שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מולקולות קטנות המסוגלות לשבש את האינטראקציה בין תעלות TRIP8b ו-HCN. שיטה זו מזהה מולקולות מועמדות שניתן לפתח לטיפולים חדשים לדיכאון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשלים אותה בצורה בעלת תפוקה גבוהה.

לטכניקה זו יש השלכות על פיתוח טיפול חדשני להפרעת דיכאון מג'ורי מכיוון שהמעבדה שלנו הראתה כי שיבוש הקישור של TRIP8b ל-HCN עשוי להיות בעל תועלת טיפולית. למרות ששיטה זו פותחה מתוך מחשבה על דיכאון, שיבוש האינטראקציה בין TRIP8b ו-HCN עשוי להיות בעל תועלת טיפולית בהפרעות אחרות כגון כאב כרוני. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה חשובה מכיוון שהיא ממחישה את היתרונות של שימוש במכשירים אוטומטיים בעלי תפוקה גבוהה לקידום מחקר בסיסי ותרגומי במתקנים פתוחים כמו מעבדת ניתוח התפוקה הגבוהה של אוניברסיטת נורת'ווסטרן.

לאחר טיהור מקטע החלבון TRIP8b 241-602 ובחינת אינטראקציות חלבון עם בקרה חיובית על פי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר כמויות של TRIP8b ו-HCN1-FITC ולהשאיר אותם על קרח. השתמש ב-FP Buffer כדי להכין 20 מיליליטר של 2 מיקרו-מולרי TRIP8b ו-50 ננו-מולרי HCN1-FITC. לאחר מכן מחלקים 25 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת מיקרוטיטר שחורה 384 באר מחייבת נמוכה.

להקרנת ספרייה, השתמש במטפל נוזלים אקוסטי כדי להוציא 100 ננוליטר של תרכובות לכל באר של עמודות 3 עד 22 לריכוז סופי של 40 מיקרומול. הוצא 100 ננוליטר של DMSO לכל באר של עמודות 1 ו-23 כבקרות שליליות. הוצא 100 ננוליטר של פפטיד HCN1 ללא תווית לכל באר של עמודות 2 ו-24 כבקרות חיוביות עם ריכוז סופי של 10 מיקרומול.

דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. בעזרת קורא צלחות, מדוד את קיטוב הקרינה. לחלופין, ניתן לאחסן צלחות למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הקריאה.

באמצעות המשוואה הבאה חשב את אחוז העיכוב כאשר XN הוא אחוז העיכוב המנורמל המתאים לאות X.X חיובי הוא האות הממוצע מבארות הבקרה החיוביות ו- X שלילי הוא האות הממוצע מבארות הבקרה השליליות. כדי לאמת להיטים עם מעל 50% עיכוב, הכינו תערובת מאסטר של 20 מיליליטר של 2 מיקרו-מולרי TRIP8b ו-50 ננו-מולרי HCN1 TAMRA במאגר FP. הוציאו 25 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של צלחת מיקרוטיטר שחורה של 384 בארות.

לאחר מכן הוסף 100 ננוליטר של תרכובות מצלחת המכילה דילול סדרתי כפול של כל תרכובת פעילה לבארות המתאימות. עבור בארות הבקרה השליליות הוסף 100 ננוליטר של DMSO. לבקרה חיובית, הוסף 100 ננוליטר של פפטיד HCN1 מדולל סדרתי ללא תווית עם ריכוזים סופיים הנעים בין 200 מיקרומול ל-0.1 מיקרומול.

דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, או בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. בעזרת קורא צלחות מודדים את הקיטוב הקרינה. חשב את ערכי IC50 על ידי התאמת נתוני ה-FP התלויים בריכוז של כל תרכובת באמצעות מודל רגרסיה לא ליניארי של 4 פרמטרים.

הפשירו חלבוני היתוך של HCN1 המתויגים על ידי HIS TRIP8b ו-GST ושמרו אותם על הקרח. הכן 1 מיליליטר של 200 ננו-מולרי HIS TRIP8b ו-20 ננומול של GST-HCN1C40 במאגר בדיקה עבור כל תרכובת שתיבדק. השתמש בפיפטה של 16 ערוצים כדי להוסיף 7 מיקרוליטר מתערובת HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 לשלוש בארות לכל שורה של שורות A עד N כדי לבדוק כל תרכובת בשלוש עותקים.

