Name: עבודה עם תאים השמיעתיים HEI-OC1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: חקור את ההשפעות הפארמקולוגיות על תאי השמיעה HEI-OC1 ואת תפקוד החלבון prestin. פרוטוקול זה מספק בסיס סטנדרטי למחקר השמיעה ומאפשר השוואת תוצאות בין מחקרים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-DC010146 ו-R01-DC010397. תוכנו הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).</li>
<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים קיים או פוטנציאלי.

בדוח זה אנו מתארים כיצד התרבות תאים HEI-OC1 ולהשתמש בהם כדי להעריך מנגנונים של רעילות סמים ולחקור תכונות פעילות של פרסטין, המנוע המולקולרי של OHCs שבלול. הנהלים הטכניים, עם זאת, הם כלליים מספיק כדי להתאים בקלות מחקרים שונים. כל הפרוטוקולים המתוארים כאן דורשים את השימוש הנכון של טכניקות תרבית תא ומבוססות 10. בדיוק כמו עם כל שורת תאים אחרת, עבודה עם תאי HEI-OC1 דורשת מתקן תרבית תאים מצויד כראוי, עם ארון ...

אוזן בית מכון-איברים של 1 קורטי (HEI-OC1) תאים נגזרים מאיבר השמיעה של 1,2 עכבר מהונדס. דגירה של כל תא מעכבר מהונדס זה על 33 ° C / 10% CO 2 (תנאי מתירני) גרם ביטוי של גן מנציחה שמפעיל בידול דה ושגשוגם מואץ; הזזת תאים ל -39 ° C / 5% CO 2 (תנאים שאינם מתירני) להביא לפגיעה התפשטות, בידול, לפחות במקרה של HEI-OC1, מוות של תאים 2,3. תאי HEI-OC1 היו משובטים ומאופיינים במעבדה שלנו לפני למעלה מעשור, מחקרים ראשוניים הראו כי הם מביעים סמנים ספציפיים של תאי שיער שבלול, כגון פרסטין, 7 א שרירן, Atoh1, BDNF, calbindin ו calmodulin, אלא גם סמנים של תומכים תאים כמו connexin 26 ו הקולטן לגורם הצמיחה פיברובלסטים (FGF-R) 2. לכן, הוצע כי HEI-OC1 יכול לייצג common ובתאים עבור תאים חושיים ותמיכה של האיבר של קורטי 2. מחקרים מקבילים ספקו ראיות מוצקות לכך ארכיטיפי תרופות ototoxic כמו ציספלטין, גנטמיצין ו סטרפטומיצין מושרה הפעלת caspase-3 בתאים אלה, בעוד תרופות נחשבות בלתי ototoxic, כמו פניצילין, לא 2,3. לכן, שורת תא זו הוצעה כמערכת במבחנה כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים מעורבים ototoxicity ו להקרנה של ototoxicity הפוטנציאל או נכסי otoprotective של תרופות תרופתיות חדשות. ההערכה היא כי תאי HEI-OC1 שימשו יותר ממאה וחמישים מחקרים שפורסמו בעשר השנים האחרונות. בעוד מסתכל ההשפעה הפרו-אפופטוטיים הפוטנציאל של תרופות שונות היה המטרה העיקרית של רוב המחקרים שכללו את שורות תאים, תהליכים בתא חשובים אחרים כמו autophagy והזדקנות החלו רק כדי להיחקר בתאי HEI-OC1 4-7. אנינה מחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 8, השתמשנו תאים HEI-OC1 לאסוף מערך מקיף של נתונים על מוות של תאים, הישרדות, התפשטות, הזדקנות ו autophagy המושרה על ידי תרופות פרמקולוגיות שונות תדירים במרפאה. אנחנו גם בהשוואה כמה מהתגובות של תאי HEI-OC1 עם אלו של HEK-293 (תאי כליה עובריים אנושיים) והלה (תאי אפיתל אדם) מקבלים טיפול זהה. התוצאות שלנו הצביעו על כך HEI-OC1 תאים להגיב על כל תרופה בצורה אופיינית, עם dose- ייחודי ורגיש תלוי זמן לפחות אחד המנגנונים נחקרים. גם הדגשנו כי מחקר כי פרשנות נכונה של תוצאות הניסוי תדרוש ביצוע מחקרים מקבילים עם יותר מאחד טכניקה 8. במחקר אחר חקרנו את השימוש בתאי HEI-OC1 כדי להעריך את התגובה התפקודית של פרסטין, החלבון המנוע של תאי שיער חיצוניים שבלול (OHCs) 9 </sעד&gt;. דיווחנו cytometry זרימה ומחקרים מיקרוסקופיית לייזר confocal על דפוס הביטוי פרסטין, כמו גם קיבול קוי (NLC) ומחקרים ההידוק תא-תיקון כל בתאים HEI-OC1 בתרבית בשעה מתירנית (P-HEI-OC1) והלא תנאי היתר (NP-HEI-OC1). התוצאות שלנו הצביעו על כך הוא ביטוי פרסטין סך קרום פלזמת גידול לוקליזציה באופן תלוי-זמן בתאי NP-HEI-OC1. מעניין, מצאנו גם כי גידול לוקליזציה פרסטין על קרום הפלזמה של תאי NP-HEI-OC1 בקורלציה עם ירידה Na + K + ATPase, אשר translocated מן קרום הפלזמה אל הציטופלסמה ללא שינויים משמעותיים ביטוי תא כולל. בנוסף, הראינו כי P-HEI-OC1 יש לתאים NLC חזק הקשורים פרסטין תפקוד מוטורי, אשר ירד כאשר הצפיפות של מולקולות פרסטין נוכחי קרום הפלזמה גדלה. בסך הכל, תוצאות אלו תומכות התועלת של HEI-OC1 תאים לחקור חלבוני שמיעה. במאמר זה וידאו אנו מתארים כיצד תרבות תאי HEI-OC1, למה זה נוח להשתמש תאים גדלים בתנאי היתר (P-HEI-OC1) ללימודי cytotoxicity, איך להעריך את המנגנון / s של cytotoxicity-סמים ואיך לבצע מחקרים אלקטרו (למשל, תיקון- clamp, קיבול שאינו ליניארי (NLC)) לחקור תכונות פעילות של פרסטין, המנוע המולקולרי של OHCs שבלול.

