Name: Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: למד פרופיל מטבולי של מטבוליטים טעונים וקוטביים בדגימות ביולוגיות קטנות באמצעות CE-MS עם ממשק porous tip ללא sheath. שיטה זו משפרת רגישות ועמידות לניתוח מטבולומיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ד"ר ראווי רמוטאר מבקש להכיר בתמיכה הכספית של תוכנית המענקים Veni של ארגון המחקר המדעי ההולנדי (NWO Veni 722.013.008).

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן לשימוש sheathless CE-MS ללימודי פרופיל מטבולי הוא לשימוש במעבדה בלבד. הנהלים המפורטים להלן מבוססים על 4,5 יצירה שפורסם לאחרונה. ניתן למצוא את פרטי ניסוי לעומק במסמכים אלה. לפני השימוש בפרוטוקול זה, להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS). השתמש כל נהלי הבטיחות במעבדה המתאימים, לרבות משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות, כאשר עורכי הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה. 1. הכנת פתרונות ריאגנטים דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת האלקטרוליט רקע (BGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון BGE חדש (10% (v / v) חומצה אצטית, pH 2.2) כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9.0 מ&quot;ל של מים לתוך בקבוקון זכוכית 10 מ&quot;ל ולהוסיף 1.0 מ&quot;ל של חומצה אצטית במים במנדף. מערבבים את הפתרון ביסודיות בעזרת מערבולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת המטבוליט standarתערובת ד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 μl של תערובת רגילה 50 מיקרומטר קטיון המכיל 60 מטבוליטים קטיוני לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. חנות ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 μl של תערובת תקן אניון 50 מיקרומטר המכיל 30 מטבוליטים anionic לתוך 50 μl של מים ומערבבים הפתרון ביסודיות. אחסן את הפתרון הזה, ב aliquots כדי למנוע מחזורי הקפאה / פשרה של אותה התערובת רגילה, ב -80 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש. הערה: המטבוליט תערובות תקן יציבות במשך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים כראוי ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות מקו תא גליובלסטומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את תאי U-87 MG גליובלסטומה אדם החסיד שלוש פעמים עם 1 מיליליטר פתרון נתרן כלורי 0.9% קרים כקרח 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר פתרון מתנול קר כקרח / מים (8/2, V / V) על התאים החסידים ולהתרפס באמצעות גומי הטה תא מגרד 21. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הפתרון מתנול / מים בצינור ואת ultrasonicate למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כלורופורם לשבר מתנול / מים (יחס הסופי 8/8/2, נ / V / V) ו צנטריפוגות מדגם למשך 10 דקות ב 16,100 XG ו -4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת מתנול / מים להתאדות חלק זה באמצעות concentrator ואקום. מחדש את החומר היבש ב 50 מי μl לניתוח על ידי sheathless CE-MS. כאשר אינו בשימוש לאחסן את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת מערכת Sheathless CE-MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה של המחסנית התמזג-סיליקה החשוף עם פולט הקצה הנקבובי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדש עם פולט קצה נקבובי (30 מיקרומטר אורך כולל פנימיים בקוטר x 90 סנטימטרים) במכשיר CE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לשטוף קדימה ב 50 psi במשך 15 דקות עם תוכנת שליטה על מכשיר לספירה באמצעות מתנול 100% ו חזותית לבדוק אם נוזל זורם החוצה מן capilשקע Lary במהלך שלב שטיפה זו. כמו כן לבצע שטיפה בכיוון ההפוך ב 50 psi במשך 5 דקות באמצעות פתרון BGE חזותי לבחון האם הנוזל זורם החוצה מן נימי מוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1.2 בלחץ של 100 psi במקרה שאין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במוצא הנימים. התקן מחסנית התמזג-סיליקה חשוף חדשה אם אין היווצרות טיפת נוזל נצפתה במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את