Name: LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: למד שילוב אופטוגנטיקה עם ציטומטריית זרימה לניתוח תאים Ramos B בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי תקשורת תאית עם בקרה אופטית מדויקת וניתוח אופטוגנטי חדשני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'יי שמידט מאוניברסיטת פרייבורג על בניית המכשיר. אנו מודים ל-P. Nielsen ו-D. Medgyesi על תמיכתם וקריאתם הביקורתית של כתב היד הזה. מחקר זה נתמך על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft באמצעות SFB746 ועל ידי יוזמת המצוינות של קרן המחקר הגרמנית (GSC-4, Spemann Graduate School).

תכנון 1. בונה את ההתקנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויי פיילוט הערה: עוצמת האור הנדרשת עבור סוג כלי תאים ספציפי optogenetic עשויה להשתנות באופן משמעותי. ניסויי פיילוט עם טיפוס שימושיים להעריך את עוצמת האור המינימאלית הכרחית. כלי optogenetic המשמש בניסויים הבאים הוא היתוך לבנות Dronpa-לינקר-Dronpa. רצף Dronpa הושג מסחרי (ראה רשימת חומרים). מקשר ארוך שובט בין שני רצפים Dronpa לאפשר לבנות הביע לגבש intramolecular (ו מולקולאריים) הדימרים. השלבים המתוארים להלן ניתן להתאים כלים רבים optogenetic אחרים או חומרים מפוקחים אופטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce לימפוציטים ראמוס B עם מבנה המכיל Dronpa-לינקר-Dronpa בעקבות הוראות היצרן עבור התמרה באמצעות supernatant retroviral המכילים מתאי אריזות. קציר ותאי לספור על פי מראשviously שפורסם פרוטוקול 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בריכוז של 1 x 10 6 / מ&quot;ל במדיום (RPMI 1640, 10% חום מומת FCS, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 פניצילין U / mL, 100 סטרפטומיצין U / mL, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol) ולהעבירם שפופרת זכוכית FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצינור לתוך cytometer זרימה ולמדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa (ערוץ GFP) 14,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להרכיב משקפיים מגן לכל צעדים נוספים כדי להגן על העיניים מפני אורכי גל ופעולה זו עלולה לפגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני למקם אור LED 500 ננומטר על החלק החיצוני של הצינור ולהמשיך מדידת עוצמת הקרינה של Dronpa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להעלות את מספר ו / או עוצמת נורות LED עד עוצמת הקרינה Dronpa פוחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני למקם אור LED 400 ננומטר על החלק החיצוני של הצינור ולהמשיך מדידת עוצמת הקרינה של Dronpa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להעלות את מספר ו / או עוצמת נורות LED עד fluo Dronparescence עליות בעצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לפחות כמו רבים נורות LED לבניית המכשיר כפי שחזה להיות הכרחי מן photoswitching בצעדים 1.1.5 ו 1.1.7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונה את המכשיר הערה: המכשיר נבנה על ידי חנות עיבוד מקצועי, Technik Arbeitsgruppe מאוניברסיטת פרייבורג. רוב החלקים עשויים מותאם אישית ולא זמין מסחרית. את המידות המדויקות של כל חלק מתוארים איורים 1 ו -2. כדי להבהיר את ההרכבה של המכשיר הזה, משלים וידאו 1 מסופק ואת הצעדים החיוניים ביותר מתוארים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכת מיל מ פוליוויניל כלוריד (PVC) עם המידות המדויקות מוצגות באיור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס נורות LED לתוך חורים שנקדחו של פיסת A ו- לאטום כל חור עם דבק PVC כדי למנוע דליפת מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר נוריות שנאי רב (כל אורך גל צריך לתפוס מקום chann נפרדאל) עם כוח תפוקה מתכווננת מ 0-29 mA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף המעטפת החיצונית (B) עם 3 ברגים ליצירה כמשוואה מתואר להגן על נוריות מפני נזק פיזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי שניתן יהיה לחבר את המכשיר משאבת מים, דבק וידאו קליפים צינור (C) לתוך חורים שנקדחו של פיסת A (מתואר באיור 1 א, חתך Y: 9 מ&quot;מ ו 61.5 מ&quot;מ) באמצעות דבק PVC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי צינור פרספקס 58.5 מ&quot;מ אורך (D1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור חלקים D2 ו- D3 פרספקס כמתואר באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכת דבק D3 לתחתית D1 עם דבק פרספקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף O-Ring גומי חתיכת D2 ודבק אותה לחלק העליון של D1 עם דבק פרספקס. הערה: חתיכות D1, D2 ו- D3 יחדיו פיסת ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס חתיכת D לתוך חתיכת A עם 3 ברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת ההתקן עבור דליפת מים לפני החלת כוח השנאי. </li></ol></li></ol> 2. מדידת קינטיקה של כלי optogenetic <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים ראמוס B ב RPMI-בינוני (RPMI 1640, 10% חום מומת FCS, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 פניצילין U / mL, 100 סטרפטומיצין U / mL, ו -50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol) בצפיפות של 3 10 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ראמוס B התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 350 ו -4 C ° למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות תא ספירה נויבאואר בעקבות הוראות היצרן ו resuspend 1-5 x 10 6 תאים 600 בינוני μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התאים לצינור FACS זכוכית, לשים אותם על הקרח ולהגן עליהם מפני האור עד המדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את cytometer הזרימה ואת המכשיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התקן משאבת מים מחוממת ולהתאים את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש צינורות זכוכית FACS, להחליף את האטם השחור של זרימת cytometer עם גומי O-Ring ובנוסף להחיל סיליקון גרקַלוּת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את שפופרת זכוכית FACS לתוך המכשיר ולחבר אותו cytometer את הזרימה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחילו את המדידה ולהקליט Dronpa עוצמת פלורסנט (ערוץ GFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר את המדגם התא עם 400 ננומטר או 500 ננומטר אור בהתאמה ולהקליט את עוצמת הקרינה Dronpa (ערוץ GFP). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתוני ניסוי עם זרימת מתאים cytometer תוכנה. העלילה פיזור קדימה נגד פיזור הצידה ואת השער התאים החיים. מגרש את עוצמת הקרינה Dronpa לאורך זמן. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+protein+clustering+and+signaling+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells.</a> Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

