הדמיה מולטימודליות וספקטרוסקופיה סיבים צרור פלטפורמת Microendoscopy עבור לא פולשני, In vivo בדיקת רקמות
17 באוקטובר 2016
מתואר ההרכבה והשימוש במיקרואנדוסקופ רב-מודאלי שיכול לרשום במשותף נתוני תמונת רקמה שטחיים עם פרמטרים פיזיולוגיים של רקמות כולל ריכוז המוגלובין, ריכוז מלנין וריווי חמצן. טכניקה זו יכולה להיות שימושית להערכת מבנה רקמות וזילוף, וניתן לייעל אותה לצרכים האישיים של החוקר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא אפיון פונקציונלי של רקמת in vivo על ידי שילוב מידע מבני ברזולוציה גבוהה עם נתונים ספקטרליים כמותיים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון כימות השפעות הטיפול על מיקרו-מבנה רקמות וזילוף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בבדיקה בודדת לאיסוף נתוני תמונה וספקטרוסקופיה מאותו מיקום.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן מערכת העיכול מכיוון שהבדיקה תואמת לטכניקות אנדוסקופיה קונבנציונליות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שאי סדרים קטנים במיקום הבדיקה יכולים להשפיע באופן משמעותי על דיוק הנתונים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבנו את החשיבות של שילוב טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם שיטת ספקטרוסקופיה כמותית.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההכנה בגלל המורכבות של הבנייה והכיול כאחד. כדי להתחיל להרכיב את אופן המיקרוסקופיה הקרינה ברזולוציה גבוהה של המיקרו-אנדוסקופ הרב-מודאלי, הרכיב מראה דיכרואית של 470 ננומטר בקוביית כלוב של 30 מילימטר. חבר את מוטות הרכבת הכלוב לצד הקדמי, הימני והשמאלי של קוביית הכלוב.
חבר טבעת שמירה נטולת מתח ללוחית כלוב הברגה והברג צינור עדשה לתוך טבעת התומך. חבר לוחית כלוב נוספת לצינור העדשה המיושר עם לוחית הכלוב הראשונה. לאחר מכן, אבטח מראה אלומיניום משופרת UV בתושבת מראה בזווית ישרה.
חבר ארבעה מוטות לחזית תושבת המראה ושני מוטות באלכסון לצד ימין של התושבת. החלק את מכלול צינור העדשה לצד שמאל של קוביית הכלוב. חבר את הצד הימני של מכלול תושבת המראה למכלול צינור העדשה.
החלק תושבת תרגום ציר Z לצד ימין של המכלול. חבר עדשת אובייקט אכרומטית פי 10 לתושבת התרגום. לאחר מכן, אבטח לוחית מתאם סיבים לתושבת עדשת תרגום ציר XY.
החלק את התושבת על המכלול מול עדשת האובייקט. בעזרת טבעות תומכות, אבטח מסנן עירור מתאים ומסנן פליטה בצינורות העדשה. הברג את צינור עדשת מסנן העירור לקדמת קוביית הכלוב.
וצינור עדשת מסנן הפליטה לקדמת תושבת המראה בזווית הנכונה. בעזרת אפוקסי, חבר נורית LED של 455 ננומטר לצלחת הכלוב מול מסנן העירור. החלק לוחית כלוב לפני כל צינור עדשת מסנן.
בעזרת טבעת שמירה, אבטח עדשת צינור כפול אכרומטי לתוך צינור עדשה אחר כך שהחץ בחלק החיצוני של העדשה יפנה לצד המושחל חיצונית של צינור העדשה. חבר את עדשת הצינור ללוחית הכלוב השמאלית, הנח לוחית כלוב נוספת מול עדשת הצינור. בעזרת טבעת שמירה נטולת מתח, חבר מצלמת USB מונוכרום לצלחת הכלוב.
כדי להתחיל להרכיב את אופן ספקטרוסקופיית ההשתקפות התת-מפוזרת, חבר לוחית כלוב הברגה לחזית מקור אור הלוגן טונגסטן עם אפוקסי. הכנס ארבעה מוטות הרכבה של כלוב לתוך לוחית הכלוב והחלק תושבת תרגום ציר Z על המוטות. הברג עדשת אובייקט אכרומטית פי 20 לתוך תושבת התרגום של ציר Z.
חבר לוחית מתאם סיבים לתושבת תרגום ציר XY והחלק את התושבת על המכלול מול עדשת האובייקטיב. לבסוף, אבטח את שני המכלולים לשולחן אופטי קרוב זה לזה באמצעות התקני הרכבה מתאימים. כדי להתחיל בבניית מכשיר מיתוג הפרדת גלאי המקור, הברג לוחית מתאם סיבי SMA עם הברגה חיצונית לזרוע מנוע אלומיניום.
