איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להדגים בדיקת לכימוס (litmus test) פשוטה ומותאמת לגילוי חיידקים. שיטה זו מתארת כיצד ניתן לשלב אנזים DNA שסורן-RNA המופעל על ידי E.coli עם פלטפורמה להעברת אותים המבוססת על אוראז (urease), כדי ליצור שינוי צבע בתגובה ל-E.coli. שני היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם פשטות הבדיקה והישימות שלה עבור אנזימי DNA שסורני-RNA אחרים המגיבים לאנליטים שונים.

את הפרוצדורה ידגימו Seperh Manchehry ו-Dingran Chang, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה של Dr.Yingfu Li באוניברסיטת McMaster. לאחר הכנת הריאגנטים והבופרים לפי הפרוטוקול הכתוב, הכינו תמיסת מלאי של succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate, או SMCC, על ידי המסה של 1 mg של SMCC ב-676 µL של DMSO. ערבבו במערבל Vortex והניחו על קרח עד לשימוש.

המס מיליגרם אחד של urease במיליליטר של 1x PBS והצב אותו על קרח עד לשימוש. כדי לסנתז DNA של urease, או UrDNA, הוסף 10 µL של LD1 בריכוז 100 µM לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 2.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 140 µL של מים מזוקקים פעמיים ו-40 µL של 10x PBS ובצע ערבוב ב-vortex.

בשלב הבא, הוסיפו 80.5 µL של תמיסת SMCC ומספר 159.5 µL של DMSO. לאחר מכן, ערבבו שוב במכשיר vortex והשתמשו בצנטריפוגת שולחנית לסבב קצר (spin). דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור או בבלוק חימום למשך 60 דקות.

לאחר הדגירה, הוסיפו למבחנה 200 µL של 1x PBS, 60 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-1.5 mL של 100% ethanol קר. ערבבו באמצעות vortex, והדגירו את התגובה בטמפרטורה של 20- °C למשך 30 דקות. סובבו את התמיסה בצנטריפוגה ב-20,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הסירו את supernatant וייבשו את pellet תחת ואקום. הוסיפו ל-pellet המיובש 400 microliters של מלאי urease והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 5 שעות. העבירו 200 microliters של crude conjugate לעמודה של מסנן צנטריפוגי עם סף הפרדה של 100,000 molecular weight cutoff שנשטפה מראש.

סובבו את העמודה בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך חמש דקות. העבירו את 200 µL הנותרים של התוצרי הגולמיים (crude conjugate) לעמודה וסובבו בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוציאו את העמודה והניחו אותה הפוך בתוך מבחנת איסוף חדשה של מיקרופוג בנפח 2 mL.

סבב את העמודה ההפוכה ואת המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 1,000 times g למשך שתי דקות. לאחר הוצאת מבחנת האיסוף, הוסף 30 µL של 1x PBS לעמודת הצנטריפוגה כדי לשטוף את הממברנה לצורך שחזור נוסף של קונג'וגטים. הפוך שוב את העמודה והחזר אותה למבחנת האיסוף.

סובב את העמודה בצנטריפוגה במהירות של 1,000 ×g למשך שתי דקות. הסר את העמודה והשלך אותה. אחסן את ה-UrDNA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C) עד לשימוש.

כדי להרכיב DNAzyme המבצע פירוק RNA המופעל על ידי E.coli, או EC1, ו-UrDNA על חרוזי מגנט, ערבבו היטב את מלאי חרוזי המגנט והעבירו 100 µL מתחילת החרוזים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מעמד רשמי מגנטי לבידוד החרוזים. הסירו את הנוזל העליון באמצעות פיפט והוסיפו למבחנה 150 µL של תמיסות קישור, או BB.

הוצא את המבחנה מהמעמד והקש עליה בעדינות כדי לתלה מחדש את החרוזיים עד לקבלת תמיסה הומוגנית. לאחר חזרה על שטיפת ה-BB פעמיים נוספות כאשר החרוזיים תלויים ב-BB, הוסף 10 µL של EC1 בריכוז 10 µM. ערבב בעדינות על ידי הקשה על המבחנה.

דגרו את התמיסה עם ניעור קל למשך 30 דקות. כדי למנוע שקיעה או התגבשות של החרוזים, הקישו על הפועלה בכל שתי עד שלוש דקות. לאחר מכן, החזירו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה למסגרת המגנטית כדי לבודד את החרוזים והסִירו את העילוי באמצעות פיפטור.

