Name: תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למד פלטפורמת קריוהיסטולוגיה לניתוח רקמות מינרליות בייעול גבוה. השיטה מאפשרת דימות רב-סבבי של אותות מולקולריים בתאים ספציפיים עבור ביולוגיית שריר-שלד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להכיר במקורות המימון הבאים: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 ו-T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן הצגנו פרוטוקול cryohistology מפורט לשתף למקם ולכמת כמה צעדים ביולוגיים על ידי יישור תמונות סבבים רבים של מכתים / הדמיה על קטע יחיד. השיטה התוותה באמצעות cryotape שימושית במיוחד כפי שהיא שומרת את המורפולוגיה של קשה רקמות סעיף (למשל, עצם וסחוס mineralized). בנוסף, רקמת מחולק היא דבקה בחוזקה לשקופית זכוכית, המאפשר סבבים רבים של מכתים / הדמיה של אותו סעיף; בניגוד לשיטות מסורתיות שם קטעי סדרה הם כל מוכתם בפרוטוקול אחר. באמצעות קטעי סדרה יכול להוות בעיה כאשר מנסים לשתף בתרג...

מחקר ביולוגי לעתים קרובות דורש phenotyping ביותר, אשר מזוהה לעתים קרובות עם איזשהו ניתוח היסטולוגית 1-3. צורך זה בולט עוד יותר עם ​​פרויקטים שאפתניים לשבש כל גן של העכבר הגנום 4. ניתוחים היסטולוגית אלו יכולים לנוע בין הערכת מורפולוגיה תאים ו / או תכונות אנטומיות לביטוי מיפוי של גנים ספציפיים או חלבונים בתאים בודדים. למעשה, אחת תרומות יסוד של היסטולוגיה לתחום הגנומיקה היא היכולת לקשר בין אות מולקולרית ספציפית לסוג באזור או תאים ספציפי. שיטות מסורתיות של היסטולוגיה, במיוחד עבור רקמות שריר-שלד, הם בדרך כלל זמן רב ומייגע, מחייב לפעמים שבועות כדי לתקן, decalcify, סעיף, כתם, ותמונת הדגימה מכן לנתח את התמונות באמצעות פרשנות אנושית. ניתוח אותות מולקולריים מרובים, אם באמצעות אימונוהיסטוכימיה, באתרו hybridizatיון, או כתמים מיוחדים, דורשים סעיפים רבים, ואפילו דגימות מרובות לביצוע כראוי. בנוסף, מספר תגובות האפשריות אלה לא יכולים להיות שותף מקומי לאותו תא ולפעמים לא יכול להיות שותף מקומי לאזור מסוים בתוך דגימה נתונה. ככל שתחום גנומיקה epigenomics נע לתוך העידן הדיגיטלי, בתחום היסטולוגית חייב גם בעקבותיהם לספק תפוקה גבוהה ביותר, וניתוח אוטומטי של מגוון של אותות מולקולריים בתוך קטע היסטולוגית יחיד. אכן, יש ביקוש עבור טכניקות היסטולוגית משופרות שיכול לשייך אותות מולקולריים מרובים תאים ספציפיים בתוך דגימה נתונה. לאחרונה, פרסמנו שיטת cryohistological תפוקה הגבוהה חדשה להערכת אמצעי מענה כמה בתוך קטע נתון מרקמות mineralized 5-14. התהליך כרוך לייצוב cryosection עם cryotape הקפוא, דבקות בסעיף המודבק נוקשה לשקופית מיקרוסקופ, וניצוח מספר סבבי מכתים והדמיה על כל מקטע. הסיבובים האלה של תמונות אז מיושרים באופן ידני או באמצעות אוטומציה המחשב לפני ניתוח התמונה (איור 1). כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של תהליך זה ולספק דוגמאות בהן טכניקות אלה שיפרו את הבנתנו של תהליכים ביולוגיים שונים.

