רשת של אינטראקציות בין חלבונים שבו אנזימים מופעלים הפיך עם סגוליות גבוהות. בגלל חוסר ויסות של רשתות אלה לעיתים קרובות מוביל להתפתחות סרטן, חלה התעניינות רבה בהקמת &#39;טיפול הולכת אותות של סרטן&#39;, 2 לפיה תרופות נועדו לשבש מסלולי איתות ממאיר. הצענו לאחרונה גישה חלופית לאותת טיפול תמרה המסתמך על היכולת של תרופות כדי ליצור מסלולי העברת אותות טבעיים. <sup&gt; 3 בפרט, אנו מאמינים כי על ידי עיצוב סוכנים סינטטיים המחקים את תפקודם של חלבוני איתות, אפשר יהיה לווסת את הפונקציה של התא בעקיפין. לדוגמא, רשתות המלאכותיות אלה עשויות לאפשר סמנים ביולוגיים חלבון להפעיל אנזימים לבקע prodrugs. לחלופין, mimetics חלבון איתות אלה יוכל להפעיל מסלולי איתות תאי טבעי, וכתוצאה מכך השפעות טיפוליות. כדי להוכיח את ההיתכנות של גישה זו, יצרנו לאחרונה &#39;מתמר כימי &quot;סינתטי 4 המאפשר גורם גדילה הנגזרות טסיות (PDGF) כדי לעורר את המחשוף של prodrug נגד סרטן על ידי הפעלת גלוטתיון-s-transferase (GST), אשר הוא לא שותף המחייב טבעי. המבנה של &quot;מתמר&quot; זה מורכב aptamer DNA אנטי PDGF כי הוא שונה עם מעכב הדו-ערכי עבור GST. לפיכך, סוכן סינתטי זה שייך למשפחה של מולקולות עם אתרי הקישור כדיחלבונים שונים, 5-7 כגון מעוררים כימיים של dimerization (מספרי CID) 8-10 וגם לקבוצת חלבון-קלסרים מבוססת על conjugates מולקולה סינטטי oligonucleotide. 11-21 העקרונות הכלליים שבבסיס העיצוב של מערכות כאלה מתוארים במסמך זה ו פרוטוקולים מפורטים סינתזה ובדיקת התפקוד של זה &#39;מתמר&#39; עם מבחני האנזימטית קונבנציונליים מסופקים. עבודה זו נועדה להקל על פיתוח &#39;מתמרים&#39; נוסף של מחלקה זו, אשר עשוי לשמש לתווך תקשורת בין חלבונים תאיים וכתוצאה מכך, לגרום מסלולי איתות תאים מלאכותיים. איור 1 סכמטי המתאר את עקרונות ההפעלה של הסינתטי &quot;מתמר כימי &#39;שיכול לתווך תקשורת בין חלבונים טבעיים. באיור זה, א &#39;מתמר כימית&#39;, משלבת קלסרים סינטטי protEins I ו- II (קלסרים I ו- II), מאפשרים חלבון השני כדי לעורר את הפעילות הקטליטית של חלבון לי, שהוא לא שותף המחייב טבעי. בהיעדר חלבון II, מתמר נקשר לאתר הקטליטית של האנזים (אני חלבון) ומעכב את פעילותו (איור 1, המדינה השנייה). הכריכה של &quot;מתמר&quot; לחלבון השני, לעומת זאת, מקדם אינטראקציות בין לי קלסר ועל פני השטח של חלבון II (איור 1, מדינת iii), אשר מפחית זיקה כלפי I. חלבון כתוצאה מכך, הוא הריכוז היעיל של &#39; מתמר חינם &#39;בפתרון הצטמצם, מה שמוביל דיסוציאציה של החלבון מתמר שאני מורכב וכדי מחדש של חלבון אני (איור 1, מדינת iv). יחדיו, את הפעולות הבאות להדגיש שלושה עקרונות יסוד שביסוד העיצוב של &#39;מתמר&#39; יעיל: (1) &quot;מתמר&quot; צריך קלסר ספציפי עבור כל אחת מן מטרות החלבון, (2) betwe האינטראקציהen קלסר השני והחלבון שני צריכים להיות חזק יותר את האינטראקציה בין לי קלסר והחלבון לי, ו- (3) קלסר אני חייב להיות מסוגל לקיים אינטראקציה עם פני השטח של חלבון II. העיקרון אחרון זה לא בהכרח דורש קלסר שאני לבד תהיה זיקה גבוהה סלקטיביות לכיוון החלבון השני. במקום זאת, היא מבוססת על המחקרים עדכניים שלנו שהראו כי הבאת מולקולה סינטתית בסמיכות חלבון עשויה לקדם אינטראקציות בין מולקולה זו ועל פני השטח של החלבון. 19,22,23 <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> איור 1:. הפעלת עקרונות &#39;מתמר כימי&#39; כאשר &#39;מתמר הכימית&#39; מתווסף חלבון פעיל אני (מדינת i), הוא נקשר לאתר הפעיל שלה באמצעות קלסר לי ומעכב את פעילותו (המדינה השנייה). בנוכחות החלבון השני, לעומת זאת, לא כרוך לא כימיתransducer &#39;אינטראקציה עם חלבון II באמצעות קלסר השנייה, המקדמת אינטראקציות בין לי קלסר ועל פני השטח של חלבון II. קלסר המושרה זה I-חלבון II אינטראקציה מפחית את ריכוז יעיל של קלסר לי, מה שמוביל דיסוציאציה של שנות ה-חלבון transducer&#39; שאני מורכבים לחלבון שאני מחדש (המדינה iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a>

