LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה
December 30th, 2016
חומרים מבוקרים אופטית הם כלים רבי עוצמה לחקר מסלולי איתות. כדי להרחיב את ספקטרום הניסויים האפשריים, פיתחנו מכשיר לחקר חומרים מבוקרים אופטית בזמן אמת באמצעות ציטומטריית זרימה: LED Thermo Flow.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לעורר חומרים מבוקרים אופטית במהלך מדידות ציטומטריות זרימה. מכשיר חדשני זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות התאים על ידי שילוב כוחם של חומרים מבוקרים אופטית עם ציטומטריית זרימה. לראשונה ניתן לאפיין ולנתח כלים אופטוגנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה.
עד היום לא הייתה קיימת שיטה מבוססת דומה. כדי להתחיל, השעו לימפוציטים של ראמוס B בריכוז של מיליון תאים למיליליטר והעבירו אותם לצינור FACS מזכוכית. לאחר מכן, החלף את טבעת ה- O השחורה של ציטומטר הזרימה בטבעת O מגומי ומרח שומן סיליקון כדי ליצור אטימה טובה יותר.
הכנס את צינור הזכוכית לתוך ציטומטר זרימה והנח את אב הטיפוס LED סביב הצינור כשהאורות כבויים. מדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa בערוץ GFP. השלב הקריטי ביותר בהליך הוא הטיפול בצינורות הזכוכית.
צינורות FACS מזכוכית הם שבירים מאוד ולכן מומלץ לתרגל את החדרת צינורות הזכוכית לתוך הציטומטר לפני ביצוע ניסויים. לאחר מכן, הדליקו את נורת ה-LED של 500 ננומטר בחלק החיצוני של הצינור, והמשיכו למדוד את עוצמת הקפלורסנציה של Dronpa. הגדילו את עוצמת נורות ה-LED עד לעוצמת הקרינה של Dronpa יורדת, על מנת להעריך את עוצמת האור המינימלית הדרושה, על מנת למדוד את הפוטו-מיתוג של חלבון Dronpa-Linker-Dronpa.
לאחר מכן, הפעל את נורת ה-LED של 400 ננומטר של אב הטיפוס בחלק החיצוני של הצינור, והמשך למדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa. הגדל את עוצמת האור של נורות ה-LED של 400 ננומטר עד שעוצמת הקרינה של Dronpa עולה. התחל בביצוע הוראות התכנון והייצור בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי לייצר את השכבות הפנימיות והחיצוניות של התקן ה-LED למיתוג תמונות.
הכנס את נוריות ה-LED באורך גל של 400 ו-500 ננומטר לערוצי המכשיר. הדביקו אותם למקומם וחוטו אותם לפי ההוראות. אורכי גל ספציפיים אלה ישמשו להחלפת חלבוני ההיתוך Dronpa-Linker-Dronpa בין מצבם הכהה לבהיר.
לאחר מכן, הרכיבו את המכשיר וודאו שהוא אטום למים על מנת למנוע דליפה לפני הפעלת השנאי. לאחר הרכבת המכשיר, קצרו לימפוציטים של Ramos B והשעו אותם בצפיפות של שלושה עד עשרה מיליון תאים למיליליטר. מעבירים 600 מיקרוליטר מהתאים לצינור FACS מזכוכית.
הניחו אותם על קרח והגנו על התאים מפני אור עד שהם נמדדים. חבר את המכשיר המורכב למשאבת מים מחוממת והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכנס בזהירות את צינור ה-FACS מזכוכית למכשיר וחבר אותו לציטומטר הזרימה.
רשום את עוצמת הפלואורסצנט של Dronpa בערוץ GFP. התכנון של מכשירים אופטוגנטיים אלה כולל תא שניתן לחבר לאספקת מים במחזור כדי לשמור על טמפרטורת הדגימה בערך קבוע. בעוד שהמכשיר פלט שלושה אורכי גל שונים, רק עליית טמפרטורה שולית נצפתה בדגימת ה-FACS, כאשר הזרימו מים ב-37 מעלות צלזיוס דרך המכשיר.
מבנה ההיתוך Dronpa-Linker-Dronpa שובט והועבר לתאי Ramos B. כאשר מכוונים למצב מונומר על ידי מקור אור של 500 ננומטר, עוצמת הפליטה פוחתת. לאחר מכן, ברגע שמקור האור מועבר לאור של 400 ננומטר, מונומר ה-Dronpa משתנה במהירות למצב דימר, והעוצמה עולה במהירות.
באמצעות מכשיר זה, ניתן היה להחליף את חלבון ההיתוך הציטוזולי Dronpa-Linker-Dronpa מספר פעמים. המעבר למצב הכהה מתרחש לאט, ואילו המעבר למצב הבהיר מתרחש כמעט באופן מיידי. התאוששות הקרינה הספונטנית של Dronpa בחושך מראה כי מיתוג פוטו יעיל לצורה הבהירה דורש תאורה ספציפית ומתרחש רק לאט באופן ספונטני.