<table><tbody><tr><td>10% פורמלין ניטרלי</td><td>חומצי סיגמא אולדריץ'</td><td>HT501128-4L</td><td>מספר ספקים זמינים. רעיל. ניתן להחליף ב-4% פרפורמלדהיד.</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9378</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>ניתן להשתמש בגדלים שונים בהתאם לרקמה</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>ניתן להחליף בקריומטריה אחרת. עם זאת, שרפים מבוססי PVA/PEG עבדו הכי טוב בידיים שלנו.</td></tr><tr><td>2-מתיל-בוטאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M32631</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr>ניתן להחליף את <td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>במותגים/דגמים אחרים.</td></tr><tr><td>דיסק דגימה</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.</td></tr><tr><td>להבי Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.</td></tr>ניתן להחליף את <tr><td>Cryotape</td><td>Section Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Roller</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-46</td><td>במותגים/דגמים אחרים.</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ פלסטיק</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>71890-01</td><td>ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.</td></tr><tr><td>דבק אופטי נורלנד, 61</td><td>דבק אופטי נורלנד אופטי</td><td>נורלנד, 61</td><td></td></tr><tr><td>אור שחור UV</td><td>ג'נרל אלקטריק</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>ARK2183</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופים אדומים InSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>InSpeck green microspheres</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>קומפלקס אליזרין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3882&nbsp;</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>דמקלוציקלין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D6140&nbsp;</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5516</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>ELF 97 מצע פוספטאז חומצה פלואורסצנטית צהובה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>מספר ספקים זמינים. ניתן להחליף ב-Hoechst 33342 או בצבעים גרעיניים אחרים.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (כתם נגד גרעיני Cy5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>נתרן אצטט נטול מים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>נתרן טרטרט דו-בסיסי דיהידרט&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T6521</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>נתרן ניטריט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2252</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>מהיר אדום TR מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F8764</td><td>מספר ספקים זמינים. ניתן להחליף גם בערכות מצע אחרות כגון Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N4875</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>N,N dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>טולואידין כחול O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>ניתן להשתמש גם בסורקים ליניאריים או אריחים אחרים.</td></tr><tr><td>סט מסנני DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>סט מסנני CFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>סט מסנני GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>סט מסנני YFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>סט מסננים צהוב מותאם אישית (ELF 97)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>מנהג; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC סט מסננים</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 סט מסננים</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane מערכת העברת קלטות</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>62800-10</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>CryoJane קלטת חלונות</td><td>אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה</td><td>62800-72</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>CryoJane דבק שקופיות אלקטרונים</td><td>מדעי מיקרוסקופיה</td><td>62800-4X</td><td>מספר ספקים זמינים.</td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה, multi-תמונה cryohistology של רקמות mineralized

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

יש צורך הולך וגובר בפנוטיפ והיסטופתולוגיה יעילים של מגוון רקמות. הצורך הזה בפנוטיפ ניכר בפרויקטים השאפתניים לשבש כל גן בגנום העכבר. קהילת המחקר זקוקה לאמצעים מהירים וזולים לפנוטיפ רקמות באמצעות היסטולוגיה. ניתוחים היסטולוגיים של רקמות השלד הם לרוב גוזלים זמן וכמותיים למחצה במקרה הטוב, ודורשים באופן קבוע פרשנות סובייקטיבית של שקופיות מאנשים מאומנים. כאן, אנו מציגים פרדיגמה קריוהיסטולוגית לפנוטיפ יעיל וזול של רקמות מינרליות. ראשית, אנו מציגים שיטה חדשה של הקפאה מיוצבת סרט המשמרת את המורפולוגיה של רקמות מינרליות. לאחר מכן חלקים אלה מודבקים בצורה נוקשה לשקופיות זכוכית ומצולמים שוב ושוב על פני מספר סבבי צביעה. לאחר מכן, התמונות המתקבלות מיושרות באופן ידני או באמצעות תוכנת מחשב כדי להפיק ערימות מורכבות של מספר תמונות בשכבות. הפרוטוקול מאפשר לוקליזציה משותפת של אותות מולקולריים רבים לתאים ספציפיים בתוך קטע נתון. בנוסף, ניתן לכמת את האותות הפלואורסצנטיים הללו באופן אובייקטיבי באמצעות תוכנת מחשב. פרוטוקול זה מתגבר על רבים מהחסרונות הקשורים להיסטולוגיה של רקמות מינרליות ויכול לשמש פלטפורמה לפנוטיפ בעל תפוקה גבוהה ותכולה גבוהה של רקמות שריר ושלד בתנועה קדימה.

עבודה כללית עבור התפוקה הגבוהה, רבה-תמונת Cryohistology איור 1 מייצג את זרימת העבודה הכללית המשמשת עבור טכניקה זו. היא כוללת מספר צעדים מן הקיבעון דרך מספר סבבי ההדמיה ולבסוף יישור תמונה / ניתוח. התהליך יכול לקחת קצת כמו בשבוע לצאת מן הקיבעון מדגם דרך 4 סיבובים של הדמיה, המהווה פחות זמן ממה שנדרש כדי decalcify אלה ...

בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמת קריוהיסטולוגיה אוטומטית למחצה בעלת תפוקה גבוהה להפקת תמונות מרוכבות מיושרות של מדדי תגובה מרובים ממספר סבבים של הדמיה פלואורסצנטית על חלקים קפואים של רקמות מינרליות.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

מטרתה של טכנולוגיה זו היא לספק כלים היסטולוגיים המשלבים מערכות מודל מורכבות באופן בעל תפוקה גבוהה, בלתי תלוי-צופה ודיגיטלי לחלוטין, שהוא גם חסכוני ובעל משמעות עבור ביולוגים של מערכת השלד והשרירים. היסטולוגיה, למרות היותה קריטית עבור רוב החוקרים הביולוגיים, היא לרוב עתירת עבודה ואינה כמותית. לכן, קיים צורך בטכניקות היסטולוגיות המספקות ניתוח יעיל, בעל תפוקה גבוהה ואוטומטי.בעזרת פלטפורמת הקריוהיסטולוגיה שלנו, החוקר יכול לשייך מספר אותות molecro לתאים ספציפיים בתוך דגימה נתונה, על ידי הדמיה וצביעה של אותה שקופית מספר פעמים באופן בעל תפוקה גבוהה. את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Xi Jiang ו-Li Chen, עוזרי מחקר במעבדתי, שהובילו את הפיתוח והביצוע של טכניקות אלו. כדי להתחיל בפרוצדורה, הוציאו את הדגימה מהפורמלין, הסִירו רקמות עודפות, והעבירו ל-30% sucrose, שהומס ב-1x PBS.דגרו את הדגימות בסוכרוז למשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מלאו תבנית הקפאה (cryomold) בתווך קיבוע להקפאה והניחו את הדגימות בתבנית. לאחר מכן, יישרו את הדגימות בתבנית כך שמישור החיתוך עבור האזור הרלוונטי יהיה מקביל לתחתית התבנית.לאחר מכן, הניחו את תבנית ההקפאה (cryomold) על פיסת קרח יבש עד ששכבה דקה של תוך הקפאה (cryoembedding medium) קופאת ומקבעת את הדגימות במקומן. לאחר מכן, מלאו את שאר נפח תבנית ההקפאה בתוך הקפאה, תוך השארת תבנית ההקפאה על גבי כדור קרח יבש. לאחר מכן, הניחו את תבנית ההקפאה בתוך מיכל המכיל 2-methylbutane שקולל מראש באמצעות קרח יבש.לאחר שהדגימות קפואות לחלוטין, הסיר את תבנית הקירור (cryomold) ונער כדי להסיר עודפי 2-methylbutane. עטוף את תבנית הקירור בצלופן ואחסן אותה בטמפרטורה של 20- °C או 80- °C. בהליך זה, העבר את בלוק הדגימה מהמקפיא לקריוסטט המכוון לטמפרטורה של 20- עד 25- °C.בשלב הבא, הוצא את הבלוק מהתבנית לקריו-הטמעה (cryomold) וגזור את עודפי תוצר הקריו-הטמעה באמצעות להב תער. לאחר מכן, הוסף מעט תוצר קריו-הטמעה על דיסק הדגימה, ויישר את הבלוק כך שפני השטח של דיסק הדגימה יהיו מקבילים למשטח התחתון של הבלוק. המתן עד שתוצר הקריו-הטמעה יקפא.לאחר מכן, הניחו את דיסק הדגימה על ראש הדגימה וכוונו את הראש כך שהלהב יחתוך במקביל לפני השטח של בלוק הדגימה. בשלב הבא, גזרו חתיכות של סרט קירור (cryotape) כדי לכסות את אזור העניין וקררו אותן מראש בתוך הקריוסטט. לאחר מכן, גזרו את הבלוק עד להגעה לרמה בתוך אזור העניין, תוך המשך ביצוע התאמות לפי הצורך.לאחר שהגעתם לאזור העניין וניתן לבצע חיתוך, הסמירו בעזרת מברשת שאריות שבבים מפני השטח של הבלוק. לאחר מכן, הסירו את שכבת ההגנה שאינה נדבקת מהסרט לאיסוף (cryotape) על ידי אחיזה בלשוניות הכסף-זהב שאינן דביקות. לאחר מכן, הניחו את הסרט על הבלוק כאשר הצד הדביק פונה כלפי מטה.הפעיל לחץ על סרט הקירור (cryotape) באמצעות הגלגלת, ובצע חיתוך של סדרה באמצעות המנוע האוטומטי או גלגל החיתוך הידני של הקריוסטט. לאחר מכן, הנח את החתך כאשר צד הרקמה פונה כלפי מעלה על גבי זכוכית מיקרוסקופ מפלסטיק בתוך הקריוסטט. הוצא את הזכוכית מהקריוסטט ואפשר לתווך ההטמעה הקפוא (cryoembedding medium) להמיס, כך שהחתך ייצמד לפני השטח של הזכוכית.