Name: איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: למדו שיטה פשוטה לאיתור חיידקים E. coli באמצעות מבחן לקמוס משופץ המבוסס על DNAzyme ואוראז. השיטה מייצרת שינוי צבע חזותי מהיר וספציפי לזיהוי נקודתי בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון לפרויקט מחקר זה סופק על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) באמצעות מענק גילוי ל-YL.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+sense+and+sensibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li>
<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nucleic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התרגום של הפעולה של פעילות מחשוף RNA של DNAzyme חיידק-מגיב מבחן לקמוס מתאפשר באמצעות השימוש באוראז ופרדה מגנטית, כפי שמודגם על ידי איור 1. למרות ההפגנה של נייר לקמוס השונה לגילוי חיידקים היא נעשה עם E. coli תלוי RNA-ביקוע DNAzyme, 5,19,20 העיצוב יכול להתארך באופן כללי לכל DNAzyme ביקוע-RNA. בהינתן הזמינות הרבה של DNAzymes ביקוע-RNA עבור analytes שונים ומתודולוגיות שונות לבודד DNAzymes חדש ביקוע-RNA מבריכות אקראית רצף עבור מטרות חדשות, אנו מצפים...

פתוגנים חיידקיים הם אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה עולמית. התפרצויות מזיהומים שנרכשו בבתי חולים, פתוגנים הנישאים במזון ומזהמים חיידקיים בסביבה מהווים איומים חמורים ומתמשכים על בריאות הציבור ובטיחותו. כדי למנוע התפרצויות אלה, יש צורך בכלים יעילים המאפשרים זיהוי פתוגנים בזמן במגוון מסגרות. בדיקות פשוטות אך עדיין יעילות, ניידות וחסכוניות, נחשקות מאוד, במיוחד באזורים הרגישים להתפרצויות אך אינם יכולים להרשות לעצמם מתקני בדיקה יקרים. 1-3 למרות שקיימות שיטות רבות לאיתור חיידקים, רבות מהן אינן מתאימות ככלי סינון או בדיקה באתר מכיוון שהן דורשות זמני בדיקה ארוכים, מכשירים יקרים והליכי בדיקה מסובכים. 
בדיקות קולורימטריות אטרקטיביות במיוחד עבור יישומי נקודת טיפול או שטח מכיוון שניתן לזהות בקלות שינויי צבע בעין בלתי. בדיקת הלקמוס ל-pH היא פשוטה, מהירה ויעילה. למרות שמדובר בטכנולוגיה ישנה מאוד, היא עדיין נמצאת בשימוש נרחב כיום בגלל הפשטות והיעילות שלה. באופן מפתיע, בדיקה פשוטה זו מעולם לא שונתה כדי להשיג זיהוי של אנליטים אחרים לפני שפיתחנו לאחרונה גישה של שינוי בדיקה זו לבדיקת E. coli. 4
בדיקת הלקמוס המורחבת לאי קולי משתמשת בשלושה מרכיבים נוספים: DNA מבקע RNA המופעל על ידי E. coli (EC1), 5 אוראז וחרוזים מגנטיים. DNAzymes מתייחסים למולקולות DNA סינתטיות חד-גדיליות בעלות פעילות קטליטית. 6 ניתן לבודד אותם ממאגרי DNA ברצף אקראי באמצעות ברירה במבחנה. 7,8 הם יציבים ביותר וניתן לייצר אותם בצורה חסכונית באמצעות סינתזת DNA אוטומטית ביעילות גבוהה. 9 מסיבות אלה, DNAzymes, במיוחד DNAzymes מבקעי RNA, נבדקו באופן נרחב עבור יישומי חישה ביולוגית. 6,10,11 חיישני DNAzyme חודרי RNA פותחו לאיתור יוני מתכת,12-16 מולקולות קטנות,17,18 פתוגנים חיידקיים5,19-21 ותאים סרטניים. 22 בהתחשב בזמינות הגדולה של DNAzymes מבקעי RNA המושרים על ידי מטרה, ניתן להרחיב כל בדיקה המשתמשת ב-DNAzyme כדי לזהות מגוון רחב של אנליטים.
אוראז נבחר בשל יכולתו להידרוליזה של אוריאה לאמוניה,23,24 וכתוצאה מכך עלייה ב-pH. אוראז הוא גם יעיל ביותר, יציב וניתן לצימוד לביומולקולות אחרות. לכן, הנחנו שצימוד של DNA מחשוף RNA עם אוראז יאפשר שימוש בבדיקת לקמוס לזיהוי מטרות אחרות. 5
פעולת ה-DNAzyme המבקע RNA מועברת לעלייה מתווכת שתן של pH באמצעות שימוש בחרוזים מגנטיים המשותקים עם מצומד ה-DNAzyme-urease. מכיוון שפעילות ה-DNAzyme הנחקרת תלויה אך ורק ב-E. coli, נוכחותו של חיידק זה בתמיסת הבדיקה תביא לשחרור אוראז מהחרוזים המגנטיים לתמיסה, אשר לאחר מכן נלקח ומשמש להידרוליזה של אוריאה בתמיסת מדווח המכילה צבע רגיש ל-pH. התוצאה הסופית של הליך זה היא שינוי צבע שניתן לדווח עליו בנוחות על ידי נייר הצבע או ה-pH.

