בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת RNA קטנים שאינם מקודדים על ליפופרוטאינים מטוהרים. פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הליפופרוטאין, כגון הגדרת חתימות RNA קטנות של ליפופרוטאין בבריאות ובחולי, כמו גם קידום RNA קטן של ליפופרוטאין כסמנים ביולוגיים של מחלה, או מסרים מתא לתא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח ליפופרוטאינים טהורים ביותר עבור שינויים קטנים ב-RNA במחלה או בתנאי ניסוי.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול במחלות לב וכלי דם, מכיוון ש-RNA חוץ-תאיים הם סוג חדש של סמנים ביולוגיים של מחלות וליפופרוטאין RNA קטן יש פוטנציאל מרגש כמטרות תרופתיות במחקרים עתידיים. למרות ששיטה זו מיועדת ל-RNA קטנים HDL, ניתן להתאים אותה גם ל-RNA קטנים ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד ובצפיפות נמוכה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק, בגלל היעדר ציוד מתאים ומומחיות בהכנת דגימות לאולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות.

פרוטוקול זה מורכב משיטות מבוססות המקושרות זו לזו לכימות של RNA קטנים על HDL טהור ביותר, באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה, או PCR בזמן אמת. סרטון זה עוסק בטיהור ה- HDL. הפרוטוקול הזה הולך להיות מודגם על ידי העוזר שלי, אוון שדרי.

כדי להתחיל, הוסף 90 מיקרוליטר של פי 100 נוגדי חמצון לתשעה מיליליטר פלזמה. לאחר מכן, התאם את צפיפות הפלזמה ל-1.025 גרם למיליליטר, על ידי הוספת 0.251 גרם אשלגן ברומיד לכל תשעה מיליליטר פלזמה. נדנדו את הפלזמה בטמפרטורת החדר, עד שכל המלח נמס.

לאחר מכן, העבירו את הפלזמה לצינורות אולטרה-צנטריפוגה, וודאו שיש שכבה של בועות בחלק העליון. לא אמור להיות אוויר כלוא מתחת לפלזמה. לאחר מכן, הכינו מחט בגודל 18 על ידי הוספת כיפוף של 90 מעלות סנטימטר אחד מהקצה, כשהצד המשופע פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן, בעזרת מזרק והמחט הכפופה, הניחו בזהירות שלושה מיליליטר של תמיסת כיסוי מספר אחת על הפלזמה. הסר את רוב הבועות על פני השטח, והשאיר שניים עד שלושה מילימטרים בין המניסקוס לקצה הצינור. לאחר מכן, הניחו בזהירות את הצינורות לתוך דליי SW 40 Ti.

שקלו כל דלי עם המכסים, ואזנו בדיוק את הדליים שיתפסו עמדות מנוגדות בצנטריפוגה. לאחר מכן, הנח את הרוטור לתוך האולטרה-צנטריפוגה, והפעל אותו ב-274, 400 פעמים G למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס, כאשר ההפסקה מוגדרת לערך ביניים של ארבע. למחרת, הסר בזהירות את הדליים מהרוטור, והרם את הצינורות מהדליים.

לאחר מכן, הסר לאט שני מיליליטר מהשכבה העליונה של הכיסוי, בעזרת מזרק ומחט כפופה. זהו שבר ה-VLDL IDL. לאחר מכן, אספו את שבעת המיליליטר הנותרים של הפלזמה, והעבירו אותה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

הביאו את נפח הפלזמה לתשעה מיליליטר על ידי הוספת תמיסת כיסוי מספר שתיים. לאחר מכן, התאם את הצפיפות ל-1.080 גרם למיליליטר על ידי הוספת 0.746 גרם אשלגן ברומיד. לאחר מכן, נדנד בעדינות את הדגימה כדי להמיס את המלח, מה שייקח כ -20 דקות.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור אולטרה-צנטריפוגה מבלי ללכוד אוויר. ודא שנוצרת שכבת בועות בחלקו העליון. בעזרת המחט הכפופה, שכבו בזהירות שלושה מיליליטר של תמיסת כיסוי מספר שלוש.

לאחר מכן, הסר את רוב הבועות וטען בזהירות את הצינורות לדלי SW 40 Ti. איזון אותם וסובב אותם, כפי שתואר קודם לכן, למשך 24 שעות. למחרת, הסר בזהירות שני מיליליטר מהשכבה העליונה של הכיסוי באמצעות המחט הכפופה.

זהו שבר ה-LDL. לאחר מכן, העבירו את הדגימה הנותרת לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר, והביאו את הנפח לתשעה מיליליטר עם תמיסה מספר ארבע. כעת התאם את הצפיפות ל-1.30 גרם למיליליטר על ידי הוספת כ-3.33 גרם אשלגן ברומיד ונדנוד הדגימה עד שהמלח נמס.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור אולטרה-צנטריפוגה ובזהירות יתר על המידה שלושה מיליליטר של תמיסה מספר חמש. כעת, אולטרה צנטריפוגה את הדגימה כמו קודם, אך למשך 48 שעות. יומיים לאחר מכן, אספו את שני המיליליטר העליונים של הכיסוי בעזרת מזרק ומחט כפופה.