חבר מתאם זרוע מנוע לחלק האחורי של זרוע המנוע. לאחר מכן, הברג מנוע צעד לתוך בית מנוע אלומיניום. השחילו את מכלול זרוע המנוע על מוט המנוע והדק את בורג הנעילה.
לאחר מכן, הברג שלוש לוחות מתאם סיבים למתג אופטי ולאחר מכן הברג את לוחית הפנים על המתג האופטי. השחילו את מוט מנוע הצעד דרך החור המרכזי של המתג האופטי. הנח נהג מנוע צעד על פני הקו המרכזי של לוח אדום נטול סודה.
חבר את הנהג לאספקת חשמל מתאימה ולמנוע הצעד. אבטח את המתג האופטי לשולחן האופטי. חבר כבל תיקון של 550 מיקרומטר 0.22 na לזרוע המנוע.
חבר את הקצה השני לספקטרומטר USB. כדי לחבר את בדיקת הסיבים האופטיים, חבר את כבל סיב התמונה המרכזי של 1 מילימטר למכלול המיקרוסקופיה הקרינה ברזולוציה גבוהה. חבר את הכבל הרב-מצבי השמאלי של 200 מיקרומטר למכלול אופן הספקטרוסקופיה של ההשתקפות התת-מפוזרת.
המשך משמאל, חבר את הכבלים הרב-מצביים הנותרים על מנת למתאמים השמאליים, האמצעיים והימניים של מכשיר המיתוג האופטי. כדי להתחיל בכיול לניסוי, חבר את כל ציוד היקפי ה-USB למחשב. הפעל את כל המכשור וודא שהלוגן טונגסטן lamp תריס פתוח.
לאחר מכן, כבו את אורות החדר וסגרו מקורות אחרים של אור סביבתי. פתח את תוכנת רכישת הנתונים. אפשר לציוד לפעול במשך 30 דקות לפני שתמשיך לכיול.
הנח תקן השתקפות מפוזר של 20% בחלק התחתון של מכשיר הכיול. הכנס את בדיקת הסיב האופטי לחריץ השמאלי של המכשיר והגדר את המתג האופטי הממונע שמאלה כדי לבחור את ה-374 מיקרומטר כהגדרת DS. בתוכנה, הגדר את זמן האינטגרציה ל-500 אלפיות השנייה.
לאחר מכן, לחץ על רכוש ספקטרום כדי להתחיל ברכישה של RMAX עבור SDS זה. בסיום רכישת RMAX, שמור את הספקטרום בתיקיה ייעודית. סגור את תריס מנורת הלוגן טונגסטן ורכוש את הספקטרום הכהה R עבור SDS זה.
פתח את התריס, הזז את הגשושית לחריץ הימני במכשיר הכיול והגדר את המתג האופטי הממונע למצב האמצעי עבור הגדרת SDS של 730 מיקרומטר. רכוש RMAX ו-RDARK עבור SDS זה כדי להשלים את הכיול. ראשית, קבע את אזור העור המתאים לאיסוף נתונים.
השתמשו בהיילייטר צהוב כמקור לפירנין, צבעו קלות את האזור הנבחר. כדי להתחיל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה, הפעל את נורית ה-LED של 455 ננומטר וסגור את התריס של מנורת הלוגן טונגסטן. הנח את בדיקת הסיבים האופטיים במגע עדין עם העור.
העבר את הגשושית על פני הרקמה המוכתמת בפירנין כדי להציג את ארכיטקטורת תובנת הזרם האפיקלי. בתוכנה הגדר זמן חשיפה ורווח מתאימים כדי למנוע רוויה בתמונה. לאחר מכן, לחץ על רכוש תמונה כדי לקבל תמונה סטטית.
שמור את הגשושית במקומה עבור ספקטרוסקופיית ההחזר התת-מפוזרת. כבה את נורית ה-LED של 455 ננומטר ופתח את הלוגן טונגסטן lamp תריס. לאחר מכן, עבור להגדרת SDS של 374 מיקרומטר משמאל.
לחץ על רכוש ספקטרום כדי לרכוש את ספקטרום רקמת ה-R עבור SDS זה. לאחר מכן, עבור למצב האמצעי ורכוש את ספקטרום רקמת SDS R של 730 מיקרומטר. פתח את תוכנת העיבוד ולחץ על הפעל.