<table><tbody><tr><td>1-כלורו-2,4-דיניטרובנזן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td></td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>אצטניטריל</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered</td><td>Salt Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתקרינית</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione-s-transferase M1-1</td><td>המרכז הישראלי לפרוטאומיקה מבנית (מכון ויצמן למדע, רחובות, ישראל)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מופחת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקה קולורימטרית ניטראט/ניטריט קיימן</td><td>כימיקלים</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים</td><td>קרן W. M. Keck ביוטכנולוגיה באוניברסיטת</td><td></td> ייל <td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>המרכז הישראלי לפרוטאומיקה מבנית (מכון ויצמן למדע, רחובות, ישראל)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>עמוד התפלה</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 עמודות</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td><td>2695 מודול</td><td></td>הפרדה</tr><tr><td>עמודת HPLC</td><td>עמודה</td><td>Waters XBridgeTM OST C18 עמודה (2.5 &mu; M, 4.6 מ"מ ופעמים; 50 מ"מ)</td><td></td></tr> <tr><td>עמודת HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 עמודה (2.5&nbsp; &mu; M, 10 מ"מ ופעמים; 50 מ"מ)</td><td></td></tr> <tr><td>קורא צלחות</td><td>BioTek</td><td>סינרגיה H4 היברידי</td><td></td></tr></tbody></table>

מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

מסלולי העברת אותות, השולטים בתגובת התאים לאותות סביבתיים שונים, מתווכים על ידי הפונקציה של חלבוני איתות המקיימים אינטראקציה זה עם זה ומפעילים זה את זה בספציפיות גבוהה. חומרים סינתטיים המחקים את תפקודם של חלבונים אלה עשויים אפוא לשמש ליצירת שלבים לא טבעיים של העברת אותות וכתוצאה מכך לשנות את תפקוד התא. אנו מציגים קווים מנחים לתכנון 'מתמרים כימיים' שיכולים לגרום לתקשורת מלאכותית בין חלבונים מקומיים. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לסינתזה ובדיקה של 'מתמר' ספציפי, שיכול לגרום לתקשורת בין שני חלבונים שאינם קשורים: גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) וגלוטתיון-S-טרנספראז (GST). מוצג גם האופן שבו ניתן להשתמש בתקשורת PDGF-GST לא טבעית זו כדי לשלוט במחשוף של פרו-תרופה אנטי-סרטנית, מה שמצביע על הפוטנציאל לשימוש במערכות כאלה ב'טיפול בהעברת אותות מלאכותיים'. עבודה זו נועדה להקל על פיתוח 'מתמרים' נוספים מסוג זה, שעשויים לשמש לתיווך תקשורת חלבון-חלבון תוך תאית וכתוצאה מכך, לעורר מסלולי איתות של תאים מלאכותיים.

העיצוב, הסינתזה, מנגנון הפעולה של &#39;מתמר כימי&#39; שיכול לגרום תקשורת מלאכותית בין PDGF ו- GST מוצג באיור 2. המבנה של &quot;מתמר&quot; משלב aptamer PDGF DNA וכן אמיד bis-ethacrynic (BEA ), אשר הינו מעכב GST ידוע (איור 2 א). 19 קלסרים אלה מאפשרות &#39;מתמר&#39; להיקשר הן עם PDGF ו- GST זיקות שונות, כלומר, עם קבועי דיסוציאציה (K ד &#39;ים) של 26 ננומטר ו -144 ננומטר, בהתאמה . 4 בנו...