חזור על פעולת החיתוך עבור חתכים סדרתיים או אזורי עניין אחרים. עם הסיום, הנח את החתכים בקופסת סליידים ואחסן אותם בטמפרטורה של 4, 20- או 80- מעלות צלזיוס, בהתאם למשך האחסון הנדרש ומדדי התגובה במדידות המשך. לביצוע שיטת הדבק המתקשה תחת UV, סמן תחילה את סלייד המיקרוסקופ.יש למרוח טיפה של דבק אופטי המופעל ב-UV על שתי זכוכיות, ולהשתמש בקצה של זכוכית כדי לפרוס שכבה דקה של דבק על פני השטח של הזכוכיות. לאחר מכן, יש לגזור את לשונית הכסף-זהב ולהניח את נתח הרקמה המודבק, כאשר צד הרקמה פונה כלפי מעלה, על שכבת הדבק של הזכוכית הראשונה. יש להניח את הנתח בתנועה גלגולית מקצה אחד לשני כדי לצמצם את היווצרותן של בועות אוויר כלואות מתחת לסרט ההדבקה.לאחר מכן, הסר את החיתוך המודבק מהשקופית הראשונה, הנח אותו על שכבת הדבק של השקופית השנייה, והקפד למנוע כלואת בועות. לאחר שהונח על כל שקופית המספר המתאים של חיתוכים עבור הניסוי הנתון, נגב את שאריות הדבק מהאזורים מסביב. לאחר מכן, בחן את החיתוכים מקרוב כדי לוודא שאין בועות או סיבים מתחת לסרט הדבק.לאחר מכן, הניחו את למסכי המיקרוסקופ תחת אור UV שחור למשך חמש עד עשר דקות כדי לבצע קשירה צולבת (cross-link) של שכבת הדבק. בשלב זה, הכינו את תמיסת סמני הייחוס על ידי המסה של 50 µl של מיקרוספירות ירוקות ו-50 µl של מיקרוספירות אדומות ב-100 µl של מים. אחסנו את התמיסה בחושך בטמפרטורה של 4 °C.לאחר מכן, טבלו קצה של פיפט בתמיסת המיקרוספירות, ומרחו את תמיסת המיקרוספירות על כל מקטע, בסמוך לאזור העניין. לאחר מכן, ייבשו את השקופיות בטמפרטורת החדר והגנו עליהן מאור על ידי כיסוי בנייר אלומיניום למשך 30 דקות, במידה והטיפול בשקופיות מתבצע באותו היום. אם לא, הניחו את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר צביעת החתכים, הצמידו את זכוכיות הכיסוי לשקופיות באמצעות מדיום הרכבה (mounting medium) מתאים. לצורך ביצוע הדמיה, טענו את השקופיות למגשי המיקרוסקופ והכניסו את המגשים למערכת המגשים של מיקרוסקופ סריקת השקופיות. לאחר מכן, לחצו על רשימת הפרופילים בתוכנת המיקרוסקופ כדי לטעון פרופיל עבור כל שקופית עם זמן החשיפה המתאים לכל פלואורופור.לחצו על כפתור Start Preview Scan כדי לצלם תמונת תצוגה מקדימה של כל שקופית. התוכנה תקצה שם קובץ באופן אוטומטי על ידי קריאת הברקודים המופיעים על תוויות השקופיות. לחלופין, ניתן להקצות שם קובץ לכל שקופית באופן ידני.הגדירו את אזורי העניין (regions of interest) באמצעות הכניסה לאשף זיהוי הרקמה, שרטוט כל אזור בעזרת כלי השרטוט, ביצוע התאמות נחוצות ושמירתם לסבבי הדמיה עוקבים. לאחר הגדרת כל שקופית, התחילו את תהליך הסריקה בלחיצה על כפתור Start Scan. לאחר כל סבב הדמיה, טבלו את השקופיות בצנצנת קופלין (coplin jar) מלאה ב-1x PBS עד להסרתו של כיסוי השקופית מהשקופיות, לפני שלב הצביעה הבא.לאחר השלמת כל סבבי הדימות, ייצאו את התמונות מכל ערוץ בנפרד כקבצי TIF או JPG לצורך הרכבת התמונות וניתוחן. באיור זה, נתח מעצם ירך של עכבר בן שלושה חודשים נצבע ב-calcein blue ודומם לבדיקת מינרל מצטבר, הנראה בלבן, וסימני מינרליזציה, הנראים בירוק ובאדום בסבב הדימות הראשון. לאחר מכן, השקופיות דוממו לבדיקת פעילות TRAP, הנראית בצהוב בסבב השני, ופעילות AP, הנראית באדום בסבב הדימות השלישי.לבסוף, השקופיות נצבעו ב-toluidine blue בסבב הרביעי. סימני הייחוס צולמו במהלך כל סבב דימות, כולל הסבב הכרומוגני, ויושרו באמצעות התוכנה המותאמת אישית. לאחר רכישת מיומנות בטכניקה זו, ניתן לבצעה בזמן קצר יותר מהזמן הדרוש לדקאלציפיקציה של דגימה טיפוסית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק תמונות באיכות גבוהה ובתוכן עשיר של רקמות ממינרליזציה, אותן אנו מקווים שייעשה בהן שימוש נרחב יותר בקהילת השריר-שלד.