<table><tbody><tr>תאי <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>כל ערכות הבדיקה, הציוד&nbsp;</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי Class II</td><td>חברת בייקר</td><td>סטרילגארד III</td><td>וחברות המצוינות</td></tr><tr><td>בצנטריפוגה המקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>2 העמודות הקודמות הן רק</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>דוגמאות, וניתן להשתמש בכל מוצר דומה אחר</td></tr> של <tr><td>Waterbath</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>.</td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>שתי (2) חממות תאים, אחת ב-33 מעלות; C/10% CO2 ואחר ב-39 מעלות; C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים, PS, 100 מ"מ x 20 מ"מ עם פתחי האוורור</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים, PS,&nbsp; 60 מ"מ x 15 מ"מ עם פתחי אוורור&nbsp;</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות סלסטאר&nbsp; 250 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות 550 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צלחת תרבית תאים 6 בארות, עם מכסה-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות Microtest, 96 באר, תחתית שטוחה עם מכסה</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 בארות לבן, תחתית שקופה</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן עם מכסה Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן עם מכסה-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, ללא פנול אדום</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, 0.25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>TACS ערכת בדיקת התפשטות תאי MTT</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 ערכת בדיקה&nbsp; Promega</td><td></td><td>&nbsp; G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת התפשטות תאים BrdU&nbsp;</td><td>איתות תאים</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת ציטוטוקסיות ירוקה Cell-Tox</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר FACSAriaIII&nbsp;</td><td>BD ביוסיינס</td><td>&nbsp; FACSAriaIII</td><td>עם עירור 488 ננומטר (לייזר כחול)</td></tr> <tr><td>סורק כתמים דיגיטלי</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>יחידת אלקטרופורזה וספיגה</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 קורא צלחות עם Soft Max Pro 5.2 תוכנה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>חולץ להכנה אלקטרודות תיקון</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