אנו מציגים קווים מנחים לפיתוח 'מתמרים כימיים' סינתטיים שיכולים לגרום לתקשורת בין חלבונים שאינם קשורים באופן טבעי. בנוסף, מוצגים פרוטוקולים מפורטים לסינתזה ובדיקה של 'מתמר' ספציפי המאפשר לגורם גדילה להפעיל אנזים מנקה רעלים וכתוצאה מכך, לווסת את המחשוף של פרו-תרופה אנטי-סרטנית.

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לעקוב ספקטרוסקופית אחר תקשורת לא טבעית בין שני חלבונים המושרה על ידי מתמר כימי סינתטי. העבודה תדגים את האפשרות לפיתוח אנלוגים סינתטיים של חלבוני איתות שיוכלו לבצע מסלולי העברת אותות שאינם קיימים בטבע. היכולת לעקוב אחר תקשורת לא טבעית בין חלבונים באמצעות ספקטרופוטומטר נפוץ עשויה לסייע בפיתוח ובשיפור התפקוד של מתמרים כימיים מלאכותיים ולהביא אותנו קרוב יותר להשגת טיפול באמצעות העברת אותות מלאכותית.המתמר הכימי מורכב מאפטמר לגורם גדילה שמקורו בטבחים (PDGF), מעכב GST של ethacrynic amide דו-ערכי, פלואורופור ומכבה (quencher). הסינתזה של המתמר הכימי לא תודגם בסרטון זה.אך הדבר מתואר בפרוטוקול הטקסט. עקרונות הפעולה של המתמר הכימי מודגמים כאן. המתמר הכימי מעכב את הפעילות האנזימטית של GST, כאשר שתי קבוצות ה-EA נקשרות לאתרי הפעילות של האנזימים.הוספה של PDGF מובילה להיווצרות של קומפלקס המתמר הכימי של PDGF. דבר זה משבש את האינטראקציה בין המתמר ל-GST, ובכך משחזר את הפעילות האנזימטית של GST. הוספה עוקבת של אפטמר PDGF לא משונה משחררת את המתמר הכימי ומאפשרת לו לעכב שוב את האנזים.לפני תחילת הניסויים לבחינת הבקרה של פעילות GST על ידי PDGF, הגדירו פרוצדורה ניסויית בקורא הלוחיות למדידה קינטית. צרו ניסוי חדש כפרוטוקול סטנדרטי. בחרו ב-Procedure כדי לפתוח את חלון הגדרות הפרוצדורה (Procedure Settings).בקישור הנפתח בחלקו העליון של החלון, בחרו את סוג הלוח (384 Plate Type) בהתאם ליצרן הלוח. בחרו Read בתפריט השמאלי. בחרו Absorbance כשיטת הגילוי (Detection Method).ונקודת סיום (Endpoint) עבור סוג הקריאה. בחלון אורך הגל, הקלידו 340 nanometers. בחרו ב-Full Plate, ובחרו את הבארות למדידה.לאחר מכן לחצו על OK כדי לסגור את חלון הקריאה (Read). בתפריט השמאלי, בחרו ב-Start Kinetic. הגדירו את זמן ההרצה (Run Time) ל-10 דקות.בחר באפשרות Minimum Intervals. לאחר מכן לחץ על OK כדי לסגור את חלון ה-Kinetic. גרור את ה-Read Line אל תוך ה-Kinetic Measurement.לחצו על כפתור Validate, ולאחר מכן על כפתור OK. שמרו את הניסוי. לחצו על כפתור Play.תיבת דו-שיח תופיע, אך אין לבחור בכפתור אישור עד שיהיה ניתן להתחיל במדידה קינטית. לאחר הגדרת קורא הלוחיות, השלב הבא הוא הכנת הדגימות למדידת פעילות GST בנוכחות התמיר הכימי ו-PDGF. כדי לבחון ארבעה ריכוזים של PDGF בשלוש חזרות, הכין ארבע דגימות שכל אחת מהן מכילה 3.25 µL של התמיר הכימי ו-3.25 µL של GST M-1.הוסיפו לכל דגימה 0, 1.2, 2.4 או 4.9 µL של PDGF בהתאמה. לאחר מכן, הוסיפו לכל דגימה את הנפח המתאים של באפר הבדיקה כדי להביא את הנפח הכולל ל-130 µL. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, העבירו 40 µL מכל דגימה לבארות של פלטת 384 בארות שקופה. העבירו כל אחת מארבע הדגימות לבארות האי-זוגיות או לבארות הזוגיות באותה שורה בלבד, כדי לאפשר שימוש במערכת פטט רב-ערוצית להוספת התסבס.