high-throughput-multi-image-cryohistology-of-mineralized-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

עבודה זו מציגה עיבוד חדש פרוטוקול הדמיה לניתוח עבה, תלת ממדי ניתוח חתך המאפשר ניצול מלא של modocalities הדמיה confocal. פרוטוקול זה משמר אנטיגניות ומייצג מערכת חזקה לנתח היסטולוגיה העור וסוגים אחרים של רקמות אחרות.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

שיטה זו מתארת את השימוש במודל העכבר R26R-קונפטי (קונפטי) כדי לחקור רקמות מינרליזציה, כיסוי כל הצעדים מאסטרטגיית הרבייה ועד לאפשרות התמונה. כלול הוא פרוטוקול כללי שניתן להחילם על כל הרקמות הרכות ופרוטוקול שהשתנה שניתן להחילם על רקמות מינרליזציה.

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

פרוטוקול זה מציג צינור מקיף לניתוח דגימות המתקבלות מלבבות אנושיים המשתרעים בקנה מידה מיקרוסקופי ומקרוסקופי.

צינור למחקר אנטומי תלת-ממדי רב-ממדי בקנה מידה של לב האדם

השילוב של איטרטיבי-הלבנה-הרחבה-ריבוי (IBEX) ובדיקת תיוג נוקלאוטידים מסחרית (Click-iT EdU) מאפשר זיהוי וסיווג של סוגי תאים מתחלקים בתהליכים דינמיים ביותר בקטעי רקמת עכברים קפואים קבועים. יתר על כן, צינור עיבוד תמונה חדש בקוד פתוח מספק רכישה וניתוח של תמונות בתפוקה גבוהה.

זרימת עבודה של הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה להערכת פנוטיפים של תאי עור ומצבי התפשטות בדגימות רקמה

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

פרוטוקול זה כולל תהליך עבודה שלב אחר שלב עבור דגימות וסקולריות מסוידות: טיפול ברקמות, דה-קלציפיקציה, אימות RNA, זיהוי רמות סיידון ואסטרטגיות בחירת אזור עניין ב-Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). המטרה היא להציג שיטה מקיפה לשימור מורפולוגיית רקמת כלי דם ו-RNA לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי אמין.

הכנה ועיבוד עורקים מסויד עם מורפולוגיה ו-RNA משומרים לפרופילינג מרחבי דיגיטלי

פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.

תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר

למד פלטפורמת קריוהיסטולוגיה לניתוח רקמות מינרליות בייעול גבוה. השיטה מאפשרת דימות רב-סבבי של אותות מולקולריים בתאים ספציפיים עבור ביולוגיית שריר-שלד.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

גלה סרטונים נוספים