עבודה עם תאים השמיעתיים hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 הוא אחד מקווי תאי השמיעה הבודדים של עכברים הזמינים למטרות מחקר. תאים אלה, שהוצעו במקור כמערכת חוץ גופית לסינון תרופות אוטוטוקסיות, שימשו לחקירת מסלולים אפופטוטיים המופעלים על ידי תרופות, אוטופגיה, הזדקנות, מנגנון ההגנה על התאים, תגובות דלקתיות, התמיינות תאים, השפעות גנטיות ואפיגנטיות של תרופות פרמקולוגיות, השפעות של היפוקסיה, מתח רשתית חמצוני ואנדופלזמי, וביטוי של תעלות וקולטנים מולקולריים. בין שאר הסמנים החשובים של תאי שיער שבלול, תאי HEI-OC1 מבטאים באופן אנדוגני פרסטין, החלבון המוטורי הפרדיגמטי של תאי השיער החיצוניים. לפיכך, הם יכולים להיות שימושיים מאוד להבהרת היבטים פונקציונליים חדשים של חלבון שמיעתי חשוב זה. תאי HEI-OC1 הם חזקים מאוד, והתרבית שלהם בדרך כלל אינה מציגה סיבוכים גדולים. עם זאת, הם דורשים כמה תנאים מיוחדים כגון הימנעות משימוש בקוקטיילים אנטי-בקטריאליים נפוצים המכילים סטרפטומיצין או אנטיביוטיקה אחרת, כמו גם דגירה ב-33 מעלות צלזיוס כדי לעורר התפשטות תאים ודגירה ב-39 מעלות צלזיוס כדי לעורר התמיינות תאים. כאן, אנו מתארים כיצד לתרבית תאי HEI-OC1 וכיצד להשתמש בהם בכמה מבחנים אופייניים, כגון התפשטות תאים, כדאיות, מוות, אוטופגיה והזדקנות, כמו גם כיצד לבצע מדידות קיבול מהדק טלאי וקיבוליות לא ליניארית.

בעוד כמה פרסומים האחרונים דיווחנו מערך מקיף של מחקרים שמטרתם להעריך את התגובות של תאי HEI-OC1 לסמים תרופתיים כמה נפוצים כמו גם חוקר פרסטין פונקצית 8,9. במחקרים אלה עשינו שימוש כל הפרוטוקולים מתוארים בסעיפים הקודמים. אחת התוצאות של המחקרים הקודמים אלה היה כי תאי HEI-OC1 בתרבית בתנאים אוֹסְרָנִי (39 ° C / 10% CO 2 = NP-HEI-OC1) ...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) הוא אחד מקווי תאי השמיעה הבודדים של עכברים הזמינים כיום למטרות מחקר. פרוטוקול זה מתאר כיצד לעבוד עם תאי HEI-OC1 כדי לחקור את ההשפעות הציטוטוקסיות של תרופות פרמקולוגיות כמו גם את התכונות התפקודיות של חלבוני האוזן הפנימית.

