Name: בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד בידוד וכימות של RNA קטנים לא קודדים בליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה. פרוטוקול זה משתמש בהפרדה באולטרה-צנטריפוגה וב-FPLC כדי לזהות חתימות RNA קטנים כביומרקרים למחלות קרדיו-מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם ל-K.C.V. HL128996, HL113039 ו-HL116263. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרסים מאיגוד הלב האמריקאי ל-K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 ו-R.M.A. POST25710170.

<ol><li>Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+diverse+small+RNA+species+in+the+deep+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome.</a> Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)"> MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tRNA-derived+small+RNAs+in+the+global+regulation+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing.</a> RNA. 16, 673-695 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+terminal+and+asymmetric+processing+of+small+RNAs+from+rRNAs%2C+snoRNAs%2C+snRNAs%2C+and+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).</li>
<li>Maute, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-derived+microRNA+modulates+proliferation+and+the+DNA+damage+response+and+is+down-regulated+in+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+pre-processing+Illumina+next-generation+sequencing+short+read+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences.</a> Source Code Biol Med. 9, 8(2014).</li>
<li>Vickers, K. C., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+carriers+of+microRNAs+and+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication.</a> Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).</li>
<li>Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+exosome+isolation+and+characterization%3A+evaluation+of+ultracentrifugation%2C+density-gradient+separation%2C+and+immunoaffinity+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods.</a> Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).</li>
<li>Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cell+movement+through+tissues+is+controlled+by+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion.</a> Nat Commun. 6, 7164(2015).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+RT-PCR+inhibition+observed+in+heparinized+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens.</a> Biotechniques. 23, (1997).</li>
<li>Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparinase+treatment+of+RNA+before+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR.</a> Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).</li>
<li>Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+interfere+with+PCR+used+to+diagnose+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).</li>
<li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+quantitative+PCR-based+viral+burden+analysis+for+eight+human+herpesviruses+in+pediatric+solid+organ+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients.</a> J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).</li>
<li>McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+the+effects+of+EDTA+and+citrate+anticoagulants+on+platelet+count+and+mean+platelet+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume.</a> Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circ Res. 107, 677-684 (2010).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, e24145(2011).</li>
<li>Kannan, M., Atreya, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+profiling+of+human+red+blood+cells+during+storage+for+52+selected+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs.</a> Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).</li>
<li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360(2008).</li>
<li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה נועד לכמת miRNAs ו sRNAs אחרים על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR על HDL טהור מאוד. כמו בכל גישה, שיקולים מיוחדים יש לתת לכל שלב בתהליך של HDL מטהר RNA ואז לכימות sRNAs. פרוטוקול זה מיועד פרויקטים החל ≥ 2 מ&quot;ל של הפלזמה. אף על פי כן, ניתוחי RNA באיכות גבוהה ניתן להשלים בהצלחה עם HDL מטוהר מ קטן כמו 80 μL של מפלזמה אנושית או עכבר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה; עם זאת, כרכי פלזמת מוצא גדולים לייצר נתונים טובים יותר באמצעות השיטות שהוצגו כאן. שיטות עיבוד והפקה לדוגמא י...

