שיטה חדשנית עבור chemiluminescence יצירה וההתבוננות בסביבה ביולוגית

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציע טכניקת הדמיה פרה-קלינית, בין-ניתוחית, כימית חדשה שיכולה לספק יתרונות על פני טכניקות אופטיות קיימות במונחים של יחסי אות לרעש ומגבלות זיהוי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח שלא היו נגישות על ידי טכניקות הדמיה אופטיות מסורתיות בתחומים רבים הקשורים למדעי הביולוגיה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שיש לה יחס אות לרעש גבוה ושהיא אינה דורשת אור מיידי או קרינה.

אז מה שמצאנו הוא שההשלכות של הטכניקה הזו באמת משתרעות על הדמיה בין-ניתוחית של מצבי מחלה מרובים כולל סרטן בגלל יחסי האות לרעש הגבוהים שיש לטכניקה הזו להציע. מכיוון שאין צורך באור מקרי לטכניקה זו, אין בעיות עם ספיגת אור מקרית. יתר על כן, קיים ארגז כלים כימי גדול הזמין לתפקוד מולקולת הליבה הכימית.

כדי להתחיל בהליך הכינו תמיסות סטנדרטיות של 100 מיקרוליטר של טריס (bypiridine) רותניום (II) כלוריד במי אוסמוזה הפוכה. לאחר מכן, שלב כל תקן עם 100 מיקרוליטר של תמיסה של 25 מילי-מולרית של אמוניום צריום חנקתי במי אוסמוזה הפוכה על שקופית מיקרוסקופ. פתח את תוכנת ההדמיה של קורא ביולומינסנציה ולחץ על אתחול.

במצב הדמיה, ודא שהזוהר והתצלום נבדקים והפלואורסצנט אינו מסומן. הגדר את פרמטרי זמן החשיפה הזוהר, binning, f/stop ומסנן הפליטה. הגדר את זמן החשיפה לתצלום, פרמטרי binning ו-f/stop.

לאחר מכן הגדר את גובה הנושא בהתאם לדגימה שיש לצלם. הגדר את שדה הראייה ל-B עבור מרחק של 14 סנטימטר בין המצלמה לשלב הדגימה. כסו את רצפת תא ההדמיה של קורא הביולומינסנציה בשלב הדגימה בנייר בנייה שחור.

לאחר מכן הניחו את השקופית הראשונה עם טיפת התערובת הסטנדרטית על שלב הדגימה כשהטיפה מרוכזת בכוונת קופסת האור הירוקה. לאחר מכן, מלאו את בקבוק הריסוס של שלושה אונקיות של נבולייזר שנבנה בהתאמה אישית בתמיסה 1:3 של טריאתילאמין בתמיסה של 50/50 של מים ואתנול. ודא שאין בועות אוויר בצינור השאיפה.

הנח את מכלול הנבולייזר בתא ההדמיה כשפיית הריסוס מכוונת לכיוון הטיפה שיש לצלם מבלי לחסום את תצוגת המצלמה של הטיפה. ודא שמתג ההפעלה של הנבולייזר ומחוון ההפעלה דולקים, מתג ההחלפה המגנטי כבוי ומנבולייזר החשמל והכבלים המרוחקים אינם סבוכים. כסה נקודות חמות כגון סימנים על השקופית בחתיכות קטנות של נייר בנייה שחור.

הנח לפחות 40 סנטימטרים מהכבל המרוחק של הנבולייזר בתא ההדמיה. סגור בעדינות את דלת החדר מבלי לכווץ את חוטי הנבולייזר. בתוכנת המכשיר, לחץ על רכישה, הפעל שמירה אוטומטית והגדר את נתיב קובץ הנתונים.

התחל את רצף ההדמיה. כאשר התריס נפתח בלחיצה נשמעת, החלף את מתג הנבולייזר שלוש פעמים כדי לרסס שלושה התפרצויות של תמיסת טריאתילאמין על הדגימה. חזור על ההליך עם כל שקופית סטנדרטית כדי לקבוע את הריכוז המינימלי הניתן לזיהוי של חומר ההדמיה רותניום.