The Flow LED Thermo הוא מכשיר חדשני ללמוד כלי optogenetic בתוך cytometer זרימה. עד כה, דגימות optogenetic כבר מואר רק עם לייזרים מיקרוסקופיה או מכשירים פנס 11,12. בהתאם לזווית והמרחק של הפנס המדגם, לשונות נכרתו את כמות התאורה צפויה בין ניסויים. יתר על כן, קיימת הגבלה על המספר של פנסי אדם אחד יכול לפעול ניסוי. זה מגביל את רפרטואר שחזור ניסיוני. מגבלות אלה טופלו במהלך הפיתוח של המכשיר שלנו, אשר ניתן להשת...

כלים optogenetic כבר צובר פופולריות, בין השאר משום שהם יכולים לשמש כדי לפענח את החיווט של מסלולי איתות 1-4. הם מבוססים על היכולת של חלבונים photoactivatable לשנות זיקה קונפורמציה ומחייבת שלהם, כאשר מואר באור. פיוזינג חלבונים אלה לאלמנטי איתות מאפשר להסדרה הספציפית של שחקן יחיד בתוך מסלולי איתות תאיים מורכבים 5-12. כתוצאה מכך, מסלול איתות ניתן ללמוד עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה. רוב המחקרים optogenetic מבוססי תאים לנצל שיטות מיקרוסקופיה מבוססת בשילוב עם culturing בנוכחות אור, ואחריו ניתוח ביוכימיים 11,12. לעומת זאת, cytometer זרימת singularizes תאים לאורך נימים ומודד גודל תא, גרעיניות ו עוצמות קרינה. לשיטה זו יתרונות גדולים על פני שיטות מיקרוסקופיה או ביוכימיות, כולל היכולת לנתח thousands של תאים חיים ברזולוצית תא בודד בתוך זמן קצר מאוד. לפיכך, רצוי לשלב optogenetics עם cytometry הזרימה. למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול הוקם עבור cytometry זרימת optogenetic. הליך מקובל רחב הוא להאיר תאים ידניים מחוץ צינור התגובה עם התקני פנס. עם זאת, תאורה ידנית את זרימת cytometer מחייבת לאור לעבור דרך צינור התגובה, הדמית תא חייה, גלילית, תא מים מחומם. זה גורם פיזור אור משמעותי ואובדן האור. יתר על כן, את עוצמת האור שמספקת תאורת מדריך אינה לשחזור בין ניסויים (זווית, מרחק וכו &#39;) ויש מגבלה מעשית על מספר אורכי גל בניסוי אחד. על ידי בניית מכשיר זרימת LED Thermo, הצלחנו להתגבר על המגבלות האלה. בעזרת התקן זה, אפשר להאיר תאים עם אורכי גל ספציפיים עובד זמניerature שבשליטת בצורה במהלך המדידות תזרים cytometric. זה מאפשר כמויות מדויקות לשחזור של אור בתוך ובין ניסויים. כדי להדגים את התועלת של המכשיר שלנו in vivo, הקלטנו את אותות הקרינה של Dronpa בתאים ראמוס B במהלך photoswitching. תאי ראמוס B נגזרים לימפומה אדם Burkitt. Dronpa הוא חלבון פלואורסצנטי שקיים בתור מונומר, דימר או tetramer. בצורתו monomeric שלה, היא פלורסנט שאינן. תאורה עם 400 ננומטר אור גורם dimerization ו tetramerization והופך את חלבון פלואורסצנטי Dronpa. תהליך זה יכול להיות הפוך על ידי תאורה עם 500 ננומטר אור. חלבון Dronpa נעשה שימוש כדי לשלוט בפונקציית ומיקום של איתות חלבונים 4,13. כאן, הביע לנו חלבון Dronpa-לינקר-Dronpa בתאי B ראמוס ללמוד photoswitching של Dronpa ב cytometer זרימה. השימוש במכשיר שלנו, הצלחנו ביעילותreproducibly photoswitch Dronpa בעת ההקלטה עוצמת הקרינה שלה בזמן אמת. שיטה זו מספקת יתרונות משמעותיים על פני פרוטוקולי תאורה נוכחיים עם תאורה ידנית באופן משמעותי מרחיבה את רפרטואר ניסיוני כלי optogenetic ותרכובות כלוב. השימוש במכשיר שלנו תפשט בצורה משמעותית להאיץ גילוי ופיתוח של כלים optogenetic הרומן.