עבודה עם תאים השמיעתיים HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר את הפרוצדורות הבסיסיות לעבודה עם תאי HEI-OC1, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור את השפעתן של תרופות פרמקולוגיות על תאי שמיעה, ולסייע באפיון התפקודי של חלבון המוטור prestin. תאי HEI-OC1 משמשים חוקרים רבים ברחבי העולם בניסויים שונים, למטרות שונות ובשימוש בטכניקות שונות.Bיקווה כי הפרוצדורות המתוארות כאן יספקו בסיס משותף שיהפוך את המחקרים הללו לניתנים להשוואה.כמובן, ניתן לשפר עוד יותר את ההליכים הניסיוניים הללו. עם זאת, ההבדלים ביניהם לבין אלו המתוארים כאן עשויים להיות המפתח להבנה ולהסבר של תוצאות שעלולות להיות סותרות. בהדגמה זו נתאר כיצד לעבוד עם תאי HEI-OC1, החל ממנת דגימה קפואה ועד להכנת דגימות המוכנות לביצוע מחקרים שונים באמצעות טכניקות נפוצות.כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו מבחנה של תאי HEI-OC1 קריו-שימורים מהחנקן הנוזלי והניחו אותה במקלחון במטמפטורה של 37 °C. טבלו רק את החצי התחתון של המבחנה והמתינו להפשרה עד שיישאר כמות קטנה בלבד של קרח במבחנה. בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, נגבו את החלק החיצוני של המבחנה עם 70% אלכוהול.לאחר מכן, שאי את התאים מהבקבוקון והעבר את כל הנפח טיפה אחר טיפה, באיטיות, למבחנה קונית של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של מצע גידול שחומם מראש, כגון DMEM מועשר ב-10% FBS. בשלב הבא, הסר את ה-DMSO על ידי צנטריפוגציה של המבחנה למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השלך את העילוי והשעה מחדש את התאים בתשעה מיליליטר של מצע גידול טרי.פרקו את גושי או פלטי התאים על ידי העברת התאים התלויים הלוך וחזור בין הפפיטה למצע שלוש עד ארבע פעמים, כאשר קצה הפפיטה נוגע בתחתית הפקתל. לאחר מכן, העבירו את כל נפח התאים התלויים במצע גידול לצלוחית תרבית תאים מפלסטיק לא מטופל בקוטר 100 מילימטר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 33 degrees Celsius עם 10%CO2.בשלב זה, הסירו את המצע הישן ושטפו את התאים עם 2 mL של PBS. לאחר מכן, כסו את שכבת התאים (monolayer) ב-0.25% trypsin. בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך כאשר 40% מהם השתחררו מהמשטח.במידת הצורך, נערע את צלח התרבית בעדינות כדי לשחרר תאים נותרים שעדיין דבקים. השהו את התאים והסירו את ה-trypsin על ידי סבב צנטריפוגה למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את העליון (supernatant) והשהו מחדש את התאים בתשעה מיליליטרים של מצע גידול טרי. לאחר מכן, פירקו גושים או שכבות של תאים על ידי העברה חוזרת ונשנית של התאים התלוים בין הפפיתה למצע, שלושה עד ארבעה פעמים, כאשר קצה הפפיתה נוגע בתחתית המבחנה.המשיכו לזריעת התאים בצלחות תרבית תאים בקוטר 100 מילימטר. דגרו אותם בטמפרטורה של 33 °C עם 10% CO2 וחלקו אותם כמספר הפעמים הדרוש עבור הניסויים המתוכננים, או לצורך יצירת מאגר חדש. לצורך דיפרנציאציה, דגרו תאי HEI-OC1 בתנאים המאפשרים עד שיגיעו לכ-80% confluence.לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 39 °C עם 5% CO2 למשך שבועיים עד שלושה שבועות, והחליפו את המצע מדי יומיים כדי להסיר תאים מתים. התחילו נוהל זה על ידי ספירת התאים באמצעות סופר תאים אוטומטי או המוציטומטר, והתאימו את ריכוז התאים לערך הנדרש. לאחר מכן, זרעו את התאים בלוחית בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה ושקופה, בלוחית בעלת 96 בארות עם דפנות לבנות, או בלוחית בעלת שש בארות.אם הדבר נדרש עבור הבדיקה הספציפית, הדגרירו את התאים למשך לילה להצמדת תשתית לפני הטיפול בהם בתרופות הרלוונטיות. לאחר מכן, מדדו את תוצאת הטיפול באמצעות ציטומטריה זרימה או טכניקה מתאימה אחרת. כדי לקצור את התאיים, שטפו אותם פעמיים עם 10 milliliters של PBS נטול סידן ומגנזיום.הוסיפו 2 mL של תמיסת detacher נטולת אנזימים והדגירו את התאים למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2. השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את ניתוק התאים. במידת הצורך, הניעו בעדינות את צלחת תרבית התאים כדי לנתק תאים נוספים, והיזהרו לא לנער אותה.בשלב הבא, הוסיפו 10 milliliters של DMEM בתוספת 10%FBS ושאירו את התאים למעלה ולמטה, בעדינות, חמש פעמים. לאחר מכן, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ. אם יותר מ-80% מהתאים כבר הופרדו, אין צורך בשאיבה נוספת.אם התאים עדיין נמצאים בצבירים, המשיכו בפיפוט עדין עד שמעל 80% מהתאים לא יהיו עוד בצבירים. בבדיקה אופטית של התאים יש לראות תאים עגולים בודדים רבים בעלי קצוות ממברנה חלקים. לאחר מכן, המשיכו למדידות patch-clamp ו-NLC, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.תאי HEI-OC1 שגודלו בתנאים לא מאפשרים (nonpermissive) הראו ירידה משמעותית מאוד בחיוניות התאים, ועלייה משמעותית באותה מידה במות תאים בהשוואה לתאים שגודלו בתנאים מאפשרים (permissive). מכיוון שהשפעות של תרופות על תאים שכבר גוססים או בעלי חיוניות מופחתת עשויות להיות שונות מהשפעות של אותה תרופה על תאים בריאים, יש להקדיש מאמצים ניכרים כדי להבחין בין השפעות התרופה להשפעות של תנאי התרבית בכל מחקר ציטוטוקסיות המבוצע על תאי NP-HEI-OC1. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתאי HEI-OC1 שגודלו בתנאים מאפשרים עבור ניסויים שאינם דורשים תאים מובחנים באופן ספציפי.התמונות הקונפוקליות המוצגות כאן מאששות את הביטוי של חלבון התנועה השמיעתי prestin בתאי HEI-OC1 שגודלו ב-33 degrees Celsius וב-39 degrees Celsius. שימו לב כי ה-prestin ממוקם אימונולוגית בעיקר בציטופלזמה של תאי HEI-OC1 הגדלים בתנאים המאפשרים (permissive), והוא מרוכז יותר בממברנת הפלזמה בתאים המובחלים יותר. מחקרי ציטומטריית זרימה הראו עלייה ברורה בביטוי של prestin בשני התנאים, מה שמרמז כי התעתוק לווה בסינתזה של מולקולות prestin נוספות.מצד שני, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים הראו NLC חזק בתאי HEI-OC1 הגדלים ב-33 °C, עם ערך שיא שפחת ומתח בקיבול שיא שהוסט לערכים דפולריזציוניים יותר כאשר התאים הועברו לתנאים לא מאפשרים למשך שבוע ושבועיים. באופן מעניין, תוצאות אלו מרמזות כי התפקוד המוטורי עלול להיפגע אם הצפיפות של מולקולות prestin בממברנה הפלזמית גבוהה מדי. חשוב לזכור כי הפרוטוקולים המתוארים כאן דורשים שימוש נכון בטכניקות מבוססות של תרביות תאים.כמו כן, זכרו להימנע משימוש באנטיביוטיקה. בנוסף, זכרו כי הפנוטיפ והתגובה של תאי HEI-OC1 יהיו תלויים מאוד בפרמטרי התרבית.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