נימי ההפרדה עם מים ב 50 psi במשך 10 דקות, ואחריו 0.1 M NaOH ב 50 psi במשך 10 דקות, ולאחר מכן על ידי מים ב 50 psi במשך 10 דקות ולבסוף עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות. הערה: שלבים 2.1.1 עד 2.1.4 נדרשים רק עבור ההתקנה של מחסנית נימים חדשה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צימוד של פולט קצה הנימים הנקבובי כדי ESI-MS הערה: לפני צימוד נימי CE ל- MS, להבטיח כי המכשיר MS כבר מכויל ומחובר למערכת CE. הגדר את מתח ESI כדי0. התאימו את מכשיר MS עם מקור nanospray. גז 1 גז 2 ותנור חימום בטמפרטורה ממשק לא יושמו כפי ESI ברמות ספיקה נמוכה מאוד מתרחשת רק על ידי יישום מתח ספריי יון להגדיר ב 1500 V. סט הווילון 5 psi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקצה המרסס של המחסנית-סיליקה התמזגה מצינור המים התקנת אותו מתאם מקור nanospray עבור צימוד למכשיר MS. ודא כי הגובה של בקבוקוני BGE במכשיר CE להתאים את גובה הטיפ המרסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק זרימת הנוזל דרך נימי מוליך על ידי שטיפה עם BGE ב 50 psi במשך 5 דקות. במהלך שטיפה זה צעד במערך ירידה בבסיס המחט מרסס ESI יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את נימי ההפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 10 דקות לכיוון קדימה. היווצרות Drop יש לשים לב בקצה של פולט הקצה הנקבובי (טיפ מרסס) במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פולט הקצה הנקבובי לכניסה של כניסת MS ממרחק של גIRCA 2 עד 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח של 30 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 1 דק &#39;ולהתחיל רכישת נתונים MS בטווח m / z מ -65 ל -1,000 מ&#39; / z ללימודי פרופיל מטבולי באמצעות הראשון מתח ESI של 0. הערה: הספקטרום מונית צריך להיות ריק אות כמו שלא צריך להיות שום electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מתח ESI 1,000 V תוך להמשיך מדידת נתונים. להגביר את מתח ESI בקפיצות של 200 V עד אות רקע מתמדת הוא ציין עבור 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את עמדת פולט קצה הנקבובית ביחס במרכז כניסת MS על ידי הזזת אותו x, y, או z-הכיוון כדי לראות אילו עמדה ספק המקסימאלי שניתן אות MS היציבה ביותר (electropherogram יון הכולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אופטימיזציה של המיקום של פולט הקצה הנקבובי וקביעת מתח ESI האופטימלי, להגדיר את מתח ESI ל -0 V ולהפחית את מתח CE מ 30 קילו עד 1 קילו וולט באמצעות זמן רמפה של 5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור usin שיטת MSg מתח ESI אופטימלית שיטה לספירה על המכשיר CE לניתוח סטנדרטים המטבוליט דגימות ביולוגיות. </li></ol></li></ol> 3. ניתוח של תקני המטבוליט ו דגימות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ביצועים של מערכת CE-MS sheathless <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של התערובת תקן המטבוליט anionic לתוך microvial 100 μl ריק (בקבוקון PCR) אשר נכנס לתוך בקבוקון CE ולשים בקבוקון זה במגש מדגם מפרצון. הערה: ההיקף המינימאלי הנדרש microvial עבור זריקה אמינה הוא 2 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שיטת מצב יונים שלילי רכישת MS שנוצרה במהלך השלב 2.2.9 ולאחר מכן להתחיל את רצף CE באמצעות תוכנת שליטה על המכשיר לספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את נימי הפרדה עם BGE ב 50 psi במשך 3 דקות ואחריו הזרקה ב 2.0 psi במשך 60 שניות (20 nl מתאימים 3% מנפח הנימים) ולאחר מכן על ידי הזרקת BGE ב 1.0 psi במשך 10שניות. הערה: בהמשך, MS רכישת נתונים מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח של -30 ק עם זמן רמפה של 1.0 דקות עם לחץ של 0.5 psi במשך 30 דקות ב המפרצון. לאחר הפרדה 30 דקות electrophoretic, לעצור רכישת נתונים MS ולהפחית את המתח CE ל -1 קילו וולט באמצעות זמן הרמפה של 5 דקות (ירידה הדרגתית של מתח CE לאחר הפירוד electrophoretic משפר את העמידות של פולט נימי טיפ נקבובי). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין זריקות מדגמות, יש לשטוף את הנימים עם מים, 0.1 M נתרן הידרוקסידי, מי BGE כל 30 psi במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט anionic המנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך אם אמות המידה המטבוליט anionic להופיע באיזור שבין 10 ו -28 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם שלושת האיזומרים הקשורות מבנית, כלומר, D- גלוקוז-1-פוספט, D- גלוקוז-6-פוספט ו- D-פרוקטוז-6-פוספט הםחלקית מופרד, כלומר, ההחלטה בין שני השיאים הראשונים היא בסביבות 0.75 ושל שני השיאים האחרונים היא בסביבות 0.50 (ראה איור 1). הערה: על-פי החלטה 1.5 מצביעה על פרדת בסיס של שתי פסגות סמוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור תערובת המטבוליט קטיוני. ודא כי זיהוי טרשת נפוצה היא כעת במצב יון חיובי ומתח CE הוא +30 ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים שנרשמו על ידי קביעת הפעמים הגירה ואת עוצמת האות של תערובת המטבוליט קטיוני המנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך אם אמות המידה המטבוליט קטיוני להופיע באיזור שבין דקות 8 ו -22. בדוק אם isoleucine ו לאוצין הם נודדים בין 15 ל 15.5 דקות ולקבוע אם ההחלטה היא בסביבות 0.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי anionic של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: con מטבוליתאוהל המתקבל לאחר טיפול מקדים מדגם מקביל צפיפות התאים של בסביבות 20 תאים / NL, ולכן, זריקה 20 NL הוא המקבילה של 400 תאים לכל ניתוח. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור electropherogram יון חילוץ עבור חומצה לקטית המטבוליט (m / z 89.0243) באמצעות 5 דיוק המוני מד&quot;א לבדוק אם עוצמת האות הוא מעל 100,000 ספירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1 ו 3.1.2 עבור פרופיל מטבולי קטיוני של תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה. הערה: electropherogram יון הכולל ביותר עתיר ידע יש לשים לב עבור זריקה 20 NL במצב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוחים או כאשר אינו בשימוש, יש לשטוף את הנימים עם מים ב 50 psi במשך 15 דקות ולאחסן חלק המפרצון של הנימים בתוך מים המכילים בקבוקון בסעיף הנקבובי (חלק לשקע) בצינור גם המכיל מים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+metabolomics%3A+strategies+to+understand+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li>
<li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+serum+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957(2011).</li>
<li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li>
<li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li>
<li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li>
<li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li>
<li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CE%2FLC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li>
<li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li>
<li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+%28CE-ESI-MS%29-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li>
<li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li>
<li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+advances+in+separation+science+for+metabolomics%3A+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li>
<li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li>
<li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trac-Trend+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li>
<li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li>
<li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces%3A+fundamental+concepts+and+technical+developments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li>
<li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li>
<li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li>
<li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li>