בשלב הבא, השתמשו בפיפט רב-ערוצי בעל 12 ערוצים כדי להוסיף במהירות לכל דגימה 10 µL מכל סובסטרט שהוכר הרובע מראש בלוחית עם 96 בארות. ערבבו במהירות אך בעדינות, כדי למנוע היווצרות בועות. הכניסו את הלוחית באופן מיידי לקורא הלוחיות, והפעילו את המדידה הקינטית על ידי לחיצה על כפתור OK בתיבת הדיאלוג.כדי לבחון מחזורי עיכוב של הפעלת GST המתווכים על ידי התמרה כימית, הכינו חמש דגימות, שכל אחת מהן מכילה 84.5 microliters של באפר בדיקה, 3.25 microliters של התמרה כימית ו-3.25 microliters של GST M1-1. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.הוסף 3.65 µL של בופר מדידה לדגימה אחת, ו-3.65 µL של PDGF לדגימות שתיים, שלוש, ארבע וחמש. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. הוסף 3.12 µL של בופר מדידה לדגימות אחת ושתיים, ו-3.12 µL של PDGF aptamer לדגימות שלוש, ארבע וחמש.דגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. הוסיפו 24.4 µL של באפר בדיקה לדגימות אחת, שתיים ושלוש, ו-24.4 µL של PDGF לדגימות ארבע וחמש.דגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. הוסיפו 7.8 µL של באפר בדיקה לדגימות אחת עד ארבע, ו-7.8 µL של PDGF aptamer לדגימה חמש. דגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.העבירו את הדגימות לפלטה שקופה של 384 בארות. לביצוע הניסוי בשלוש חזרות, הוסיפו במהירות את התסבסב לדגימות. הכניסו את הפלטה לקורא והתחילו במדידה קינטית.כדי להתחיל את הבדיקה, הגדירו פרוצדורה ניסיונית בקורא הלוחיות למדידה קינטית כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול. הכינו שתי דגימות בשני בארות של פלטה שקופה בעלת 384 בארות. עבור כל בארה, ערבבו מיקרוליטר אחד של GST M1-1 ומיקרוליטר אחד של המתמר הכימי ב-38 מיקרוליטר של בופר בדיקה.השאירו באר ריקה בין שתי הבארות. באמצעות פיפט רב-ערוצי בעל 12 ערוצים, הוסיפו במהירות 10 µL של סובסטרט לכל בארה. ערבבו בעדינות ובמהירות כדי למנוע היווצרות בועות.הכניסו מיד את הפלטה לקורא והתחילו במדידה קינטית. כאשר קורא הפלטות נפתח לאחר 3.5 דקות, הוסיפו במהירות 1.125 µL של PDGF לאחת הבארות, ערבבו בעדינות, והחזירו את הפלטה לקורא להמשך המדידות הקינטיות. לפני הכנת הדגימות לניסוי זה, הגדירו בקורא הפלטות פרוטוקול למדידה קינטית כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול.ערכה קולורימטרית לניטריט/ניטראט תשמש למדידת ייצור תחמוצת החנקן. בפלטה בעלת 96 בארות, חלק 50 µL של באפר בדיקה (assay buffer) לכל בארה בשורה הראשונה. 70 µL של Griess One Reagent לכל בארה בשורה השנייה.ו-70 µL של Griess Two Reagent לכל באר בשורה השלישית. הכינו ארבע דגימות, שכל אחת מהן מכילה 4.8 µL של המתמיר הכימי. לדגימה הראשונה, הוסיפו 155.2 µL של באפר הבדיקה.לדגימה שתיים, הוסיפו 3.2 µL של GST M1-1, ו-152 µL של באפר בדיקה. לדגימה שלוש, הוסיפו 9.6 µL של PDGF, ו-145.6 µL של באפר בדיקה. ולדגימה ארבע, הוסיפו 3.2 µL של GST M1-1, 9.6 µL של PDGF, ו-142.4 µL של באפר בדיקה.דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. העבירו 50 µL מדגימה לכל באר בלוח שקוף בעל 384 בארות כדי לבצע את הניסוי בשלוש חזרות. העבירו את הדגימות רק לבארות האי-זוגיות או הזוגיות באותה שורה, כדי לאפשר שימוש ברב-פיפטה להוספת התסריט.