<table><tbody><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td> <td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH) BIO</td><td>BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 40% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>קסילנציאנול FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% נתרן דודציל סולפט</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>מעבדות קלדון בע"מ</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)</td><td>ביושופ קנדה בע"מ.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (II) הקסהידרט</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td><td>אמרסקו</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט טריהידרט (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול מסחרי אתנול</td><td></td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילן-אתילנדיאמין (TEMED)</td><td>אמרסקו</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% פנול אדום</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 מאגר תגובה פולינוקלאוטיד קינאז</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase מאגר תגובה</td><td>Bio Basics קנדה</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז (5 U/&#956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) מרק</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז (10 U/&#956; l)</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td><td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>392187 לוחות זכוכית</td><td>CBS מדעי</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>מרווחים בעובי 0.75 מ"מ</td><td>CBS מדעי</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>מסרק 12 בארות</td><td>CBS מדעי</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>מנורת UV</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר (NanoVue)</td> <td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>לוח מתכת</td><td>CBS מדעי</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה ג'ל</td><td>CBS מדעי</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO מסננים צנטריפוגליים</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>חרוז מגנטי (BioMag)</td> <td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>מתלה הפרדה מגנטי</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק (0.22 & #956; m)</td> <td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>צינור תרבית 14 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson מנקה אולטרסאונד</td><td>מצלמת ברנסון</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

ישנן דרישות הולכות וגדלות לשיטות פשוטות אך עדיין יעילות שניתן להשתמש בהן כדי לזהות פתוגנים ספציפיים עבור יישומי נקודת טיפול או שדה. שיטות כאלה צריכות להיות ידידותיות למשתמש ולהפיק תוצאות אמינות שניתן לפרש בקלות על ידי מומחים ולא מקצועיים כאחד. בדיקת הלקמוס ל-pH היא פשוטה, מהירה ויעילה מכיוון שהיא מדווחת על ה-pH של דגימת בדיקה באמצעות שינוי צבע פשוט. פיתחנו גישה לנצל את מבחן הלקמוס לזיהוי חיידקים. השיטה מנצלת DNA חוצץ RNA ספציפי לחיידק כדי להשיג שתי פונקציות: זיהוי חיידק מעניין ומתן מנגנון לשליטה בפעילות האוראז. באמצעות שימוש בחרוזים מגנטיים המשותקים עם מצומד DNAzyme-urease, נוכחות חיידקים בדגימת בדיקה מועברת לשחרור אוראז מחרוזים לתמיסה. האוראז המשוחרר מועבר לתמיסת בדיקה להידרוליזה של אוריאה לאמוניה, וכתוצאה מכך עלייה ב-pH שניתן לדמיין באמצעות בדיקת הלקמוס הקלאסית.