<table><tbody><tr><td>צינור FACS מזכוכית</td><td>Thermo Fisher Scientific; וולת'אם, ארה"ב</td><td>14-961-26</td><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט 12x75 מ"מ</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Bioscienceg; היידלברג, גרמניה</td><td>Fortessa II</td><td>הזמנה מיוחדת</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N</td><td>Addgene; קיימברידג', ארה"ב</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, רוקוויל, ארה"ב</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 ננומטר</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, גרמניה</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 ננומטר</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, גרמניה</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>צינור פרספקס 15 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>פרספקס 3 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>פרספקס 2.5 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>פרספקס 1.5 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>אריחי PVC 5 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>אריחי PVC 6 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>בלוק PVC 50 מ"מ</td><td>מארטין; פרייבורג, גרמניה</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; דרמשטדט, גרמניה</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>EMD; גרמניה</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech; איידנבך, גרמניה</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; דרמשטדט, גרמניה</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>דבק פרספקס Acrifix</td><td>Evonic Industries, אסן, גרמניה</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>דבק Tangit PVC-U</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, גרמניה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

led thermo flow - שילוב optogenetics עם cytometry זרימה

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

כלים אופטוגנטיים מאפשרים חקירות מבודדות ופונקציונליות של כמעט כל מולקולת איתות במסלולי איתות מורכבים. מכשול מרכזי הוא אספקה מבוקרת של אור לדגימת התא ומכאן שהכלים הפופולריים ביותר למחקרים אופטוגנטיים הם ניתוחי תאים מבוססי מיקרוסקופיה וניסויים במבחנה. לציטומטר הזרימה יתרונות גדולים על פני מיקרוסקופ, כולל היכולת למדוד במהירות אלפי תאים ברזולוציית תא בודד. עם זאת, הוא עדיין לא נמצא בשימוש נרחב באופטוגנטיקה. כאן, אנו מציגים מכשיר המשלב את הכוח של אופטוגנטיקה וציטומטריית זרימה: LED Thermo Flow. מכשיר זה מאיר תאים באורכי גל ספציפיים, עוצמות אור וטמפרטורות במהלך מדידות ציטומטריות זרימה. ניתן לבנות אותו בעלות נמוכה ולהשתמש בו עם ציטומטרי הזרימה הנפוצים ביותר. כדי להדגים את התועלת שלו, אפיינו את קינטיקה של החלפת תמונות של חלבוני Dronpa in vivo ובזמן אמת. ניתן להתאים פרוטוקול זה כמעט לכל החומרים המבוקרים אופטית ומרחיב באופן משמעותי את מערך הניסויים האפשריים. חשוב מכך, זה יפשט מאוד את הגילוי והפיתוח של כלים אופטוגנטיים חדשים.