RNA הקטן ללא קידוד התאי (sRNAs) מייצג סוג חדש של סמנים ביולוגיים למחל מטרות טיפוליות פוטנציאליות להקל סביר תא אל תא תקשורת 1. הסוג למד הנרחב ביותר של Srna הוא מייקרו-רנ&quot;א (מירנה) שהם כ 22 nts באורך מעובדים מצורות מבשרות עוד תעתיק עיקרי 2. miRNAs הודגם שלאחר יעתיק לווסת ביטוי גנים באמצעות דיכוי תרגום חלבון והאינדוקציה של שפלת mRNA 2. אף על פי כן, miRNAs הוא רק אחד מסוגים רבים של sRNAs; כמו sRNAs ניתן ביקע מן tRNAs הורה (sRNAs הנגזרות tRNA, TDR), RNAs גרעיני קטן (Srna הנגזרות sRNAs, sndRNA), RNAs nucleolar קטן (snoRNA הנגזרות sRNAs, snRNA), RNAs ריבוזומלי (rRNA הנגזרות sRNAs, RDR RNAs, Y) (yDR), ו RNAs השונה אחרת 1. הנה כמה דוגמאות של sRNAs הרומן האלה דווחו לתפקד דומה miRNAs; לעומת זאת, פו הביולוגיnctions של רבי sRNAs אלה עדיין לא נקבע, אף תפקידי ויסות גנים צפויים 3-6. הדבר המעניין ביותר, miRNAs ו sRNAs אחרים נוכחים ביציבות בנוזלי תאיים, כולל רוק, פלזמה, שתן, ומרה. sRNAs התאי מוגן סביר מן RNases דרך התקשרותן עם שלפוחית ​​תאית (EV), ליפופרוטאינים, ו / או מתחמי ribonucleoprotein תאיים. בעבר, דיווחנו ליפופרוטאינים כי, כלומר ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), miRNAs תחבורה בפלסמה 7. במחקר זה, HDL בודדו בשיטה סדרתית של ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC), כרומטוגרפיה נוזלית מהיר חלבון (סינון ג&#39;ל כרומטוגרפיה בגודל הדרה, FPLC), ו כרומטוגרפיה זיקה (אנטי-אפוליפופרוטאין AI (apoA-לי immunoprecipitation) 7). שימוש בשני מערכים בצפיפות נמוכה בזמן אמת מבוססי PCR מבחני מירנה בודדים, רמות מירנה כומתו על HDL מבודד לרפאעמך ונושאים hypercholesterolemic 7. בגישה זו, הצלחנו פרופיל miRNAs ולכמת miRNAs הספציפי בהכנות HDL טהורות מאוד. מאז 2011, קבענו כי למרות כרומטוגרפיה זיקת משפר טוהרת HDL, רווית נוגדן מגבילה במידה ניכרת תשואה, והוא יכול להיות עלות אוסרני. נכון לעכשיו, הפרוטוקול שלנו ממליץ על שיטת טנדם רציפי שני שלבים של DGUC ואחריו FPLC, שיוצרים גם דגימות HDL באיכות גבוהה עבור בידוד RNA למטה זרם וכימות Srna. בשל ההתקדמות רצף תפוקה גבוהה של sRNAs (sRNAseq), למשל, miRNAs, והגברת המודעות של מעמדות אחרים שאינם מירנה Srna, sRNAseq הוא המדינה- of-the-art הנוכחי פרופיל מירנה Srna. ככזה, הפרוטוקול שלנו ממליץ miRNAs לכימות sRNAs אחר על דגימות HDL באמצעות sRNAseq. אף על פי כן, RNA הכולל מבודד HDL יכול לשמש גם לכמת miRNAs פרט sRNAs אחר או לאמת תוצאות sRNAseq באמצעות בזמן אמת PCRpproaches. כאן אנו מתארים בפרוטרוט פרוטוקול לאיסוף, טיהור, כימות, ניתוח נתונים, ואימות של sRNAs HDL טהור מאוד. המטרה הכללית של מאמר זה היא להוכיח את ההיתכנות ואת תהליך של כימות Srna ב- HDL טהור מאוד מבודד מפלסמה אנושית.

<table><tbody><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>A99839</td><td>אופטימה XPN-80</td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA מערכת FPLC טהורה</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 הגדלת עמודות בשורה</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>שולחן צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (נרכש דרך USA Scientific)</td></tr><tr><td>מיקרופוגה&nbsp;</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 ביואנלייזר&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>רגישות גבוהה בדיקת DNA</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>ספריית ריצוף qPCR ערכת כימות</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermal</td><td>Cycler Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot Eppendorf</td><td></td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן ברומיד</td><td>פישר כימיקלים</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>מסננים מיקרו-צנטריפוגליים 0.45 ומיקרו; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>מסננים מיקרו-צנטריפוגליים 0.22 ומיקרו; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAAערכות בידוד RNA כוללות</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol colormetric Kit</td><td>Cliniqa (Raichem)</td> <td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10,000 m.w. מסנן צנטריפוגה מנותק</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>נרכש באמצעות צינורות רצועת Millipore</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>נרכש דרך פישר</td></tr><tr><td>ערכת microRNA RT</td> Life <td>Technologies</td><td>4366597</td><td>עבור 1000 תגובות</td></tr><tr><td>PCR מאסטר מיקס</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>בקבוק 50 מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי וריכוז</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>נרכש דרך פישר</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>עניבת פרפר 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td></td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>תוכנה</td></tr></tbody></table>

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור non-קידוד rna קטנים כימות