זה מהווה את חלק ה-HDL. כדי להסיר את תמיסות המלח הגבוהות, העבירו את שבר ה-HDL לשרוול דיאליזה רטוב עם חתך משקל מולקולרי של 10,000. לאחר מכן, יש לדיאליזה במשך 24 שעות בליטר XPBS אחד תוך ערבוב עדין בארבע מעלות צלזיוס.

החלף את תמיסת PBS שלוש פעמים במהלך 24 השעות. מאוחר יותר, קבע את ריכוז החלבון של שבר ה-HDL בשיטת BCA. שלפוחיות חוץ-תאיות, או אקסוזומים, הן בעלות צפיפות דומה ל-HDL קטן, ולכן יכולות להיות נוכחות באותו חלק צפיפות כמו ה-HDL.

לפיכך, שבר ה- HDL דורש טיהור נוסף על ידי FPLC. מיד לפני השימוש ב-FPLC, הפעל 1.2 מיליגרם של שבר DGUC HDL בתמיסה של 500 מיקרוליטר דרך מסנן צנטריפוגלי של 0.22 מיקרון. אסוף את הדגימה המסוננת למזרק הזרקת FDLC, וודא שלא יילכדו בועות אוויר.

לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה של FPLC ל-0.3 מיליליטר לדקה עם מגבלת לחץ של 2.6 מגה-פסקל. לאחר מכן, אזן את העמודות עם נפחי מאגר של 0.2 עמודות. כעת הזרקו את הדגימה עם שלושה מיליליטר מאגר למכשיר FPLC, והתחילו בריצה.

אסוף שברים של 1.5 מיליליטר בסך הכל 72 שברים. זהה את שברי ה-FPLC המתאימים ל-DGUC HDL על ידי קביעת רמות הכולסטרול הכוללות באמצעות ערכה קולורימטרית לפי הוראות היצרן. צפו למצוא שישה עד שבעה שברי FPLC המכילים DGUC HDL.

אסוף את כל השברים המכילים HDL ורכז אותם באמצעות מסנן צנטריפוגלי חתך של 10 קילודלטון ב-4,000 פעמים G למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס, או עד שתרכיז HDL הוא כ-100 מיקרוליטר. לאחר מכן, אספו את תרכיז ה-HDL וכימתו את החלבון בשיטת BCA. מאוחר יותר, השתמש באותה כמות של חלבון כולל HDL כדי לבודד RNA.

פלזמה אנושית חולקה על ידי FPLC ללא שימוש בהפרדת צפיפות-שיפוע. שישה שברים התאימו ל-HDL ושישה לליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד. שומנים בשחור, כולסטרול באדום וחלבון בכחול נמדדו כולם על ידי ערכות קולורימטריות.

לשם השוואה, שימוש באולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות לפני FPLC הביא למציאת חלבון שומני וכולסטרול כמעט אך ורק בשברי HDL. מ-HDL שנלקח מארבעה תורמי פלזמה בריאים, ה-RNA הכולל בודד ורוצף באמצעות פרוטוקול זוג בסיסים של 50 קריאה יחידה. התפלגות הקריאות המנורמלות ממחישה והעשרה של RNA קטנים סביב 21 ו-34 נוקלאוטידים.

ניתוח הספרייה הראה ש-38 אחוז מהקריאות היו מיקרו-RNAs, ו-37 אחוז נגזרו מ-TRNAs. היו גם רנ"א שונים, רנ"א ריבוזומלי, רנ"א קטן, רנ"א גרעיני קטן ורנ"א ארוך שאינו מקודד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך עשרה ימים, כאשר היא נעשית כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאמת שינויים קטנים ב-RNA של HDL שנצפו בריצוף תפוקה גבוהה בשיטה אחרת, כגון PCR או כתמים צפוניים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו יכולת קבלת שטף אלקטרוני של כולסטרול HDL ו-SAs אנטי דלקתיים HDL, במהלך שלבי בידוד ה-RNA ושלבי ההכנה לריצוף כדי לענות על שאלות נוספות, כמו קביעת המתאם בין שינויים קטנים ב-RNA של HDL ותפקוד HDL. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי השומנים והליפופרוטאינים לחקור מטענים שאינם כולסטרול, במיוחד חומצות גרעין ומחלות מטבוליות, למשל היפרכולסטרולמיה או סוכרת.

ואל תשכח, עבודה עם פלזמה אנושית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לעבור הכשרה מתאימה בפתוגנים הנישאים בדם, ויש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע טכניקה זו.