<li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies%3A+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

שיטת sheathless CE-MS העסקת פולט קצה נקבובי הוצגה לניתוח מטבוליטים קוטב והטעון. תכונה ייחודית של גישה זו היא כי מטבוליטים anionic או קטיוני ניתן צדודית רק על ידי החלפת זיהוי הטרשת הנפוצה קוטביות CE מתח. קיים מגוון רחב של מטבוליטים קוטב וטעונים דגימות ביולוגיות ניתן לנתח עם יעילות הפרדה גבוהה, שהוא חיוני עבור מטבוליטים דומים מבני, ועם מגבלות של גילוי בטווח (הנמוך) ננו-מולר. הפרוטוקול המובא התמקד השימוש sheathless CE-MS עבור פרופיל מטבולי של תמציות התא על מנת להדגים את התועלת של השיטה עבור פרופיל מטבולי של דגימה ביולוגית. הגישה המתוארת כאן יכולה לשמש גם עבור פרופיל מטבולים של סוגים אחרים של דגימות ביולוגיות, כגון שתן אדם 5, בהתחשב בכך הליך מקדים מדגם נאות משמש. Sheathless CE-MS methoד מבוסס על פולט קצה נקבובי אשר מאפשר את השימוש של הנכס נמוך זרימת מיסודם של CE. בהקשר זה, אות ESI יציבה היא תנאי מוקדם ללימודי פרופיל מטבולי לשחזור. לפיכך, חשוב כי הקצה המרסס ממוקם כראוי מול כניסת MS. בשנת הקמה זה, תהליך ESI הוא בעיקר תלוי באופי של BGE ולכן, אופטימיזציה BGE היא קריטית. תצורת sheathless היא פחות צדדית בהשוואה למערכות נדן נוזל CE-MS שבו כל מיני יצירות נדן נוזלי ניתן להוסיף כדי לשפר את יעילות יינון. המחט מרסס ESI sheathless צריך להיות מלא לחלוטין עם נוזל מוליך (כלומר, פתרון BGE). אות ESI יציבה יכולה לנבוע נימים חלקיות או מחוברות היטב. שטיפה בלחץ גבוה עם BGE עשויה לפתור בעיה זו. אחרת נימי ההפרדה צריכה להיות מוחלפות. לפני הערכת ביצועים אנליטיים, אות רקע ESI יציבהצריך להיווצר הראשון אשר עולה בקנה אחד מ יום אחד למשנהו. המופע האנליטית של שיטת CE-MS sheathless ללימודי פרופיל מטבולי צריך להיבדק מדי יום באמצעות תערובות תקן המטבוליט. תחת אותם תנאים ניסיוניים, פעמים הגירה עקבית, כלומר, וריאציה מתחת ל -3% עבור בתוך ימים (n = 10) ובין-יום (n = 5) באמצעות הזרקת 20 nl של תערובת תקן המטבוליט (12.5 מיקרומטר), שיא גבהים / אזורים (וריאציה מתחת ל -15%) ואת מספר לוחית רישוי (הנע בין 60,000 ו 400,000) יש לקבל. מגבלות של גילוי צריכות להיות בטווח nanomolar בתקני המטבוליט ביותר. רק כאשר יתקיימו התנאים הבאים הוא השיטה מוכנה פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות. אם לא, מכשיר MS צריך להיות מכוון מחדש מכויל או פולט נימי טיפ הנקבובי צריך להיות שונה. צעד שטיפה יעיל בין CE-MS מנתח הוא בעל חשיבות גבוהה, לא רק כדילמנוע שריד פוטנציאל אלא גם כדי לשמור על ביצועי ההפרדה. שריד פוטנציאלי עשוי להיגרם על ידי בקבוקוני BGE מזוהמים המדגם ולכן לפתור על ידי החלפה עם בקבוקוני BGE חדשים. כאשר שיטת sheathless CE-MS אינה בשימוש, חשוב לנתק את נימי הפרדה לאחסן בצד המפרצון של הנימים במים מבחוץ שקוע עם שרוול ההגנה בתוך שפופרת המכילה מים להאריך חי נימים. לסיכום, שיטת CE-MS sheathless המוצע מראה פוטנציאל חזק עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות כאשר נעשה שימוש בהתאם לנהלי דיווח בפרוטוקול זה. בשלב זה, נתוני ההשוואה הבין-מעבדה נדרשים בהחלט עבור CE-MS sheathless כדי להעריך את שחזור (לטווח ארוך) וחוסנם של גישה זו עבור metabolomics. פרוטוקול זה עשוי לעורר מחקר כזה. אתגרים אנליטיים שונים עדיין צריכים להילקח בחשבון. לקבלת ביצועים זו אופטימליתormance, הזרם CE צריך להישמר רצוי מתחת ל -5 מיקרו-אמפר ובשלב זה קרינת טיפ נקבובי נימי ניתנים רק באורך של 91 ס&quot;מ אשר עשוי לעכב התפתחות של מבחני תפוקה גבוהה. יתר על כן, חיץ הפרדת pH נמוך שמש פרופיל מטבולי anionic אשר לא יכול להיות האופטימלי ביותר להשגת פרדת בסיס של פוספטים סוכר הקשורות מבני. חשוב גם הוא כי מטבוליטים anionic רק ניתן לנתח אשר (חלקית) טעונים שלילי בתנאי ההפרדה המשומשים. השלב הבא הוא להעריך את התועלת של השיטה CE-MS sheathless ללימודי פרופיל מטבולי קליניים כרגע, פולט נימי טיפ נקבובי יחיד יכול לשמש רק עבור ניתוח של עד 100 דגימות ביולוגיות. בסך הכל, התפתחות נוספת בגישה sheathless CE-MS תפתח כיוון חדש בתחום metabolomics, כלומר, לקראת הבנה עמוקה יותר של תפקודים ביולוגיים שבסעיףבמקרים בשפע-מוגבל.