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

המגוון של RNAs ללא קידוד קטן (Srna) היא מתרחבת במהירות ותפקידיהם בתהליכים ביולוגיים, כולל ויסות הגנים, הם מתעוררים. הדבר המעניין ביותר, sRNAs הם גם מצאו מחוץ לתאים ו נמצאים ביציבות בכל נוזלים ביולוגיים. ככזה, sRNAs התאי מייצג סוג רומן של סמנים ביולוגיים למחלות קרובות לוודאי מעורב איתות תא ורשתות תקשורת בין תאית. כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם לשמש כסמנים ביולוגיים, sRNAs ניתן לכמת בפלסמה, בשתן, ונוזלים אחרים. אף על פי כן, כדי להבין את ההשפעה מלאה של sRNAs תאי כאותות האנדוקרינית, חשוב לקבוע אילו ספקים מעבירים והגנה אותם הנוזלים ביולוגיים (למשל, פלזמה), אשר תאים ורקמות לתרום ברכות Srna תאיות, ותאים ורקמות מסוגלות קבלה וניצול Srna התאי. כדי להשיג מטרות אלו, חשוב לבודד אוכלוסיות טהורות מאוד של ספקים תאייםעבור פרופיל וכימות Srna. אנחנו הוכחנו בעבר כי ליפופרוטאינים, במיוחד ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), להעביר מייקרו RNA הפונקציונלי (מירנה) בין תאים ו- HDL-miRNAs הם שינו באופן משמעותי מחלה. כאן, פרט לנו פרוטוקול חדש אשר מנצל בידוד HDL בד בבד עם ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC) ומהר-חלבון נוזלי כרומטוגרפיה (FPLC) להשיג HDL טהור מאוד עבור פרופיל במורד וכימות של כל sRNAs, כולל miRNAs, הן באמצעות גבוהה רצף -throughput וגישות PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה יהיה משאב יקר ערך עבור החקירה של sRNAs על HDL.

פרוטוקול זוהי סדרה של שיטות הוקמה מקושר יחד כדי לאפשר כימות של sRNAs על HDL טהור מאוד על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR (איור 1). כדי להוכיח את ההיתכנות וההשפעה של פרוטוקול זה, HDL היה מטוהרים מפלסמה אנושית בשיטת טנדם DGUC ו FPLC. מקטעים שנאספים FPLC המתאים HDL (על ידי חלוקת כולסטרול) רוכזו ו- RNA הכולל היה מבודד 1 מ&quot;ג של HDL (חלבון כולל). ספריות Srna נוצרו עם HDL שנאסף n = 4 בבני אדם בריאים. כל דגימות והדם / פלזמה נאספו ...