העיקרון של הנייר לקמוס חיידקי מוסבר באיור 1 המבחן משתמש בשלושה חומרי מפתח:. DNAzyme ביקוע-RNA כי הוא מופעל על ידי חיידק ספציפי, באוראז וחרוזים מגנטיים. DNAzyme משמש כאלמנט הכרה המולקולרי להשיג זיהוי ספציפי מאוד של חיידק עניין. באוראז וחרוזי מגנטים משמשים להשגה הולכים אותות של פעילות RNA-המחשוף של DNAzyme. זה כרוך ביצירת חרוזים מגנטיים המכילים conjugates באוראז-DNAzyme. בנוכחות של חיידק היעד, הצמדת RNA שלו ודבק DNAzyme. פעולה זו מעל...

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי קולורימטרי של E. coli באמצעות בדיקת לקמוס שונה המנצלת DNAzyme, אוראז וחרוזים מגנטיים.

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להדגים בדיקת לכימוס (litmus test) פשוטה ומותאמת לגילוי חיידקים. שיטה זו מתארת כיצד ניתן לשלב אנזים DNA שסורן-RNA המופעל על ידי E.coli עם פלטפורמה להעברת אותים המבוססת על אוראז (urease), כדי ליצור שינוי צבע בתגובה ל-E.coli. שני היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם פשטות הבדיקה והישימות שלה עבור אנזימי DNA שסורני-RNA אחרים המגיבים לאנליטים שונים.את הפרוצדורה ידגימו Seperh Manchehry ו-Dingran Chang, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה של Dr.Yingfu Li באוניברסיטת McMaster. לאחר הכנת הריאגנטים והבופרים לפי הפרוטוקול הכתוב, הכינו תמיסת מלאי של succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate, או SMCC, על ידי המסה של 1 mg של SMCC ב-676 µL של DMSO. ערבבו במערבל Vortex והניחו על קרח עד לשימוש.המס מיליגרם אחד של urease במיליליטר של 1x PBS והצב אותו על קרח עד לשימוש. כדי לסנתז DNA של urease, או UrDNA, הוסף 10 µL של LD1 בריכוז 100 µM לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 2.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 140 µL של מים מזוקקים פעמיים ו-40 µL של 10x PBS ובצע ערבוב ב-vortex.בשלב הבא, הוסיפו 80.5 µL של תמיסת SMCC ומספר 159.5 µL של DMSO. לאחר מכן, ערבבו שוב במכשיר vortex והשתמשו בצנטריפוגת שולחנית לסבב קצר (spin). דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור או בבלוק חימום למשך 60 דקות.לאחר הדגירה, הוסיפו למבחנה 200 µL של 1x PBS, 60 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-1.5 mL של 100% ethanol קר. ערבבו באמצעות vortex, והדגירו את התגובה בטמפרטורה של 20- °C למשך 30 דקות. סובבו את התמיסה בצנטריפוגה ב-20,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות.לאחר מכן, הסירו את supernatant וייבשו את pellet תחת ואקום. הוסיפו ל-pellet המיובש 400 microliters של מלאי urease והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 5 שעות. העבירו 200 microliters של crude conjugate לעמודה של מסנן צנטריפוגי עם סף הפרדה של 100,000 molecular weight cutoff שנשטפה מראש.סובבו את העמודה בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך חמש דקות. העבירו את 200 µL הנותרים של התוצרי הגולמיים (crude conjugate) לעמודה וסובבו בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוציאו את העמודה והניחו אותה הפוך בתוך מבחנת איסוף חדשה של מיקרופוג בנפח 2 mL.סבב את העמודה ההפוכה ואת המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 1,000 times g למשך שתי דקות. לאחר הוצאת מבחנת האיסוף, הוסף 30 µL של 1x PBS לעמודת הצנטריפוגה כדי לשטוף את הממברנה לצורך שחזור נוסף של קונג'וגטים. הפוך שוב את העמודה והחזר אותה למבחנת האיסוף.סובב את העמודה בצנטריפוגה במהירות של 1,000 ×g למשך שתי דקות. הסר את העמודה והשלך אותה. אחסן את ה-UrDNA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C) עד לשימוש.כדי להרכיב DNAzyme המבצע פירוק RNA המופעל על ידי E.coli, או EC1, ו-UrDNA על חרוזי מגנט, ערבבו היטב את מלאי חרוזי המגנט והעבירו 100 µL מתחילת החרוזים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מעמד רשמי מגנטי לבידוד החרוזים. הסירו את הנוזל העליון באמצעות פיפט והוסיפו למבחנה 150 µL של תמיסות קישור, או BB.