בשנת metabolomics עכשווי, טכניקות הפרדה אנליטית גבוהה סוף משמשים לנתח מגוון רחב של שיעורים המטבוליט על מנת לקבל נציג לקריאה מתוך המצב הפיזיולוגי של אורגניזם 1. המטרה הסופית של מחקר metabolomics היא להשיג תשובה לשאלה ביולוגית / קלינית נתון. נכון לעכשיו, המאגר האנושי metabolome מורכב יותר מ -40,000 ערכים המטבוליט המייצגים הוא תרכובות אנדוגני אקסוגניים (את המקור האחרון מ מזין, חיידקים, סמים ממקורות אחרים) 2. בהינתן המגוון העצום פיסיקלי כימי וטווח ריכוז של מטבוליטים אלה, שיטות אנליטיות מרובות עם מנגנוני הפרדה שונים צריכות לשמש בשילוב במטרה לאפיין מטבוליטים רבים ככל האפשר בתוך דגימה ביולוגית נתונה. לדוגמה, Psychogios et al. השתמשו בשילוב של חמש טכניקות הפרדה אנליטית פרופ מטבוליתiling של נסיוב אדם וכתוצאה מכך זיהוי של יותר מ -4,000 מטבוליטים מגוונים כימי 3. במאמר זה, תשומת לב תשולם אסטרטגיות CE-MS שפותחו לאחרונה על פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות 4,5. ב CE, לייתר דיוק אלקטרופורזה אזור נימים (CZE; המכונה בדרך כלל כמו CE), תרכובות מופרדות על בסיס תשלום לגודל- שלהם היחס, ולכן שיטה אנליטית זו היא מתאימה ביותר לניתוח של מטבוליטים קוטב וטעונים. מנגנון הפרדת CE הוא שונה במהותו מן הטכניקות מבוססות chromatographic, ובכך לספק תצוגה משלים על הרכב מהטבולים של דגימות ביולוגיות 6-8. סוגה ועמיתים לעבודה היו הראשונים להציג את התועלת של CE-MS עבור פרופיל העולמי של מטבוליטים דגימות ביולוגיות 9,10. עד עכשיו, את הכדאיות והתועלת של CE-MS עבור metabolomics הודגמה 11-15 נרחב.CE מצמיד בדרך כלל MS באמצעות נוזלי נדן התממשקות טכניקת 16,17; עם זאת, עקב דילול של קולחי נימים ידי נוזל הנדן, את רגישות הזיהוי נפגעת באופן מהותי. לאחרונה, הוכיח כי שימוש ממשק sheathless שפר בצורה משמעותית את כיסוי זיהוי של מטבוליטים נוכחי דגימות ביולוגיות שונות לעומת CE-MS ניצול ממשק קלסי נדן נוזלי 5,18,19. לדוגמא, בסביבות 900 תכונות מולקולריות אותרו בשתן אנושי ידי sheathless CE-MS בעוד כ -300 תכונות מולקולריות נצפו עם 5 הנדן נוזל CE-MS. הממשק sheathless בשימוש התבסס על פולט קצה נקבובי, אשר הומצא על ידי Moini 20, המאפשר שימוש יעיל של הנכס תזרים נמוך מהותית של CE בשילוב עם ננו-ESI-MS. על מנת לעורר את השימוש sheathless CE-MS בתחום metabolomics,פרוטוקול מוצג המתאר כיצד גישה זו יכולה לשמש עבור הניתוח של מטבוליטים קוטביים מאוד דגימות ביולוגיות, כפי שהודגמה לניתוח תמציות מקו תא גליובלסטומה. הוא הראה כי שיטת CE-MS sheathless עבור הפרופיל של מטבוליטים קטיוני יכולה לשמש גם עבור הפרופיל של מטבוליטים anionic באמצעות אותו בדיוק התנאים נימי והפרדה, ובכך להפחית את זמן ניתוח ומתן פלטפורמה אנליטית אחת עבור הפרופיל העולמי של מטבוליטים טעונים. הפרוטוקול מתאר גם אסטרטגיה עבור היישור היעיל של פולט הקצה הנקבובי sheathless עם מכשיר MS.