הניתוח הקינטי מראה שמהירות הפוטו-מיתוג ניתנת לשחזור בסך הכל וכי גם לאחר דגירה ארוכה בחושך, רק כעשרה אחוזים מהפלואורסצנטיות משוחזרים ללא פוטו-סוויץ'. לאחר הליך זה, ניתן לבצע כל ניתוח זרימה ציטומטרי, כולל מדידות שטף סידן, על מנת לחקור את הפונקציונליות של הכלי האופטוגנטי שבחרת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האופטוגנטיקה לחקור את החיווט של מסלולי איתות תאים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פרוטוקול החלפת תמונות עבור הכלי האופטוגנטי הספציפי שלך. אל תשכח שאור UV יכול להיות מסוכן ביותר ותמיד יש להרכיב אמצעי זהירות, כגון משקפי מגן, בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג מכשיר חדשני שנועד לחקר חומרים הנשלטים אופטית בזמן אמת באמצעות ציטומטריית זרימה. על ידי שילוב כלים אופטוגנטיים עם מדידות ציטומטריות זרימה, חוקרים יכולים לחקור שאלות מרכזיות בתחום העברת האותות בתאים.
רכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- עברת אותות בתאים
- אופטוגנטיקה
- ציטומטריית זרימה
רקע
- חומרים הנשלטים אופטית הם בעלי ערך לחקר מסלולי העברת האותות.
- ציטומטריית זרימה מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים.
- שיטות קודמות לא שילבו את שתי הטכניקות החזקות הללו.
- מחקר זה מציג מכשיר שמאפשר אינטגרציה זו.
מטרת המחקר
- כדי לעורר חומרים הנשלטים אופטית במהלך מדידות ציטומטריות זרימה.
- כדי לאפיין ולנתח כלים אופטוגנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה.
- כדי לספק שיטה חדשה לחקר עברת האותות בתאים.
שיטות ששימשו
- תאי לימפוציטים B Ramos מהונדסים מושעים בריכוז של מיליון תאים למליליטר.
- העברת תאים לצינור FACS מזכוכית.
- החלפת טבעת ה-O השחורה של הציטומטר בטבעת O מגומי.
- מריחת שמן סיליקון כדי להבטיח איטום טוב יותר.
תוצאות עיקריות
- המכשיר משולב בהצלחה עם גירוי אופטוגנטי באמצעות ציטומטריית זרימה.
- מאפשר ניתוח בזמן אמת של מסלולי עברת האותות בתאים.
- מאפשר אפיון של כלים אופטוגנטיים בפעם הראשונה.
- מתקן פער בשיטות הקיימות לחקר עברת האותות בתאים.
מסקנות
- מכשיר חדשני זה מייצג התקדמות משמעותית בחקר עברת האותות בתאים.
- הוא פותח דרכים חדשות למחקר באמצעות חומרים הנשלטים אופטית.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו לחקר מסלולי עברת אותות מורכבים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Integrating optogenetic control with flow cytometry enables real-time, single-cell resolution analysis of signaling dynamics, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing quantitative, reproducible assessment of photoswitching kinetics in live cells, supporting early discovery decisions. The low-cost, adaptable design facilitates enterprise reuse across optogenetic tool development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time photoswitching of optogenetic tools in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts to clarify pathway dynamics and reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by characterizing optogenetic tool performance under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible optogenetic control.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise light intensity, wavelength, and temperature control during flow cytometric measurements.
- Scalability: Supports high-throughput analysis of thousands of cells per second, facilitating screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase optogenetic characterization to preclinical validation by enabling functional assessment in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows exploration of optogenetic tool functionality in complex signaling pathways, reducing late-stage biological risk.
- Predictive Confidence: Generates quantitative kinetic data to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and assay readiness for optogenetic tool evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time manipulation and measurement of optically controlled substances in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible photoswitching measurements at single-cell resolution.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence intensity readouts and kinetic analysis to compare conditions and assess tool performance.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing optogenetic tools in a flow-compatible, physiologically relevant format.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, low-cost platform adaptable to diverse optogenetic tools and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in optogenetic tool function, reduction of mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of photoswitching measurements across cell populations.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in tool development, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of optogenetic candidates based on quantitative kinetic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, flow cytometry, and basic device assembly.
- Needs access to a flow cytometer, LED light sources, and temperature control via water pump.
- Demands cross-team standardization for consistent light delivery, temperature control, and sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, optogenetic tools, and wavelength requirements.
- Includes practical limitations such as glass tube fragility and UV light hazards requiring protective measures.
