מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעקוב באופן ספקטרוסקופי אחר התקשורת הלא טבעית בין שני חלבונים המושרה על ידי מתמר כימי סינתטי. הם ידגימו את האפשרות לפתח אנלוגים סינתטיים של חלבוני איתות שיוכלו לבצע מסלולי העברת אותות שאינם נמצאים בטבע. היכולת לעקוב אחר תקשורת חלבון לחלבון לא טבעית על ידי ספקטרופוטומטר משותף יכולה לעזור לפתח ולשפר את תפקודם של מתמרים כימיים מלאכותיים ולקרב אותנו להשגת טיפול בהעברת אותות מלאכותיים.

המתמר הכימי מורכב מגורם גדילה שמקורו בטסיות, או PDGF aptamer. מעכב GST אמיד אתקריני דו-ערכי, פלואורופור ומרווה. הסינתזה של המתמר הכימי לא תודגם בסרטון זה.

אבל מתואר בפרוטוקול הטקסט. עקרונות הפעולה של המתמר הכימי מומחשים כאן. המתמר הכימי מעכב את הפעילות האנזימטית של GST, כאשר שתי קבוצות ה-EA קושרות את האתרים הפעילים של האנזימים.

תוספת של PDGF מובילה להיווצרות קומפלקס המתמרים הכימיים PDGF. מה שמשבש את האינטראקציה בין מתמר ל-GST, ולכן משחזר את הפעילות האנזימטית של GST. התוספת הבאה של אפטמר PDGF לא שונה משחררת את המתמר הכימי ומאפשרת לו לעכב מחדש את האנזים.

לפני תחילת הניסויים לבחינת בקרת פעילות GST על ידי PDGF, הגדר נוהל ניסיוני בקורא הלוחות למדידה קינטית. צור ניסוי חדש כפרוטוקול סטנדרטי. בחר פרוצדורה כדי לפתוח את החלון הגדרות הליך.

ברשימה הקופצת בצד העליון של החלון, בחר את סוג לוחית 384 בהתאם ליצרן הצלחת. בחר קרא בתפריט הימני. בחר ספיגה עבור שיטת הזיהוי.

ונקודת קצה עבור סוג הקריאה. בחלון אורך גל, הקלד 340 ננומטר. בחר צלחת מלאה ובחר את הבארות למדידה.

לאחר מכן לחץ על אישור כדי לסגור את חלון הקריאה. בתפריט הימני, בחר התחל קינטי. הגדר את זמן הריצה כ-10 דקות.

בחר באפשרות מרווחי זמן מינימליים. לאחר מכן לחץ על אישור כדי לסגור את החלון הקינטי. גרור את שורת הקריאה לתוך המדידה הקינטית.

בחר בלחצן אמת ולאחר מכן בלחצן אישור. שמור את הניסוי. בחר בלחצן הפעל.

תופיע תיבת דו-שיח, אך אל תבחר בלחצן אישור עד שתהיה מוכן להתחיל את המדידה הקינטית. לאחר הגדרת קורא הלוחות, השלב הבא הוא הכנת הדגימות למדידת פעילות GST בנוכחות המתמר הכימי וה-PDGF. על מנת לבדוק ארבעה ריכוזים של PDGF בשלוש עותקים, הכינו ארבע דגימות שכל אחת מהן מכילה 3.25 מיקרוליטר של המתמר הכימי, ו-3.25 מיקרוליטר של GST M-1.

הוסף לכל דגימה, אפס, 1.2, 2.4 או 4.9 מיקרוליטר של PDGF בהתאמה. לאחר מכן הוסף את הנפח המתאים של מאגר הבדיקה לכל דגימה כדי להביא את הנפח הכולל ל-130 מיקרוליטר. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר 10 דקות, העבירו 40 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות של צלחת באר שקופה 384. העבר כל אחת מארבע הדגימות לבארות האי-זוגיות או הזוגיות באותה שורה בלבד. כדי לאפשר שימוש ברב צנרת להוספת מצע.

לאחר מכן, השתמש בצינור רב ערוצים בעל 12 ערוצים כדי להוסיף במהירות לכל דגימה 10 מיקרוליטר מכל מצע שהוכן בעבר בצלחת של 96 בארות. מערבבים במהירות, אך בעדינות, כדי למנוע בועות. הכנס מיד את הלוח לקורא הלוחות, והתחל את המדידה הקינטית על-ידי בחירה בלחצן אישור בתיבת הדו-שיח.

כדי לבחון מחזורי עיכוב הפעלת GST בתיווך המתמר הכימי, הכינו חמש דגימות, כל אחת מכילה 84.5 מיקרוליטר של מאגר בדיקה. 3.25 מיקרוליטר של מתמר כימי, ו-3.25 מיקרוליטר של GST M1-1. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.

הוסף 3.65 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לדגימה אחת, ו-3.65 מיקרוליטר של PDGF לדגימות שתיים, שלוש, ארבע וחמש. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. הוסף 3.12 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לדגימות אחת ושתיים, ו-3.12 מיקרוליטר של אפטמר PDGF לדגימות שלוש, ארבע וחמש.

דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. הוסף 24.4 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לדגימות אחת, שתיים ושלוש. ו-24.4 מיקרוליטר של PDGF לדגימות ארבע וחמש.

דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. הוסף 7.8 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לדגימה אחת עד ארבע, ו-7.8 מיקרוליטר של אפטמר PDGF לדגימה חמש. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

מעבירים את הדגימות לצלחת באר שקופה 384. לבצע את הניסוי בשלוש עותקים, ולהוסיף במהירות את המצע לדגימות. הכנס את הצלחת לקורא והתחל את המדידה הקינטית.