מתוארים הפרוטוקולים הנוכחיים לשמירה על תאי אב אוטיים רב-פוטנטיים (iMOP) אימורטליים והתמיינות אוטית.  תנאי תרבית וסמנים מולקולריים המצביעים על התמיינות לאפיתל חושי ונוירונים של גנגליון ספירלי (SGN) מודגשים.

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

מודלים חייתיים של שתלי שבלול יכול לקדם את הידע בסיסי טכנולוגיים לטיפול אובדן שמיעה sensorineural קבוע עם גירוי חשמלי. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה עכברים, כמו גם את הערכת תפקודי עם גזע המוח השמיעתית תגובה.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

חזירים מיניאטוריים (מיני חזירים) הם מודל אידיאלי של בעלי חיים גדולים למחקר על שתלי שבלול. ניתן להשתמש בניתוח השתלת שבלול במיני חזירים כדי לספק ראיות ראשוניות לבטיחות ולביצועים הפוטנציאליים של מערכי אלקטרודות חדשניים וגישות ניתוחיות במערכת חיה הדומה לבני אדם.

החזיר המיניאטורי: מודל חייתי גדול לחקר שתל שבלול

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

חקור את ההשפעות הפארמקולוגיות על תאי השמיעה HEI-OC1 ואת תפקוד החלבון prestin. פרוטוקול זה מספק בסיס סטנדרטי למחקר השמיעה ומאפשר השוואת תוצאות בין מחקרים שונים.

עבודה עם תאים השמיעתיים HEI-OC1

גלה סרטונים נוספים