<table><tbody><tr><td>מכשיר CESI 8000</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td>מתאם OptiMS נדרש לחיבור CESI ל-MS</td></tr><tr><td>OptiMS מחסנית סיליקה התמזגה, 30&nbsp; &mu; מזהה m x 90&nbsp; ס"מ אורך כולל</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>מתאם OptiMS עבור Sciex Nanospray III מקור</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני CESI</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו בקבוקונים</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>שימוש במכסה אדים</td></tr><tr><td>תערובת מטבוליט קטיוני</td><td>טכנולוגיות</td> <td>מטבולום אנושיH3304-3034</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מטבוליט אניוני</td><td>טכנולוגיות מטבולום אנושי</td><td>H3304-1031</td><td></td></tr><tr><td>מתנול (LC-MS Ultra Chromasolv)</td> <td>סיגמא</td><td>14262</td><td>שימוש במכסה אדים</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>72079</td><td>0.1 M</td></tr><tr><td>U-87 MG קו תאים גליובלסטומה</td><td>סיגמא</td><td>89081402</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא</td><td>650498</td><td>רעיל; שימוש במכסה אדים</td></tr></tbody></table>

sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית profiling של דגימות ביולוגיות

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

בשנת metabolomics, מגוון רחב של שיטות אנליטיות משמש הפרופיל העולמי של (אנדוגני) מטבוליטים בדגימות מורכבות. במאמר זה, פרוטוקול מוצג ניתוח של מטבוליטים anionic ו קטיוני דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסה נימי (CE-MS). CE הוא מתאים היטב בניתוח מטבוליטים קוטב וטעון כמו תרכובות מופרדות על בסיס יחס תשלום לגודל- שלהם. עיצוב ממשק sheathless שפותחו לאחרונה, כלומר, ממשק טיפ נקבובי, משמש צימוד CE כדי electrospray יינון (ESI) MS. גישה זו מאפשרת התממשקות את השימוש היעיל של נכס התזרים נמוך המהותית של CE בשילוב עם MS, וכתוצאה מכך לתחום גילוי nanomolar עבור מגוון רחב של שיעורי המטבוליט קוטב. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על העסקת נימים התמזג-סיליקה חשופה עם פולט קצה נקבובי בתנאי הפרדה הנמוכה pH לניתוח שלמגוון רחב של שיעורים המטבוליט ב דגימות ביולוגיות. הוא הוכיח כי באותו sheathless שיטת CE-MS יכול לשמש עבור פרופיל של מטבוליטים קטיוני, כולל חומצות אמינו, נוקלאוזידים ופפטידים קטנים, או מטבוליטים anionic, כולל פוספטים סוכר, נוקלאוטידים וחומצות אורגניות, על ידי רק מיתוג זיהוי טרשת נפוצה קוטביות מתח ההפרדה. מאוד פרופילי מידע עשיר מטבוליים בדגימות ביולוגיות שונות, כגון שתן, נוזל השדרתי ותמציות של הקו הסלולרי גליובלסטומה, ניתן להשיג על ידי פרוטוקול זה תוך פחות מ 1 שעות של ניתוח CE-MS.

שיטת CE-MS sheathless המוצע היא מסוגלת לספק יעיל ביותר, כלומר, את מספר לוחית רישוי החל 60,000 עד 400,000, פרופילים של מטבולית anionic ו קטיוני ב לתחום גילוי nanomolar באמצעות 10% חומצה אצטית (pH 2.2) כמו BGE. מופע הפרדת השיטה לניתוח מטבוליטים anionic הקוטביים מאוד מודגם במשך שלושה איזומרים פוספט סוכר הקשורות מבני (איור 1). למרות הפרדה ההתחלה היה לא השיג שלוש analytes אלה, הפרדה חלקית מספיק כדי לאפשר זיהוי סלקטיבית שלהם על ידי MS כמו analytes אלה יש מסה זהה בדיוק. הפוטנציאל של השיטה CE-MS sheathless עבור פרופיל מטבולי של מספר מוגבל של תאים, כלומר, זריקה 20 nl תואמת 400 תאים (צפיפות התאים הוא בסביבות 20 תאים / NL), הוא הוכיח לניתוח מטבוליטים קטיוני ב תמצית של הקו הסלולרי גליובלסטומה (איור 2), שבו יותר מ -300 תכונות מולקולריות אותרו מעל ≥ S / N יחס 5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> איור 1. ניתוח של איזומרים פוספט סוכר ידי sheathless CE-MS. Electropherogram יון מחולץ עבור שלושת האיזומרים פוספט סוכר (25 מיקרומטר) שהושג עם sheathless CE-MS במצב יונים שליליים. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, -30 קילו וולט (psi 0.5 להחיל על המפרצון של הנימים לספירה); הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. לשכפל באישור 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> ניתוח איור 2. של isoleucine ואניeucine ידי electropherogram יון sheathless CE-MS. שחולצו משני איזומרים חומצת אמינו (25 מיקרומטר) שהושג עם sheathless CE-MS במצב יון חיובי. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, +30 ק ו; הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> פוטנציאל איור 3. sheathless CE-MS לאפיון מטבוליטים קטיוני בתמצית שורת תאים. הפרופיל המטבולי (electropherogram יון הכולל) שנצפתה תמצית של שורת תאים גליובלסטומה עם sheathless CE-MS במצב יון חיובי. תנאי ניסוי: BGE, 10% חומצה אצטית (pH 2.2); מתח הפרדה, +30 ק ו; הזרקת מדגם, 2.0 psi במשך 60 שניות. לשכפל באישור 4 </sעד&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש באלקטרופורזה קפילרית-ספקטרומטריית מסה, או CE-MS, באמצעות ממשק בעל קצה נקבובי ללא מעטפת (sheathless), לצורך ניתוח של מטבוליטים טעונים ובעלי קוטביות גבוהה. בהנחה שמרבית המטבוליטים עשויים להיות טעונים, בין אם קטיוניים או אניוניים, הרי שהפרדות אלקטרוליטיות כגון אלקטרופורזה קפילרית הן השיטה המתאימה ביותר להפרדתם. עם זאת, בשנים האחרונות, הרגישות לא הייתה מספקת.זאת נבעה מהממשק והשיטה גם לא הייתה חסונה. אך אני סבור שפתרנו היטב את שתי הבעיות באמצעות שימוש במעטפת כממשק חופשי ובשימוש בפרוטוקול חדש זה. ניתן להשתמש באלקטרופורזה קפילרית-ספקטרומטריית מסות המשתמשת בממשק קצה נקבובי חדשני ללא מעטפת למתן מענה לשאלות קליניות מרכזיות בתחום המטבולומיקה.לדוגמה, ניתן לבצע בקלות פרופילינג של מטבוליטים טעונים בעלי קוטביות גבוהה באמצעות טכנולוגיה זו. תרכובות מופרדות על בסיס יחס הטעינה לגודל. לרוב, טכניקה זו מתאימה מאוד לפרופילינג של סוג זה של תרכובות המצויות בדגימות ביולוגיות.מאפיין ייחודי של מתודולוגיית ה-CE-MS ללא מעטפת (sheathless) המוצעת הוא שניתן להשתמש בה לפרופיל של מטבוליטים אניוניים וקטיוניים רק על ידי שינוי קוטביות המתח ב-CE וקוטביות הגילוי ב-MS. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים מכיוון ש-CE-MS נחשבת לטכניקה חדשה ומורכבת יחסית. כדי להתחיל בהליך זה, הכניסו מחסנית סיליקה מותכת נקייה בעלת פולט עם קצה נקבובי למכשיר electrophoresis של קפילריה (CE).בצע שטיפה קדימה במתנול בלחץ של 50 psi למשך 15 דקות באמצעות התוכנה השולטת במכשיר ה-CE. בדוק ויזואלית האם נוזל זורם מפתח הנימה. לאחר מכן, בצע שטיפה בכיוון ההפוך בלחץ של 50 psi למשך חמש דקות באמצעות האלקטרוליט של הרקע, או תמיסת BGE, כדי לבחון ויזואלית האם נוזל זורם מהנימה המוליכה.חזור על השלב הקודם בלחץ של 100 psi במקרה שלא נצפתה זרימה של נוזל מפתח הנימה. לאחר מכן, שטוף את נימת ההפרדה במים בלחץ של 50 psi למשך 10 דקות, לאחר מכן בנתרן הידרוקסיד בריכוז 0.1 molar בלחץ של 50 psi למשך 10 דקות, במים בלחץ של 50 psi למשך 10 דקות, ובתמיסת BGE בלחץ של 50 psi למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את קצה המרסס של מחסית הסיליקה המותכת מצינור המים והתקנו במתאם מקור הננו-ספריי לצורך חיבור למכשיר ה-MS.יש לוודא שגובה מבחולות תמיסת ה-BGE במכשיר ה-CE תואם לגובה קצה המרסס. יש לבדוק את זרימת הנוזל דרך הנימים המוליכים על ידי שטיפה עם תמיסת BGE בלחץ של 50 psi למשך חמש דקות. במהלך שלב שטיפה זה, יש להבחין בטיפת נוזל בבסיס מחט המרסס של יינון ברסס אלקטרוסטטי, או ESI.