באמצעות תזרים LED Thermo עם Cytometer זרימה הליבה התפקודית של המכשיר היא תא גלילי שבו נורה LED מסודרים באופן מעגלי מצביע פנימה. תא זה יכול להיות מחובר לאספקת מים משאבה, המאפשרת שליטה על הטמפרטורה של נוריות, כמו גם מדגם התא. הנוריות מחוברות שנאי ומכאן עוצמת האור עבור כל אורך גל ניתן לשלוט בנפרד. המרכז של המכשיר יכול להכיל צינור FACS בגודל סטנדרטי, אשר...

חומרים מבוקרים אופטית הם כלים רבי עוצמה לחקר מסלולי איתות. כדי להרחיב את ספקטרום הניסויים האפשריים, פיתחנו מכשיר לחקר חומרים מבוקרים אופטית בזמן אמת באמצעות ציטומטריית זרימה: LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לעורר חומרים מבוקרים אופטית במהלך מדידות ציטומטריות זרימה. מכשיר חדשני זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות התאים על ידי שילוב כוחם של חומרים מבוקרים אופטית עם ציטומטריית זרימה. לראשונה ניתן לאפיין ולנתח כלים אופטוגנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה.עד היום לא הייתה קיימת שיטה מבוססת דומה. כדי להתחיל, השעו לימפוציטים של ראמוס B בריכוז של מיליון תאים למיליליטר והעבירו אותם לצינור FACS מזכוכית. לאחר מכן, החלף את טבעת ה- O השחורה של ציטומטר הזרימה בטבעת O מגומי ומרח שומן סיליקון כדי ליצור אטימה טובה יותר.הכנס את צינור הזכוכית לתוך ציטומטר זרימה והנח את אב הטיפוס LED סביב הצינור כשהאורות כבויים. מדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa בערוץ GFP. השלב הקריטי ביותר בהליך הוא הטיפול בצינורות הזכוכית.צינורות FACS מזכוכית הם שבירים מאוד ולכן מומלץ לתרגל את החדרת צינורות הזכוכית לתוך הציטומטר לפני ביצוע ניסויים. לאחר מכן, הדליקו את נורת ה-LED של 500 ננומטר בחלק החיצוני של הצינור, והמשיכו למדוד את עוצמת הקפלורסנציה של Dronpa. הגדילו את עוצמת נורות ה-LED עד לעוצמת הקרינה של Dronpa יורדת, על מנת להעריך את עוצמת האור המינימלית הדרושה, על מנת למדוד את הפוטו-מיתוג של חלבון Dronpa-Linker-Dronpa.לאחר מכן, הפעל את נורת ה-LED של 400 ננומטר של אב הטיפוס בחלק החיצוני של הצינור, והמשך למדוד את עוצמת הקרינה של Dronpa. הגדל את עוצמת האור של נורות ה-LED של 400 ננומטר עד שעוצמת הקרינה של Dronpa עולה. התחל בביצוע הוראות התכנון והייצור בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי לייצר את השכבות הפנימיות והחיצוניות של התקן ה-LED למיתוג תמונות.הכנס את נוריות ה-LED באורך גל של 400 ו-500 ננומטר לערוצי המכשיר. הדביקו אותם למקומם וחוטו אותם לפי ההוראות. אורכי גל ספציפיים אלה ישמשו להחלפת חלבוני ההיתוך Dronpa-Linker-Dronpa בין מצבם הכהה לבהיר.לאחר מכן, הרכיבו את המכשיר וודאו שהוא אטום למים על מנת למנוע דליפה לפני הפעלת השנאי. לאחר הרכבת המכשיר, קצרו לימפוציטים של Ramos B והשעו אותם בצפיפות של שלושה עד עשרה מיליון תאים למיליליטר. מעבירים 600 מיקרוליטר מהתאים לצינור FACS מזכוכית.הניחו אותם על קרח והגנו על התאים מפני אור עד שהם נמדדים. חבר את המכשיר המורכב למשאבת מים מחוממת והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכנס בזהירות את צינור ה-FACS מזכוכית למכשיר וחבר אותו לציטומטר הזרימה.רשום את עוצמת הפלואורסצנט של Dronpa בערוץ GFP. התכנון של מכשירים אופטוגנטיים אלה כולל תא שניתן לחבר לאספקת מים במחזור כדי לשמור על טמפרטורת הדגימה בערך קבוע. בעוד שהמכשיר פלט שלושה אורכי גל שונים, רק עליית טמפרטורה שולית נצפתה בדגימת ה-FACS, כאשר הזרימו מים ב-37 מעלות צלזיוס דרך המכשיר.מבנה ההיתוך Dronpa-Linker-Dronpa שובט והועבר לתאי Ramos B. כאשר מכוונים למצב מונומר על ידי מקור אור של 500 ננומטר, עוצמת הפליטה פוחתת. לאחר מכן, ברגע שמקור האור מועבר לאור של 400 ננומטר, מונומר ה-Dronpa משתנה במהירות למצב דימר, והעוצמה עולה במהירות.באמצעות מכשיר זה, ניתן היה להחליף את חלבון ההיתוך הציטוזולי Dronpa-Linker-Dronpa מספר פעמים. המעבר למצב הכהה מתרחש לאט, ואילו המעבר למצב הבהיר מתרחש כמעט באופן מיידי. התאוששות הקרינה הספונטנית של Dronpa בחושך מראה כי מיתוג פוטו יעיל לצורה הבהירה דורש תאורה ספציפית ומתרחש רק לאט באופן ספונטני.הניתוח הקינטי מראה שמהירות הפוטו-מיתוג ניתנת לשחזור בסך הכל וכי גם לאחר דגירה ארוכה בחושך, רק כעשרה אחוזים מהפלואורסצנטיות משוחזרים ללא פוטו-סוויץ'. לאחר הליך זה, ניתן לבצע כל ניתוח זרימה ציטומטרי, כולל מדידות שטף סידן, על מנת לחקור את הפונקציונליות של הכלי האופטוגנטי שבחרת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האופטוגנטיקה לחקור את החיווט של מסלולי איתות תאים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פרוטוקול החלפת תמונות עבור הכלי האופטוגנטי הספציפי שלך. אל תשכח שאור UV יכול להיות מסוכן ביותר ותמיד יש להרכיב אמצעי זהירות, כגון משקפי מגן, בעת ביצוע הליך זה.