לאחר מכן, השתמשו ב-150 microliters של BB כדי לשטוף את החרוזיים שלוש פעמים. עם השלמת השטיפה, השביו את החרוזיים בנפח כולל של 150 microliters של BB. לתמיסה זו, הוסיפו 15 microliters של UrDNA וחממו את הדגימה בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך שתי דקות, לאחר מכן קררו את התמיסה לטמפרטורת החדר והדגירו למשך שעתיים. החזירו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה למסננת המגנטית כדי לבודד את החרוזיים והספירו את העלה באמצעות פיפטה.

הוסיפו 100 microliters של תמיסת ריאקציה, או RB, ולאחר מכן הוציאו את המבחנה מהמעמד המגנטי והשעיקו בזהירות את החרוזיים. לאחר הכנת תאי E.coli לפי הפרוטוקול הכתוב, בצעו שטיפה מקדימה של מבחנת מיקרופוג של 1.5 milliliter על ידי הוספה וערבוב בוורטקס של 100 microliters של RB. לאחר מכן, השליכו את התמיסה. הוסיפו 15 microliters של EC1 מורכב למבחנה השטופה, לאחר מכן הניחו את המבחנה על המעמד המגנטי ושאבו את העילוי.

הוציאו את המבחנה מהמעמד, הוסיפו 100 µL של RB, והשעו בעדינות את החרוזיים המגנטיים. לאחר שטיפת החרוזיים פעמיים נוספות באמצעות RB והסרת ה-RB, הוסיפו למבחנה 10 µL מדגימת ה-E.coli וערבבו בעדינות את התוכן על ידי תיפוף על המבחנה. לאחר מכן, הדגרימו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

לאחר הדגירה, הוסיפו 90 microliters של מים מזוקקים פעמיים והניחו את המבחנה על המגנט. לאחר הפרדה מגנטית של כ-שלושה דקות, העבירו בזהירות 85 microliters מהנוזל העליון (supernatant) למבחנת מיקרוצנטריפוגה בנפח של 0.5 milliliter. חשוב מאוד לבצע את השאיבה בפיפטה בזהירות, מבלי לשאוב חלק מהחרוזיים המגנטיים.

חרו지를 אלו טעונים באוראז ויייצרו אות חיובי שגוי. הוסיפו 15 µL של 0.04% Phenol red ו-100 µL של תמיסת סובסטרט. לאחר מכן, צלמו תמונות במרווחי זמן ספציפיים כדי לתעד שינוי בצבע.

הצבע ההתחלתי של בדיקת הליטמוס חייב להיות צהוב, המשקף pH של התמיסה הנמוך מ-5.5. במידת הצורך, ניתן לכוונן את ה-pH ההתחלתי של בדיקת הליטמוס באמצעות בופר חלש, כגון בופר סודיום אצטט בריכוז one millimolar ב-pH 5. איור זה מציג את תוצאות בדיקת הליטמוס הבקטריאלית, שבה נעשה שימוש ב-DNAzyme EC1 המבקיע RNA המופעל על ידי E.coli כ-DNAzyme, וב-Phenol red כאינדיקטור pH.

כפי שמעידה היעדרת השינוי בצבע בהיעדרה של E.coli, ה-EC1 הוא ספציפי מאוד ומגלה פעילות מינימלית כלפי חיידקים אחרים. עומק שינוי הצבע תלוי הן במספר תאי ה-E.coli ששימשו בשלב הפעלת ה-DNAzyme והן בזמן שהוקצב לשלב הידרוליזת העוריאה. מספר רב יותר של תאי E.coli יביא לשינוי צבע חזק יותר, וזמן ארוך יותר להידרוליזת העוריאה יאפשר זיהוי של מספר תאים קטן יותר.

גרף זה מציג את השינוי ב-pH כפי שנמדד באמצעות מד pH ידני. נוכחות של 10⁷ תאי E.coli הובילה לעלייה הדרגתית ב-pH בשלוש יחידות בתוך 10 דקות. לעומת זאת, היעדר E.coli לא גרם לשינויים ניתנים לגילוי ב-pH באותם תנאים.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי יוראז (urease) פעילה מאוד, ושטיפה לקויה או זיהום יובילו לתוצאה חיובית שגויה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את נוכחות E.coli בתנאים רלוונטיים יותר, כגון בדיקת איכות מי סביבה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמיחו הבנה טובה של השימוש במבחן לקימאס פשוט לבדיקת E.coli. זכרו כי ניתן להשתמש במבחן זה לזיהוי E.coli פתוגנית, שהיא מסוכנת ביותר. עליכם לעבור הדרכת בטיחות ביולוגית לפני ביצוע בדיקות כלשהן עבור חיידקים פתוגניים.