כאשר תתבקש, בחר את ספקטרום הכיול, ספקטרום in vivo ותמונת הקרינה ברזולוציה גבוהה כדי לקבל את תמונת הרקמה. שיטת המיקרוסקופיה הקרינה ברזולוציה גבוהה מספקת תמונה ממוקדת ברזולוציה גבוהה של אתר הרקמה. צביעת פירנין מראה קווי מתאר של קרטינוציטים בודדים.
תוכנת העיבוד שלאחר העיבוד משתמשת בנתוני ספקטרוסקופיה של החזר תת-מפוזר כדי לחשב את ריכוז ההמוגלובין, ריכוז המלנין וריווי החמצן ברקמות. נבוס מלנוציטי שפיר הושווה לרקמת עור רגילה שכנה באמצעות מיקרו-אנדוסקופ רב-מודאלי זה. הנבוס המלנוציטי הראה ריכוז המוגלובין מעט נמוך יותר וריכוז מלנין מעט גבוה בהשוואה לרקמה רגילה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לתת למנורת הלוגן טונגסטן להתחמם למשך 15 דקות ולכייל את המכשור עם תקן החזר לפני איסוף הנתונים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיה רב-פוטונית כדי לחקור שינויים תת-תאיים במבנה החלבון או בחילוף החומרים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את הקשר בין זלוף רקמות ומיקרו-מבנה בתגובה לכימותרפיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבנות ולהשתמש במכשיר הדמיה אנדוסקופית מיקרו-אנדוסקופית היברידית וספקטרוסקופיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה של מיקרו-אנדוסקופיה רב-מודאלית מסיב אופטי, המשלבת דימוי פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה עם ספקטרוסקופיית החזרה מפוזרת (diffuse reflectance spectroscopy) לצורך ניתוח רקמות in vivo. הגישה המשולבת מאפשרת ויזואליזציה סימולטנית של המיקרו-ארכיטקטורה של הרקמה והערכה כמותית של פרמטרים פיזיולוגיים, כפי שמוצג כאן על עור אנושי. הפרוטוקול מפרט את בניית הגשושית, כיול ורכישת נתונים, ומספק כלי מקיף לאפיון תפקודי של רקמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסה ביו-רפואית
- דימות אופטי
- ספקטרוסקופיה
- ביולוגיה של הסרטן
רקע
- מיקרואנדוסקופיה מסורתית מבוססת צרור סיבים מאפשרת ניתוח רקמות לא פולשני in vivo באמצעות דימיון או ספקטרוסקופיה.
- מיקרואנדוסקופיה פלורסצנטית ברזולוציה גבוהה מאפשרת הדמיה של המבנה המיקרו-ארכיטקטוני של הרקמה ויכולה להבדיל בין רקמה נאופלסטית לרקמה שאינה נאופלסטית בזמן אמת.
- ספקטרוסקופיה של החזר דיפוזי (Diffuse reflectance spectroscopy) מכמתת פרמטרים פיזיולוגיים כגון המוגלובין, מלנין ורוויית חמצן.
- שילוב של שיטות אלו בגשש (probe) יחיד מספק הערכה מקיפה יותר של בריאות הרקמה.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של גשש אופטי היברידי המשלב דימוי פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה וספקטרוסקופיה של רפלקטנציה דיפוזית.
- מתן אפשרות לניתוח מבני ותפקודי במקביל (co-registered) של רקמה in vivo.
- מתן פרוטוקול לבנייה, כיול ושימוש בגשש הרב-מודאלי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של גשש סיב אופטי המשלב מודליות של מיקרו-אנדוסקופיה פלואורסצנטית וספקטרוסקופיה של החזר מפוזר.
- הרכבת רכיבים אופטיים הכוללים מראות דיכרואיות, עדשות אובייקטיביות, מסננים, נורות LED וספקטרומטרים.
- כיול באמצעות סטנדרטים של החזר מפוזר ורכישת נתונים מבוססת תוכנה.
- הדגמה in vivo על עור אנושי עם צביעת Pyranine לדימות פלואורסצנטי וניתוח ספקטרלי של פרמטרים פיזיולוגיים.
תוצאות עיקריות
- הגשוש רכש בהצלחה תמונות ברזולוציה גבוהה של קרטינוציטים בעור האפידרמלי וביצע רישום משותף (co-registration) של אלו עם נתונים ספקטרליים כמותיים.
- ריכוז המוגלובין, ריכוז מלנין ורוויית חמצן הופקו מאותו אתר רקמה.