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והכימות של רנ"א קטן של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לקיים כימות של RNAs קצרים שאינם מקודדים על ליפופרוטאינים מופרדים. פרוטוקול זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הליפופרוטאינים, כגון הגדרת חתימות של RNA קצר בליפופרוטאינים במצב בריא ובמחלה, וכן קידום של RNAs קצרים בליפופרוטאינים כסממנים ביולוגיים למחלות או כשליחים בין תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח ליפופרוטאינים בדרגת טוהר גבוהה כדי לבחון שינויים ב-RNA קצר במצבי מחלה או בתנאים ניסויים.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות קרדיומטבוליות, כיוון ש-RNAs חוץ-תאיים הם מחלקה חדשה של סממנים ביולוגיים למחלות, ו-small RNA של ליפופרוטאינים טומנים בחובם פוטנציאל מרגש כמטרות תרופתיות במחקרים עתידיים. למרות ששיטה זו תוכננה עבור small RNAs של HDL, ניתן להתאימה גם עבור small RNAs של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL) ובצפיפות נמוכה (LDL). באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות בביצועה, בשל חסר בציוד מתאים ובמומחיות בהכנת דגימות עבור אולטרה-צנטריפוגציה במדרג צפיפות.פרוטוקול זה מורכב משיטות מבוססות המקושרות יחד לצורך כימות של small RNAs על HDL ברמת טוהר גבוהה, באמצעות ריצוף בספיקה גבוהה או PCR בזמן אמת. סרטון זה עוסק בטיהור של ה-HDL. פרוטוקול זה יודגם על ידי העוזר שלי, Evan Shadari.כדי להתחיל, הוסיפו 90 µL של נוגדי חמצון בריכוז 100x לתשעה מיליליטר של פלזמה. לאחר מכן, כווןנו את צפיפות הפלזמה ל-1.025 g/mL, על ידי הוספה של 0.251 g של פוטסיום ברומיד לכל תשעה מיליליטר של פלזמה. ערבבו את הפלזמה בטלטול (Rocking) בטמפרטורת החדר, עד להמסה מלאה של המלח.לאחר מכן, העבירו את הפלזמה לנבובות צנטריפוגה אולטרה, וודאו שקיימת שכבת בועות בחלק העליון. לא אמור להיות אוויר כלוא מתחת לפלזמה. בשלב הבא, הכינו מחט במידה 18 על ידי יצירת כיפוף של 90 מעלות סנטימטר אחד מהקצה, כאשר הצד המשופע פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, בעזרת מזרק ומחט כפופה, העבירו בזהירות שלושה מיליליטרים של תמיסת כיסוי מספר אחת על גבי הפלזמה. הסירו את מרבית הבועות מהפנימה, והשאירו רווח של שני עד שלושה מילימטרים בין המניסקוס לדופן המבחנה. לאחר מכן, הכניסו בזהירות את המבחנות לתוך דליי SW 40 Ti.שקלו כל דלי עם המכסים, והשגיחו שהדליים שימוקמו במיקומים מנוגדים בצנטריפוגה יהיו מאוזנים בדיוק. לאחר מכן, הכניסו את הרוטור לאולטרה-צנטריפוגה, והפעילו אותו במהירות של 274,400 ×g למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 °C, כאשר מערכת הבלימה (break) מוגדרת על ערך בינוני של 4. למחרת, הוציאו בזהירות את הדליים מהרוטור, והרימו את המבחנות מהדליים.לאחר מכן, הוציאו באיטיות 2 mL מהשכבה העליונה של המעטפת, באמצעות מזרק ומחט כפופה. זהו פראקציית ה-VLDL IDL. לאחר מכן, אספו את שבעת המיליליטרים הנותרים של הפלסמה והעבירו אותם לפרויקט של מבחנה קונוית בנפח 15 mL.הגדילו את נפח הפלסמה לתשעה מיליליטרים על ידי הוספת תמיסת כיסוי מספר שתיים. לאחר מכן, התאימו את הצפיפות ל-1.080 גרם למילליטר על ידי הוספת 0.746 גרם של פוטסיום ברומיד. בשלב הבא, נערו בעדינות את הדגימה כדי להמיס את המלח; תהליך זה יארך כ-20 דקות.לאחר מכן, העבירו את הדגימה לשפופרת אולטרה-צנטריפוגה ללא כליאת אוויר. ודאו כי נוצרה שכבת בועות בחלק העליון. בעזרת מחט כפופה, העבירו בזהירות 3 mL של תמיסת כיסוי מספר 3 מעל הדגימה.לאחר מכן, הסיר את מרבית הבועות והעבר בזהירות את המבחנות לדלי של SW 40 Ti. איזן אותן וסבב אותן, כפי שמתואר קודם לכן, למשך 24 שעות. למחרת, הסר בזהירות שני מיליליטרים מהשכבה העליונה של שכבת הכיסוי באמצעות המחט הכפופה.זהו פראקציית ה-LDL. לאחר מכן, העבירו את שאר הדגימה לפריקון של 15 milliliter, והשלימו את הנפח לתשעה milliliters באמצעות תמיסה מספר ארבע. כעת, כווןנו את הצפיפות ל-1.30 grams per milliliter על ידי הוספת כ-3.33 grams של potassium bromide וניעור של הדגימה עד להמסת המלח.לאחר מכן, העבירו את הדגימה לפראור של אולטרה-צנטריפוגה והוסיפו בזהירות שלוש מיליליטר של תמיסה מספר חמישה מעל הדגימה. כעת, בצעו אולטרה-צנטריפוגה לדגימה כפי שנעשה קודם לכן, אך למשך 48 שעות. לאחר יומיים, אספו את שני המיליליטרים העליונים של השכבה העליונה באמצעות מזרק ומחט כפופה.