עבודה עם תאים השמיעתיים HEI-OC1

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים הבסיסיים לעבודה עם תאי HEI-OC1, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעות של תרופות פרמקולוגיות על תאי השמיעה, ולסייע באפיון התפקודי של החלבון המוטורי פרסטין. תאי HEI-OC1 משמשים חוקרים רבים ברחבי העולם בניסויים שונים עם מטרות שונות ושימוש בשיטות שונות. יש לקוות שהנהלים המתוארים כאן יספקו בסיס משותף כדי להפוך את המחקרים הללו לניתנים להשוואה.

כמובן, ניתן לשפר עוד יותר את הליכי הניסוי הללו. אבל ההבדלים עם אלה המתוארים כאן יכולים להיות המפתח להבנה והסבר של תוצאות שעלולות להיות סותרות. בהדגמה זו נתאר כיצד לעבוד עם תאי HEI-OC1 החל מאליקוט קפוא ועד לדגימות מוכנות לביצוע מחקרים שונים בטכניקות זמינות באופן נרחב.

כדי להתחיל בהליך זה, הסר בקבוקון של תאי HEI-OC1 משומרים בהקפאה מחנקן נוזלי והנח אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. טבלו רק את החצי התחתון של הבקבוקון והניחו לו להפשיר עד שתישאר רק כמות קטנה של קרח בבקבוקון. בארון בטיחות ביולוגי יש לנגב את החלק החיצוני של הבקבוקון ב-70% אלכוהול.

לאחר מכן, פיפטה את התאים מהבקבוקון והעבירו את כל הנפח טיפה אחר טיפה, לאט, לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מצע גידול מחומם מראש כגון DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר מכן, הסר את ה-DMSO על ידי צנטריפוגה של הצינור למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בתשעה מיליליטר של מצע גידול טרי.

לפרק את הגושים או יריעות התאים על ידי שטף וריפלוקס של התאים התלויים בין הפיפטה למדיום שלוש עד ארבע פעמים כאשר קצה הפיפטה נוגע בתחתית הצינור. לאחר מכן, הניחו את הנפח הכולל של התאים התלויים במדיום הגידול בצלחת תרבית תאי פלסטיק לא מטופלת בקוטר 100 מילימטר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס עם 10% CO2.

בשלב זה, הסר את המדיום הישן ושטוף את התאים בשני מיליליטר PBS. לאחר מכן, כסו את שכבת התא ב-0.25% טריפסין. בדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך כאשר 40% מהם נותקו.

במידת הצורך, נדנד בעדינות את צלחת התרבית כדי לשחרר את כל התאים המחוברים שנותרו. השעו מחדש את התאים והסירו את הטריפסין על ידי צנטריפוגה של הצינור למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בתשעה מיליליטר של מצע גידול טרי. לאחר מכן, פרקו את הגושים או יריעות התאים על ידי שטף וריפלוקס של התאים התלויים בין הפיפטה למדיום, שלוש עד ארבע פעמים כאשר קצה הפיפטה נוגע בתחתית הצינור.

המשך לזרוע את התאים בכלי תרבית תאים בקוטר 100 מילימטר. דגרו אותם בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס עם 10% CO2 וחלקו אותם כמה פעמים שצריך לניסויים המתוכננים, או ליצירת מלאי חדש. לצורך התמיינות, דגרו על תאי HEI-OC1 בתנאים המתירניים עד שהם מגיעים לכ-80% מפגש.

לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שבועיים-שלושה והחליפו את המדיום כל יומיים כדי להסיר תאים מתים. התחל הליך זה על ידי ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר והתאם את ריכוז התאים לערך הנדרש. לאחר מכן, זרעו את התאים בצלחת תחתונה שטוחה שקופה של 96 בארות, צלחת לבנה עם קירות של 96 בארות, או צלחת של שש בארות.

אם נדרש על ידי הבדיקה המסוימת, דגרו על התאים למשך הלילה להצמדת מצע לפני שתטפלו בהם בתרופות המעניינות. לאחר מכן, מדוד את תוצאת הטיפול על ידי זרימה ציטומטרית או טכניקה מתאימה אחרת. כדי לקצור את התאים יש לשטוף אותם פעמיים עם 10 מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום.

הוסיפו שני מיליליטר מתמיסת הניתוק נטולת האנזים ודגרו על התאים למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את ניתוק התאים. במידת הצורך, הזיזו בעדינות את צלחת תרבית התאים כדי לנתק תאים נוספים, והקפידו לא לנער אותה.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS ופיפטה את התאים למעלה ולמטה, בעדינות, חמש פעמים. לאחר מכן, הסתכלו על התאים במיקרוסקופ. אם יותר מ -80% מהתאים כבר מופרדים, אין צורך בפיפטינג נוסף.

אם התאים עדיין באשכולות, המשיכו בפיפטינג עדין עד שיותר מ-80% מהתאים כבר לא יהיו באשכולות. בקרה אופטית של התאים צריכה להראות תאים עגולים בודדים רבים עם קצוות קרום חלקים. לאחר מכן, המשך במדידות Patch-clamp ו-NLC, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

תאי HEI-OC1 שגודלו בתנאים לא מתירניים הראו ירידה משמעותית ביותר בכדאיות התאים, ועלייה משמעותית לא פחות במוות התאים ביחס לתרביות תאים בתנאים מתירניים. מכיוון שהשפעות התרופות על תאים שכבר מתים או עם ירידה בכדאיות יכולות להיות שונות מההשפעות של אותה תרופה על תאים בריאים, יש להקדיש מאמצים ניכרים להבחין בין השפעות התרופה לבין ההשפעות של תנאי תרבית בכל מחקר ציטוטוקסיות המבוצע על תאי NP-HEI-OC1. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתאי HEI-OC1 שגודלו בתנאים מתירניים לניסויים שאינם דורשים ספציפית תאים ממויינים.

התמונות הקונפוקליות המוצגות כאן מאשרות את הביטוי של החלבון המוטורי השמיעתי פרסטין בתאי HEI-OC1 שגודלו ב-33 מעלות צלזיוס ו-39 מעלות צלזיוס. שימו לב שפרסטין אימונולוקליזציה בעיקר בציטופלזמה של תאי HEI-OC1 הגדלים בתנאים המתירניים, והוא מרוכז יותר בקרום הפלזמה בתאים הממוינים יותר. מחקרי זרימה ציטומטרית הראו עלייה ברורה בביטוי פרסטין בשני המצבים, מה שמרמז על כך שטרנסלוקציה לוותה בסינתזה של מולקולות פרסטין נוספות.

מצד שני, המחקרים האלקטרופיזיולוגיים הראו NLC חזק בתאי HEI-OC1 הגדל ב-33 מעלות צלזיוס, עם ערך שיא שירד ומתח בקיבול שיא שהשתנה לערכים הדפולריים יותר כאשר התאים הועברו לתנאים הלא מתירניים למשך שבוע ושבועיים. באופן מעניין, תוצאות אלה מצביעות על כך שהתפקוד המוטורי עלול להיפגע אם צפיפות מולקולות הפרסטין בקרום הפלזמה גבוהה מדי. חשוב לזכור שהפרוטוקולים המתוארים כאן דורשים שימוש נכון בטכניקות תרבית תאים מבוססות.

כמו כן, זכרו להימנע משימוש באנטיביוטיקה. בנוסף, זכור כי הפנוטיפ והתגובה של תאי HEI-OC1 יהיו תלויים מאוד בפרמטרי התרבית.