- השוואה בין שומה מלנוציטית שפירה לבין עור נורמלי הראתה רמות המוגלובין נמוכות יותר ורמות מלנין גבוהות יותר בשומה.
- ניתן לבצע את הטכניקה בתוך פחות משעה לאחר רכישת המיומנות, והיא תואמת לפרוצדורות אנדוסקופיות.
מסקנות
- הגשוש הרב-מודאלי מאפשר ניתוח מבני ותפקודי מקיף של רקמות, עם רישום משותף (co-registered), באופן חי (in vivo).
- הוא ניתן להתאמה לשימוש ידני או אנדוסקופי במערכות איברים שונות.
- נדרש מחקר קליני נוסף כדי לתקף את יעילותו במצבי מחלה אפיתליאליים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
שילוב של דימוי פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה עם ספקטרוסקופיית רפלקטנסה דיפוזית בפלטפורמה אחת של מיקרו-אנדוסקופיה מבוססת צמור סיבים, מאפשר ניתוח רקמות לא פולשני in vivo עם תובנות מבניות ופיזיולוגיות כמותיות. גישה מולטי-מודאלית זו מגבירה את הביטחון החזוי באפיון רקמות, ובכך תומכת בגילוי מוקדם ובנקודות מפנה במחקרים טרנסלציונליים. התאימות של הפלטפורמה לזרימות עבודה אנדוסקופיות הופכת אותה ליכולת הניתנת לשימוש חוזר להערכה תפקודית של רקמות במערכות איברים מגוונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה תפקודית של מיקרו-מבנה הרקמה ושל הפרפוזיה in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות רישום משותף של נתונים מיקרו-ארכיטקטוניים ופיזיולוגיים.
- מסייע בביטחון חיזוי בהבחנה בין רקמה נאו-פלסטית לרקמה שאינה נאו-פלסטית.
- מספק בסיס למחקרים מכניסטיים של השפעות טיפוליות על ביולוגיה של הרקמה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מודלים מאוששים של רקמות להערכת תרכובות בהמשך, באמצעות שילוב של פלטי דימות וספקטרוסקופיה.
- מסטנדרט את רכישתם של פרמטרים פיזיולוגיים כמותיים, כגון ריכוזי hemoglobin ו-melanin.
- מאפשר איסוף נתונים הניתן לשחזור ומותאם לאתרים עבור פיתוח בדיקות ומוכנות לסריקה.
- תומך ביכולת הרחבה של הפלטפורמה לניתוח רב-איברי או רב-אתרי.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאימה דימות מיקרו-ארכיטקטוני לכמתית של סמנים ביולוגיים פיזיולוגיים עבור מודלים רלוונטיים למחלה.
- מאפשרת רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה בהערכה תפקודית של רקמות in vivo.
- מספקת נתונים מותאמי סיכון לצורך קבלת החלטות קידום במסלולי מחקר תרגומיים.
- מקל upon חקירת התגובה של רקמות להתערבויות טיפוליות במודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פלטפורמה רב-מודאלית זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי מולקולות מובילות ומחקר פרה-קליני, על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח מבני ותפקודי של רקמות בשיטת רישום משותף (co-registered) in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור נתיבים באמצעות כימות השפעות הטיפול על מיקרו-מבנה הרקמה והבישור (perfusion).
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות דימות וספקטרום משולבות להשוואה איתנה של מצבי רקמה.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם מחקרים מונחי-סמנים ביולוגיים (biomarkers) ותומך בתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה, התואמת לאנדוסקופיה, וניתנת להתאמה למערכות איברים רבות ולצרכי מחקר שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בניתוח רקמות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של אפיון רקמות in vivo.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי אספקת נתוני רקמה מקיפים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודף מותאם סיכון וקידום של תוכניות גילוי ותוכניות תרגומיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות אופטי, ספקטרוסקופיה וכיול גששים.
- מצריך גישה למכשור ייעודי ותשתית אנליטית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לרכישת נתונים ולניתוחם.
- ניתן להסתגל לסוגי רקמות ומערכות איברים שונות באמצעות כיול ותיקוף מתאימים.
- דיוק במיקום הגשש ובכיולו קריטיים לדיוק הנתונים ולהדירותם.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Construction of the Fluorescence Microscopy and Reflectance Spectroscopy Modalities
4:16
Construction of the Multimodal Microendoscope
5:53
Sub-diffuse Reflectance Spectroscopy Modality Calibration
7:23
In Vivo Data Acquisition from Human Skin
8:52
Results: Co-registered Tissue Structural and Physiological Parameter Data
9:38
Conclusion