זה מהווה את פראקציית ה-HDL. כדי להסיר את תמיסות המלח הריכוזיות, העבירו את פראקציית ה-HDL לשרוול דיאליזה רטוב עם סף הפרדה של 10,000 למשקל מולקולרי. לאחר מכן, בצעו דיאליזה למשך 24 שעות בליטר של 1x PBS עם ערבוב עדין בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.החליפו את תמיסת ה-PBS שלוש פעמים במהלך תקופת 24 השעות. לאחר מכן, קבעו את ריכוז החלבון של פראקציית ה-HDL באמצעות שיטת BCA. לשלפוציות חוץ-תאיות, או אקסוזומים, יש דחיסות דומה לזו של HDL קטן, ולכן הן עשויות להיות נוכחות באותה פראקציית דחיסות של ה-HDL.לפיכך, פרקציית ה-HDL דורשת טיהור נוסף באמצעות FPLC. מיד לפני השימוש ב-FPLC, העבירו 1.2 milligrams של פרקציית ה-DGUC HDL ב-500 µL של תמיסה דרך מסנן צנטריפוגלי של 0.22 micron. אספו את הדגימה המסוננת למזרק הזרקה של FDLC, תוך וידוא שלא נלכדו בתוכו בועות אוויר.בשלב הבא, הגדירו את קצב הזרימה של ה-FPLC ל-0.3 milliliters per minute עם הגבלת לחץ של 2.6 megapascals. לאחר מכן, בצעו שיווי משקל לעמודות באמצעות 0.2 נפחי עמודה של בופר. כעת, מזריקו את הדגימה עם שלושה milliliters של בופר למכשיר ה-FPLC, והתחילו את ההרצה.אספו פרקציונים של 1.5 מיליליטר עד לסך של 72 פרקציונים. זהו את פרקציוני ה-FPLC המתאימים ל-DGUC HDL על ידי קביעת רמות הכולסטרול הכוללי באמצעות ערכה קולורימטרית בהתאם להוראות היצרן. צפויות שש עד שבעה פרקציוני FPLC המכילים DGUC HDL.אגדו את כל השברים המכילים HDL ורכזו אותם באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם סף חיתוך של 10 kilodalton במהירות של 4,000 ×g למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C, או עד שנפח תרכיז ה-HDL יהיה בערך 100 µL. לאחר מכן, אספו את תרכיז ה-HDL וכמתו את כמות החלבון בשיטת BCA. בהמשך, השתמשו באותה כמות של חלבון HDL סהרי כדי לבודד RNA.פלזמה אנושית פולטה לשברים באמצעות FPLC ללא שימוש בהפרדה במדרג צפיפות. שישה שברים התאימו ל-HDL וששים לליפופרוטאין בעל צפיפות נמוכה מאוד. ליפידים בשחור, כולסטרול באדום וחלבון בכחול נמדדו כולם באמצעות ערכות קולורימטריות.להשוואה, שימוש באולטרה-צנטריפוגציה במדרג צפיפות לפני FPLC הוביל לממצא שחלבון שומנים וכולסטרול נמצאים כמעט בלבד בפרקציות HDL. מ-HDL שנלקח מארבעה תורמי פלזמה בריאים, בודד RNA כולל ורצף באמצעות פרוטוקול קריאה בודדת של 50 base pair. התפלגות הקריאות הנורמליות ממחישה העשרה של small RNAs סביב 21 ו-34 נוקלאוטידים.ניתוח של הספריה הראה כי 38 אחוזים מהקריאות היו micro RNAs, ו-37 אחוזים נגזרו מ-TRNAs. כמו כן נכחו RNAs שונים, ribosomal RNAs, small RNAs, small nucleolar RNAs ו-long non-coding RNAs. ברגע שהטכניקה תישלט, ניתן לבצעה תוך עשרה ימים, כאשר היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתקף שינויים ב-small RNA של HDL שנצפו בריצוף בסביבה של תפוקה גבוהה (high throughput sequencing) באמצעות שיטה אחרת, כגון PCR או northern blotting. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון HDL cholesterol e-flux acceptance capacity ו-HDL anti-inflammatory SAs, במהלך שלבי בידוד ה-RNA ושלבי ההכנה לריצוף, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קביעת המתאם בין שינויים ב-small RNA של HDL לבין תפקוד ה-HDL. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הליפידים והליפופרוטאינים לבחון מטענים שאינם כולסטרול, ובמיוחד חומצות גרעיניות ומחלות מטבוליות, כגון היפרכולסטרולמיה או סוכרת.ושימו לב, עבודה עם פלזמה אנושית עלולה להיות מסוכנת ביותר; יש להחזיק בהכשרה מתאימה בנושא פתוגנים המועברים בדם, ויש להשתמש בציוד הגנה אישי מתאים בעת ביצוע טכניקה זו.

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

מייקרו RNA לשחק תפקיד רגולטורים חשוב והם מתעוררים כמו מטרות טיפוליות חדשניות למחלות אנושיות שונות. הוכח כי miRNAs נישאים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. פיתחנו שיטה פשוטה לבודד HDL מטוהרים במהירות מתאים לניתוח מירנה מפלסמה אנושית.

שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

למד בידוד וכימות של RNA קטנים לא קודדים בליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה. פרוטוקול זה משתמש בהפרדה באולטרה-צנטריפוגה וב-FPLC כדי לזהות חתימות RNA קטנים כביומרקרים למחלות קרדיו-מטבוליות.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

גלה סרטונים נוספים