לאחר השטיפה, שטפו את קפילרת ההפרדה עם תמיסת BGE בלחץ של 50 psi למשך 10 דקות בכיוון קדימה. במהלך שלב זה, יש להבחין בטיפת נוזל בקצה פולט הטיפ הפורוזי. כעת, מקמו את פולט הטיפ הפורוזי בכניסה של כניסת ה-MS במרחק של כשני עד שלושה מ"מ.החל את מתח של 30 kV תוך זמן עלייה (ramp time) של דקה אחת והתחל ברכישת נתוני MS בטווח יחס מסה-למטען של 65 עד 1000 לצורך מחקרי פרופיל מטבולי, כאשר תחילה מתח ה-ESI יהיה אפס. הגדר את מתח ה-ESI ל-1000 V תוך כדי מדידת הנתונים. הגדל את מתח ה-ESI במרווחים של 200 V עד שיתקבל אות רקע קבוע למשך 15 דקות לפחות.העבירו 20 µL של תערובת סטנדרט של מטבוליטים אניוניים שהוכנה מראש לתוך מיקרו-מבחנה ריקה בנפח 100 µL. הניחו את המיקרו-מבחנה בתוך מבחנת CE, והניחו את מבחנת ה-CE במגש דגימות הכניסה. הפעילו שיטת רכישת MS במצב יונים שלילי שהוגדרה מראש, ולאחר מכן הפעילו את רצף ה-CE באמצעות התוכנה השולטת במכשיר ה-CE.לאחר מכן, שטפו את קפילרית ההפרדה עם תמיסת BGE בלחץ של 50 psi למשך שלוש דקות, ולאחר מכן בצעו הזרקות בלחץ של two psi למשך 60 שניות ו-one psi למשך 10 שניות. הגבירו את המתח ל-30 kV עם זמן עלייה של דקה אחת, והפעילו לחץ של 0.5 psi בכניסה למשך 30 דקות. לאחר הפרדה אלקטרופורטית של 30 דקות, הפסיקו את רכישת נתוני ה-MS והנמיכו את מתח ה-CE ל-1 kV עם זמן ירידה של חמש דקות.בין הזרקות של דגימות, שטפו את קפילרית ההפרדה במים, נתרן הידרוקסיד 0.1 molar, מים, ותמיסת BGE בלחץ של 30 psi למשך שלוש דקות. עם סיום ההרצות, נתחו את הנתונים שהוקלטו על ידי קביעת זמני הנדידה ועוצמת האות של תערובת המטבוליטים האניוניים שנותחו. בדקו האם הסטנדרטים של המטבוליטים האניוניים מופיעים באזור שבין 10 ל-28 דקות.לאחר מכן, בדוק האם שלושת האיזומרים בעלי הקשר המבני, D-glucose 1-phosphate, D-glucose 6-phosphate, ו-D-fructose 6-phosphate, הופרדו באופן חלקי. ביצועי ההפרדה של שיטת ה-CE-MS ללא מעטפת (sheathless) לניתוח של מטבוליטים אניוניים פולריים מאוד מודגמים עבור שלושה איזומרים של סוכר-פוספט בעלי קשר מבני. אף שלא הושגה הפרדה מלאה (baseline separation) עבור שלושת האנליטים הללו, הפרדה חלקית מספיקה כדי לאפשר את זיהוים הסלקטיבי באמצעות MS, מאחר שלאנליטים אלו יש את אותה מסה מדויקת.בעת ניתוח דגימות ביולוגיות, באמצעות מתודולוגיית CE-MS ללא מעטפת זו, חשוב לבדוק באופן קבוע את הביצועים האנליטיים לאורך זמן באמצעות סטנדרטים אקדמיים. באופן כללי, המתודולוגיה ללא המעטפת מאפשרת ביצוע פרופיל של תרכובים מסוג זה בדגימות ביולוגיות קטנות במיוחד, ובכך פותחת אפשרויות רבות לניתוח של דגימות מסוג זה בתחומי המדעים הביו-רפואיים, בתחומי הכימיה הביו-אנליטית ובאזורי מחקר נוספים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחבר CE ל-MS באמצעות ממשק נקבובי ללא מעטפת לצורך ביצוע פרופיל של מטבוליטים טעונים ובעלי קוטביות גבוהה.

sheathless-capillary-electrophoresismass-spectrometry-for-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

פלטפורמת מניפולציה משולבת תא מפותחת לשימוש בשילוב עם התקנה בודדת המסה בדיקה מאסיבית עבור ניתוח מקוון של תאים ההשעיה בודדים תחת תנאי הסביבה.

משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון קורונה ביומולקולרית מלאה, חלבונים ומטבוליטים, שנרכשו על ידי ננו-חומרים מביופלואידים באמצעות אלקטרופורזה נימית – גישת ספקטרומטריית מסה.

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

למד פרופיל מטבולי של מטבוליטים טעונים וקוטביים בדגימות ביולוגיות קטנות באמצעות CE-MS עם ממשק porous tip ללא sheath. שיטה זו משפרת רגישות ועמידות לניתוח מטבולומיקה.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

גלה סרטונים נוספים