כדי להתחיל בהליך ההדמיה in vivo, הכינו 100 מיקרוליטר של תמיסה המכילה בין 8 ל-33 ננומול של טריס (bypiridine) רותניום (II) כלוריד בתמיסת מלח חוצצת פוספט. הכינו תמיסה מימית של 25 מילי-מולרית של אמוניום סריום חנקתי. לאחר מכן, יש להזריק לווריד 100 מיקרוליטר של חומר הדמיית רותניום לווריד הזנב של עכברים בריאים.

הקריבו את העכברים 10 דקות לאחר ההזרקה על ידי חנק פחמן דו חמצני. הסר את העור מהגו עם חתך Y ולאחר מכן הסר את קשת החוף כדי לחשוף את הלב והריאות. חותכים שקע באטריום הימני ומזריקים 20 מיליליטר PBS דרך מחט בגודל 24 לחדר השמאלי.

חותכים את עור הבטן כדי לחשוף את הכליה והכבד. אם האיבר המעניין הוא הכבד, הכליה או הטחול יוצרים חתך אורכי גלוי דרך האיבר. הכן רצף הדמיה חדש בתוכנת קורא האור הביולוגי

להדמיית בטן שלמה, הנח את העכבר בתא ההדמיה כשהבטן הפתוחה פונה למצלמה והראש פונה לכיוון החלק האחורי של המכשיר. מרכז את איבר העניין בכוונת תיבת האור הירוקה. שטפו היטב את בקבוק הריסוס והזרבובית ממכלול הנבולייזר ולאחר מכן מלאו את הבקבוק בתמיסת אמוניום סריום חנקתי.

הנח את הנבולייזר בתא ההדמיה כאשר פיית הריסוס מכוונת לאתר ההדמיה. ודא שהמצלמה אינה חסומה, הכבלים אינם סבוכים ולפחות 40 סנטימטרים מהכבל המרוחק נמצאים בתא. סגור את החדר והתחל את רצף ההדמיה.

כאשר התריס נפתח בלחיצה, החלף את המתג שלוש פעמים כדי לרסס שלוש התפרצויות של החומר המחמצן על אתר ההדמיה. לאחר ההדמיה, הסר את מכלול הנבולייזר ושטוף היטב את פיית הריסוס כדי למנוע התגבשות של אמוניום סריום חנקתי. להדמיה וכימות של איברים בודדים לאחר מכן, הסר את העכבר מהמכשיר והוצא את האיברים הפנימיים החל מחלל הגוף הפתוח.

חותכים את עור הרגל האחורית כדי לכרות דגימות רקמת שריר. אם האיבר המעניין הוא הכבד, הכליה או הטחול חותכים את האיבר לשניים לאורך. לאחר מכן הניחו את העוגב על צלחת פטרי או פיסת נייר בנייה שחורה.

דמיינו כל איבר באותו אופן כמו החיה כולה, ושטפו את פיית הריסוס לאחר כל רצף. בהליך זה הוזרקו לעכברים חומר הדמיה מבוסס רותניום והרקמה המעניינת רוססה במחמצן כדי לגרום לכימילומינסנציה. הריכוז המינימלי הניתן לזיהוי של חומר ההדמיה נקבע כ-6.9 פיקומולים לסנטימטר בריבוע בתנאים אלה.

כימילומינסנציה בתמונות אור לבן של איברי העניין התקבלו עם קורא ביולומינסנציה. אות הכימילומינסנציה נצפה בעיקר בכליות לאחר הזרקה תוך ורידית המצביעה על חיסול כלייתי של קטיון טריס (bypiridine) רותניום (II). יחס האות לרעש של חומר ההדמיה לעומת PBS בלבד היה 27:1 בכליות ו-21:1 בכבד.

בלוטות לימפה פופליטאליות של עכבר הוערכו גם באמצעות הזרקה תת עורית של תמיסה מרוכזת יותר של חומר הדמיה מבוסס רותניום. בלוטות הלימפה המכילות את חומר ההדמיה הראו קרינה גדולה משמעותית מבלוטות הלימפה המכילות PBS בלבד. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לכלול אור סביבתי ולהימנע מזיהום ברותניום טריס bpy. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום ההדמיה הביו-מולקולרית לחקור מצבי מחלה כמו סרטן בעכברים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שאלות שלא היו נגישות בטכניקות הדמיה אופטיות מסורתיות, ניתן לטפל בכל שאלה שניתן לחקור בטכניקות מסורתיות באמצעות כימילומינסנציה.