הוסיפו 0.54 microliters של JS-K prodrug לכל דגימה. הוסיפו במהירות לכל דגימה 10 microliters של תמיסת glutathione, וערבבו בעדינות ובמהירות כדי למנוע היווצרות בועות. הכניסו את הפלטה לקורא והתחילו את המדידה הקינטית.מיד לאחר המדידה הקינטית, העבירו 50 µL מכל דגימה לכל באר בשורה הראשונה של פלטת 96 באערים המכילה באפר בדיקה (assay buffer). לאחר מכן, העבירו 50 µL מכל באר בשורה השנייה של הפלטה אל הבאערים בשורה הראשונה של הפלטה. ובאופן דומה, העבירו 50 µL לכל באר מהשורה השלישית של הפלטה אל הבאערים בשורה הראשונה של הפלטה.דגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור, לפני מדידת הבליעה ב-550 ננומטר. מדידת פעילות ה-GST ללא הממיר הכימי, ומדידה עם הממיר הכימי, הראו כי הממיר הכימי מעכב את פעילות ה-GST.GST מופעלת מחדש על ידי הוספה של ריכוזים עולים של PDGF למתחם ה-GST-chemical transducer. הוספות רצופות של PDGF ואפטמר PDGF לאי-מודפיה למתחם ה-GST-chemical transducer גילתה כי התקשורת בין PDGF ל-GST הייתה הפיכה. הוספת PDGF למתחם ה-GST-transducer הובילה לעלייה מהירה בפעילות ה-GST, 3.5 דקות לאחר הוספת התסריטים.בעוד שהוספת אפטמר של PDGF לתערובת של GST, PDGF והמתמר הכימי הובילה לירידה בפעילות ה-GST. תוצאות אלו מעידות כי המערכת מגיבה בזמן אמת לשינויים בסביבתה. לאחר מכן, נבדקה יכולתה של מערכת זו לשלוט בהפעלת תרופה מקדימה (prodrug) באמצעות JS-K, תרופה מקדימה נגד סרטן המופעלת על ידי GST לשחרור חנקן חמצני (nitric oxide) רעיל.מדידות של כמויות תחמוצת החנקן (nitric oxide) ששוחררו עם הוספת JS-K למתמר הכימי ולשילובים שונים של GST ו-PDGF אישרו כי רק נוכחותם של GST ו-PDGF יחד מפעילה את JS-K. כל זאת מדגים כיצד סוכן סינתטי יכול לאפשר לגורם גדילה להפעיל את הפעילות הקטליטית של Glutathione S-Transferase, אשר אינו השותף האנזימטי הטבעי שלו. לפיכך, ניתן יהיה להשתמש בביומימטיקה עתידית מסוג זה כדי לשנות את תגובת התאים לאותים סביבתיים או להקנות להם תכונות חדשות.

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

השיטה המתוארת כאן משמשת לגרימת מפל האיתות האפופטוטי בשלבים מוגדרים על מנת לנתח את הפעילות של חלבון אפקטור חיידקי אנטי-אפופטוטי. שיטה זו יכולה לשמש גם לביטוי השראה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לניתוח הפרעות עם מסלולי איתות אחרים.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכים נוגדנים לזהות שינויים איתות המסלולים במודלים שונים של הסלולר. שינויים אלה, הנגרם על ידי תרופות/היפוקסיה/אולטרא-violet אור/קרינה, או על ידי ביטוי/downregulation/הסתרה, חשובים עבור מודלים שונים של המחלה, ניתן לציין אם טיפול יהיה יעיל או ניתן לזהות מנגנונים של סמים . התנגדות.

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

למד כיצד לפתח מעבירים כימיים סינתטיים המאפשרים תקשורת בין חלבונים באמצעות PDGF aptamer ומעכב GST דו-ערכי. שיטה זו מדגימה אפשרויות תרפיות חדשות בהנדסת חלבונים וביוכימיה.

מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

גלה סרטונים נוספים