Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסה אלקטרופורזה נימית, או CE-MS, באמצעות ממשק קצה נקבובי חסר מעטפת, לניתוח מטבוליטים קוטביים וטעונים מאוד. בהנחה שלא ניתן לטעון מטבוליטים לעתים קרובות, והם יכולים להיות קטיוניים או אניוניים, וכדי להפריד ביניהם הפרדות אלקטרוליטיות כמו אלקטרופורזה נימית, היא השיטה המתאימה ביותר. עם זאת, בשנים האחרונות הרגישות לא הייתה מספיק טובה.

זה היה בגלל הממשק וגם השיטה לא הייתה חזקה. אבל אני חושב שפתרנו יפה את שתי הבעיות באמצעות נדן כממשק חופשי ושימוש בפרוטוקול החדש הזה. ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסה של אלקטרופורזה נימית באמצעות ממשק קצה נקבובי חדש ללא מעטפת לטיפול בשאלות קליניות מרכזיות בתחום המטבולומיקה.

לדוגמה, ניתן לבצע פרופיל של מטבוליטים טעונים קוטביים מאוד בקלות באמצעות טכנולוגיה זו. S מרוכבים מופרדים על בסיס יחס המטען לגודל. לעתים קרובות יותר טכניקה זו מתאימה מאוד לפרופיל של סוג זה של תרכובות נפח המסומנות לדגימות ביולוגיות.

מאפיין ייחודי של מתודולוגיית CE-MS המוצעת ללא מעטפת הוא שניתן להשתמש בהם לפרופיל של מטבוליטים אניוניים וקטיוניים על ידי החלפת קוטביות מתח CE וקוטביות זיהוי MS בלבד. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ש-CE-MS נחשבת לטכניקה חדשה ומסובכת יחסית. כדי להתחיל בהליך זה, הנח מחסנית סיליקה חדשה התמזגה חשופה עם פולט קצה נקבובי באלקטרופורזה של אזור הנימים, או מכשיר CE.

החל שטיפת מתנול קדימה ב-50 psi למשך 15 דקות כאשר התוכנה שולטת במכשיר CE. ובדוק חזותית אם נוזל זורם החוצה משקע הנימים. לאחר מכן, בצע שטיפה בכיוון ההפוך ב-50 psi למשך חמש דקות באמצעות אלקטרוליט הרקע, או תמיסת BGE, כדי לבחון חזותית אם נוזל זורם החוצה מהנימים המוליכים.

חזור על השלב הקודם בלחץ של 100 psi למקרה שלא נצפה נוזל זורם החוצה משקע הנימים. לאחר מכן, שטפו את נימי ההפרדה במים ב-50 psi למשך 10 דקות, ולאחר מכן 0.1 נתרן הידרוקסיד מולרי ב-50 psi למשך 10 דקות, מים ב-50 psi למשך 10 דקות, ותמיסת BGE ב-50 psi למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את קצה המרסס של מחסנית הסיליקה הממוזגת מצינור המים והתקן אותו במתאם מקור הננו-ריסוס לצימוד למכשיר MS.

ודא שגובה בקבוקוני תמיסת ה-BGE במכשיר CE תואם לגובה קצה המרסס. בדוק את זרימת הנוזל דרך הנימים המוליכים על ידי שטיפה בתמיסת BGE ב-50 psi למשך חמש דקות. במהלך שלב שטיפה זה, יש להבחין בטיפת נוזל בבסיס יינון האלקטרו-ספריי, או מחט מרסס ESI.

לאחר השטיפה, יש לשטוף את נימי ההפרדה בתמיסת BGE ב-50 psi למשך 10 דקות בכיוון קדימה. יש להבחין בטיפה נוזלית בקצה פולט הקצה הנקבובי במהלך שלב זה. כעת, מקם את פולט הקצה הנקבובי לכניסה של כניסת MS במרחק משוער של שניים עד שלושה מ"מ.

הפעל מתח של 30 קילוואט באמצעות זמן רמפה של דקה אחת והתחל לרכוש נתוני MS בטווח המסה לטעינה שבין 65 ל-1000 עבור מחקרי פרופיל מטבולי תוך שימוש תחילה במתח ESI של אפס. הגדר את מתח ה-ESI ל-1000 וולט בזמן מדידת הנתונים. הגדל את מתח ה-ESI במרווחים של 200 וולט עד שנצפה אות רקע קבוע למשך 15 דקות לפחות.

העבירו 20 מיקרוליטר של תערובת סטנדרטית של מטבוליט אניוני שהוכנה בעבר למיקרוביאל ריק של 100 מיקרוליטר. הנח את המיקרויאל בבקבוקון CE, והנח את בקבוקון CE במגש דגימת הכניסה. התחל שיטת מצב יונים שלילי לרכישת MS שנוצרה בעבר, ולאחר מכן התחל את רצף CE באמצעות התוכנה השולטת במכשיר CE.

לאחר מכן, שטפו את נימי ההפרדה בתמיסת BGE ב-50 psi למשך שלוש דקות, ולאחר מכן זריקות ב-2 psi למשך 60 שניות ו-psi אחד למשך 10 שניות. הפעל מתח של 30 קילוואט עם זמן רמפה של דקה ולחץ של 0.5 psi למשך 30 דקות בכניסה. לאחר הפרדה אלקטופורטית של 30 דקות, עצור את רכישת נתוני MS והפחת את מתח CE ל-1 קילו וולט באמצעות זמן רמפה של חמש דקות.

בין זריקות הדגימה, שטפו את נימי ההפרדה במים, 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי, מים ותמיסת BGE ב-30 psi למשך שלוש דקות. לאחר השלמת הריצות, נתח את הנתונים המוקלטים על ידי קביעת זמני הנדידה ועוצמת האות של תערובת המטבוליטים האניוניים המנותחת. העריכו אם תקני המטבוליטים האניוניים מופיעים באזור שבין 10 ל-28 דקות.

לאחר מכן, בדוק אם שלושת האיזומרים הקשורים מבחינה מבנית, D-גלוקוז 1-פוספט, D-גלוקוז 6-פוספט ו-D-פרוקטוז 6-פוספט, מופרדים חלקית. ביצועי ההפרדה של שיטת CE-MS ללא מעטפת לניתוח מטבוליטים אניונים קוטביים מאוד מודגמים עבור שלושה איזומרים של סוכר פוספט הקשורים מבחינה מבנית. למרות שלא הושגה הפרדה בסיסית עבור שלושת האנליטים הללו, הפרדה חלקית מספיקה כדי לאפשר את גילויים הסלקטיבי על ידי MS, מכיוון שלאנליטים אלה יש אותה מסה בדיוק.

בעת ניתוח דגימות ביולוגיות, במתודולוגיית CE-MS חסרת מעטפת זו, חשוב לבדוק באופן קבוע את הביצועים האנליטיים לאורך זמן באמצעות סטנדרטים אקדמיים. בסך הכל, המתודולוגיה חסרת המעטפת מאפשרת פרופיל של תרכובות מסוג זה בדגימות ביולוגיות קטנות במיוחד, ובכך פותחת אפשרויות רבות לניתוח דגימות מסוג זה בתחומי המדעים הביו-רפואיים, תחומי הכימיה הביואנליטית ותחומי המחקר בחוץ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחבר CE לטרשת נפוצה באמצעות ממשק נקבובי חסר מעטפת לפרופיל של מטבוליטים קוטביים וטעונים מאוד.