הוצא את המבחנה מהמעמד והקש עליה בעדינות כדי לתלה מחדש את החרוזיים עד לקבלת תמיסה הומוגנית. לאחר חזרה על שטיפת ה-BB פעמיים נוספות כאשר החרוזיים תלויים ב-BB, הוסף 10 µL של EC1 בריכוז 10 µM. ערבב בעדינות על ידי הקשה על המבחנה.דגרו את התמיסה עם ניעור קל למשך 30 דקות. כדי למנוע שקיעה או התגבשות של החרוזים, הקישו על הפועלה בכל שתי עד שלוש דקות. לאחר מכן, החזירו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה למסגרת המגנטית כדי לבודד את החרוזים והסִירו את העילוי באמצעות פיפטור.לאחר מכן, השתמשו ב-150 microliters של BB כדי לשטוף את החרוזיים שלוש פעמים. עם השלמת השטיפה, השביו את החרוזיים בנפח כולל של 150 microliters של BB. לתמיסה זו, הוסיפו 15 microliters של UrDNA וחממו את הדגימה בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך שתי דקות, לאחר מכן קררו את התמיסה לטמפרטורת החדר והדגירו למשך שעתיים. החזירו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה למסננת המגנטית כדי לבודד את החרוזיים והספירו את העלה באמצעות פיפטה.הוסיפו 100 microliters של תמיסת ריאקציה, או RB, ולאחר מכן הוציאו את המבחנה מהמעמד המגנטי והשעיקו בזהירות את החרוזיים. לאחר הכנת תאי E.coli לפי הפרוטוקול הכתוב, בצעו שטיפה מקדימה של מבחנת מיקרופוג של 1.5 milliliter על ידי הוספה וערבוב בוורטקס של 100 microliters של RB. לאחר מכן, השליכו את התמיסה. הוסיפו 15 microliters של EC1 מורכב למבחנה השטופה, לאחר מכן הניחו את המבחנה על המעמד המגנטי ושאבו את העילוי.הוציאו את המבחנה מהמעמד, הוסיפו 100 µL של RB, והשעו בעדינות את החרוזיים המגנטיים. לאחר שטיפת החרוזיים פעמיים נוספות באמצעות RB והסרת ה-RB, הוסיפו למבחנה 10 µL מדגימת ה-E.coli וערבבו בעדינות את התוכן על ידי תיפוף על המבחנה. לאחר מכן, הדגרימו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.לאחר הדגירה, הוסיפו 90 microliters של מים מזוקקים פעמיים והניחו את המבחנה על המגנט. לאחר הפרדה מגנטית של כ-שלושה דקות, העבירו בזהירות 85 microliters מהנוזל העליון (supernatant) למבחנת מיקרוצנטריפוגה בנפח של 0.5 milliliter. חשוב מאוד לבצע את השאיבה בפיפטה בזהירות, מבלי לשאוב חלק מהחרוזיים המגנטיים.חרו지를 אלו טעונים באוראז ויייצרו אות חיובי שגוי. הוסיפו 15 µL של 0.04% Phenol red ו-100 µL של תמיסת סובסטרט. לאחר מכן, צלמו תמונות במרווחי זמן ספציפיים כדי לתעד שינוי בצבע.הצבע ההתחלתי של בדיקת הליטמוס חייב להיות צהוב, המשקף pH של התמיסה הנמוך מ-5.5. במידת הצורך, ניתן לכוונן את ה-pH ההתחלתי של בדיקת הליטמוס באמצעות בופר חלש, כגון בופר סודיום אצטט בריכוז one millimolar ב-pH 5. איור זה מציג את תוצאות בדיקת הליטמוס הבקטריאלית, שבה נעשה שימוש ב-DNAzyme EC1 המבקיע RNA המופעל על ידי E.coli כ-DNAzyme, וב-Phenol red כאינדיקטור pH.כפי שמעידה היעדרת השינוי בצבע בהיעדרה של E.coli, ה-EC1 הוא ספציפי מאוד ומגלה פעילות מינימלית כלפי חיידקים אחרים. עומק שינוי הצבע תלוי הן במספר תאי ה-E.coli ששימשו בשלב הפעלת ה-DNAzyme והן בזמן שהוקצב לשלב הידרוליזת העוריאה. מספר רב יותר של תאי E.coli יביא לשינוי צבע חזק יותר, וזמן ארוך יותר להידרוליזת העוריאה יאפשר זיהוי של מספר תאים קטן יותר.גרף זה מציג את השינוי ב-pH כפי שנמדד באמצעות מד pH ידני. נוכחות של 10⁷ תאי E.coli הובילה לעלייה הדרגתית ב-pH בשלוש יחידות בתוך 10 דקות. לעומת זאת, היעדר E.coli לא גרם לשינויים ניתנים לגילוי ב-pH באותם תנאים.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי יוראז (urease) פעילה מאוד, ושטיפה לקויה או זיהום יובילו לתוצאה חיובית שגויה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את נוכחות E.coli בתנאים רלוונטיים יותר, כגון בדיקת איכות מי סביבה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמיחו הבנה טובה של השימוש במבחן לקימאס פשוט לבדיקת E.coli. זכרו כי ניתן להשתמש במבחן זה לזיהוי E.coli פתוגנית, שהיא מסוכנת ביותר. עליכם לעבור הדרכת בטיחות ביולוגית לפני ביצוע בדיקות כלשהן עבור חיידקים פתוגניים.