כדי להתחיל בבדיקה זו, הגדר הליך ניסיוני בקורא הלוחות למדידה קינטית כמתואר בטקסט הפרוטוקול. הכן שתי דוגמאות בשתי בארות של צלחת באר שקופה 384. עבור כל באר, מערבבים מיקרוליטר אחד של GST M1-1 ומיקרוליטר אחד של המתמר הכימי ב-38 מיקרוליטר של מאגר בדיקה.

השאירו באר ריקה בין שתי הבארות. בעזרת צינור רב 12 ערוצים, הוסף במהירות 10 מיקרוליטר מצע לכל באר. ולערבב בעדינות ובמהירות כדי למנוע בועות.

הכנס מיד את הצלחת לקורא והתחל את המדידה הקינטית. כאשר קורא הלוחות נפתח לאחר 3.5 דקות, הוסף במהירות 1.125 מיקרוליטר PDGF לאחת הבארות, ערבב בעדינות ואפשר לצלחת להיכנס מחדש לקורא למדידות הקינטיות הנותרות. לפני הכנת הדגימות לניסוי זה, הגדר נוהל ניסוי בקורא הלוחות למדידה קינטית כמתואר בטקסט הפרוטוקול.

ערכה קולורימטרית של ניטריט/חנקתי תשמש למדידת ייצור תחמוצת החנקן. בצלחת של 96 בארות, מחלקים 50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לבאר לשורה הראשונה. 70 מיקרוליטר של מגיב גריס אחד לבאר לשורה השנייה.

ו -70 מיקרוליטר של Griess Two Reagent לכל באר לשורה השלישית. הכן ארבע דגימות, כל אחת מכילה 4.8 מיקרוליטר של המתמר הכימי. כדי לדגום אחד, הוסף 155.2 מיקרוליטר של מאגר בדיקה.

כדי לדגום שניים, הוסף 3.2 מיקרוליטר של GST M1-1, ו-152 מיקרוליטר של מאגר בדיקה. כדי לדגום שלושה, הוסף 9.6 מיקרוליטר PDGF, ו-145.6 מיקרוליטר של מאגר בדיקה. וכדי לדגום ארבעה, הוסף 3.2 מיקרוליטר של GST M1-1, 9.6 מיקרוליטר PDGF ו-142.4 מיקרוליטר של מאגר בדיקה.

דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוצא 50 מיקרוליטר דגימה לבאר בצלחת באר שקופה 384 כדי לבצע את הניסוי בשלוש עותקים. חלק דגימות רק לבארות המוזרות או הזוגיות באותו קו כדי לאפשר שימוש ברב צינורות להוספת מצע.

הוסף 0.54 מיקרוליטר של פרו-תרופה JS-K לכל דגימה. הוסיפו במהירות לכל דגימה 10 מיקרוליטר תמיסת גלוטתיון וערבבו בעדינות ובמהירות כדי למנוע בועות. הכנס את הצלחת לקורא והתחל את המדידה הקינטית.

מיד לאחר המדידה הקינטית, העבירו 50 מיקרוליטר מכל דגימה לכל באר בשורה הראשונה של צלחת 96 הבאר עם מאגר בדיקה. לאחר מכן העבירו 50 מיקרוליטר מכל באר בשורה השנייה של הצלחת לבארות השורה הראשונה של הצלחת. ו -50 מיקרוליטר לבאר מהשורה השלישית של הצלחת לבארות השורה הראשונה של הצלחת.

יש לדגור תוך הגנה מפני אור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לפני מדידת הספיגה ב-550 ננומטר. מדידת פעילות GST ללא המתמר הכימי, ועם המתמר הכימי הראתה כי המתמר הכימי מעכב את פעילות ה-GST.

GST מופעל מחדש על ידי הוספת ריכוזים הולכים וגדלים של PDGF לקומפלקס המתמרים הכימיים GST. תוספות עוקבות של PDGF, ואפטמר PDGF לא שונה לקומפלקס המתמרים הכימיים GST, גילו כי התקשורת בין PDGF ל-GST הייתה הפיכה. הוספת PDGF לקומפלקס מתמרי GST הביאה לעלייה מהירה בפעילות ה-GST, 3.5 דקות לאחר הוספת סובסטרטים.

בעוד שהוספת אפטמר PDGF לתערובת של GST, PDGF והמתמר הכימי הביאה לירידה בפעילות ה-GST. תוצאות אלו מצביעות על כך שהמערכת מגיבה בזמן אמת לשינויים בסביבתה. לאחר מכן, היכולת של מערכת זו לשלוט בהפעלת פרו-תרופות נחקרה באמצעות JS-K, פרו-תרופה אנטי-סרטנית המופעלת על ידי GST כדי לשחרר תחמוצת חנקן רעילה.

מדידות של כמויות תחמוצת החנקן המשתחררות עם הוספת JS-K למתמר הכימי ושילובים שונים של GST ו-PDGF אישרו שרק נוכחותם של GST ו-PDGF מפעילה את JS-K. כל זה מראה כיצד חומר סינתטי יכול לאפשר לגורם גדילה לעורר את הפעילות הקטליטית של גלוטתיון S-טרנספראז, שאינו שותף האנזים הטבעי שלו. לכן ניתן להשתמש בביומימטיקה עתידית מסוג זה כדי לשנות את תגובת התאים לאותות סביבתיים או לספק להם תכונות חדשות.