צנטריפוגה קצרה את הצלחת כדי לוודא שהנוזלים נמצאים בתחתית כל באר, וכדי להסיר בועות. לאחר מכן, הוציאו את תרכובות ה-Hit שייבדקו בצלחת כדי להשיג ריכוז סופי של 200 מיקרומול בשורה A וסיימו עם 0.1 מיקרומול בשורה L. הוסיפו את אותו נפח של DMSO לשורה M. לאחר מכן חלקו פפטיד HCN1 ללא תווית לריכוז סופי של 10 מיקרומול לשורה N. נערו את הצלחת במשך שתי דקות ודגרו במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר. בעזרת מאגר בדיקה, יש לדלל את חרוזי המקבל נגד GST מ-1 עד 50.

בעזרת פיפטה של 16 ערוצים, הוסיפו 3.5 מיקרוליטר מחרוזי המקבל המדוללים לכל באר של הצלחת וערבבו על ידי פיפטינג עדין כדי למנוע יצירת בועות. דגרו את הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה. מדללים את חרוזי התורם של ניקל כלאט 1 עד 50 עם מאגר בדיקה מבלי לחשוף את התערובת לאור.

הוסף 3.5 מיקרוליטר מחרוזי התורם המדולל לכל באר של הצלחת וערבב בעדינות, הימנע מבועות אוויר. אוטמים את הצלחת ומדגרים אותה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות. לאחר מכן השתמש בקורא צלחות כדי לקרוא את הלוח עם פרמטרי המדידה המפורטים כאן.

לבסוף, חשב את ערכי IC50 על ידי התאמת נתונים עבור כל תרכובת באמצעות מודל רגרסיה לא ליניארי של 4 פרמטרים. כדי להעריך את האינטראקציה עם HCN1 TAMRA TRIP8b עבר טיטרציה לריכוז קבוע של HCN1 TAMRA. גרף זה מראה שככל שריכוז TRIP8b עולה, יותר מולקולות HCN1 TAMRA נקשרות והקיטוב עולה.

בניסוי זה, כאשר HCN1 לא מסומן הועבר לריכוז קבוע של TRIP8b ו-HCN1 TAMRA, הפפטיד המסומן נעקר והאות פחת. סינון תפוקה גבוהה מראה את אחוז העיכוב של כל תרכובת המיוצג על ידי נקודות בודדות בגרף. התוצאות של מסך זה משורטטות עם בקרות חיוביות ושליליות, ואחוז העיכוב הממוצע של כל תרכובת על פני שתי ריצות של הבדיקה.

תרכובות המציגות עיכוב של יותר מ-50% אומתו לאחר מכן בניסוי זה. קואורדינטות X ו-Y נקבעו על ידי אחוז העיכוב בשתי ריצות של הבדיקה. בניסוי זה, HCN1C40 מכיל תג GST של מסוף קצה הקושר חרוזי מקבל.

האינטראקציה של תחומי ה-TPR של TRIP8b והטריפפטיד הטרמינלי C של HCN1 מעוררת את החרוז התורם עם אור באורך גל של 680 ננומטר כדי לייצר חמצן סינגל. לבסוף, כפי שמוצג בגרף זה, טיטרציה של ריכוזים הולכים וגדלים של תרכובת הפגיעה NUCC-5953 לריכוז קבוע של TRIP8b ו-HCN1C40 הגבירה את העיכוב של אינטראקציית TRIP8b HCN1. לפני שמתחילים בבדיקת תפוקה גבוהה, יש לאמת את הכנת החלבון ואת הקיטוב הקרינה במבחני קרבה מבוססי חרוזים.

ודא שהחלבון הוא בעל טוהר גבוה. השתמש בחלבון כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים בהקפאה. חשוב להשתמש בריאגנטים באיכות גבוהה, כולל DMSO וטריטון טריים.

אל תשכח שעבודה עם ה-DMSO עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה וזרימה ציטומטרית על מנת לקבוע אם לתרכובות הפגיעה יש פעילות בתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מסך תפוקה גבוהה עם בדיקה מבוססת קיטוב פלואורסצנטי.