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים פתוגנים העדיפות היא להשתמש phage כתב מהונדסים גנטית. אלה phage הכתב, אשר הן ספציפיות למין מסוים המארח שלהם, הם מסוגלים במהירות transducing תגובה אות bioluminescent לתאי המארח. בזאת, אנו מתארים את השימוש phage הכתב לצורך זיהוי...

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

סרטון זה מדגים שיטת זיהוי קולורימטרית של E. coli, הכוללת סמן ביולוגי של E. coli המפעיל DNAzyme, מה שמוביל לפיצול של קישור RNA וניתוק של צימוד DNAzyme-urase. בדיקה קולורימטרית עוקבת מזהה את הסמן הביולוגי E. coli באמצעות שינויי pH הנגרמים על ידי אמוניה.

זיהוי קולורימטרי של סמן ביולוגי חיידקי באמצעות בדיקת לקמוס שונה

סרטון זה מדגים זיהוי חיידקי כמותי מרובה באמצעות מיקרוספרות פוליסטירן מגנטיות קרבוקסיליות הצבועות לקבוצות נפרדות. ההליך כולל היווצרות קומפלקסים של חיידקי חרוזים, הפרדה מגנטית ואנליזה מבוססת זרימה, המאפשרים כימות מדויק וסימולטני של מספר חיידקים באותה תגובה היטב.

זיהוי כמותי של חיידקים באמצעות מיקרוספרות מגנטיות עם תווית צבע

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן.  המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ומדויק יותר, ואינו דורש ציוד מיוחד.

המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע

למדו שיטה פשוטה לאיתור חיידקים E. coli באמצעות מבחן לקמוס משופץ המבוסס על DNAzyme ואוראז. השיטה מייצרת שינוי צבע חזותי מהיר וספציפי לזיהוי נקודתי בזמן אמת.

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

גלה סרטונים נוספים