led-thermo-flow-combining-optogenetics-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקת ציטומטריית זרימה לכימות רמות ROS באורגנואידים תלת-ממדיים במעי המתקבלים מעכברים טרנסגניים המבטאים GFP. שיטה זו מספקת מודל ניסויי במבחנה כדי לחקור את היעילות של תרכובות בדיקה על ייצור ROS.

בדיקת ציטומטריית זרימה לכימות עקה חמצונית: בדיקה לכימות מיני חמצן תגובתי באורגנואידים במעיים באמצעות בדיקות פלואורוגניות

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

הסרטון מדגים בדיקת ציטומטריית זרימה של זרימת תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי לזהות את פעילות הזריעה של אגרגטים חלבוניים שבודדו מדגימות ביולוגיות. תאי יונקים המבטאים חלבוני טאו ריפורטר מודגרים בקומפלקסים של התמרה ליפוזומלית המכילים זרעי טאו. זרעים אלה מתווכים את הצבירה של חלבוני הכתב, מה שמוביל ליצירת אות חיובי FRET בציטומטר הזרימה.

טכניקת ציטומטריה של זרימת FRET לזיהוי צבירת חלבוני כתב המושרה על ידי זרעי טאו

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על...

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

פרוטוקול זה מתאר את היישום של זמן א-סימטרי איתור למתוח מערכת מיקרוסקופית אופטית עבור הדמיה תא בודד זרימה microfluidic מהירים ויישומים שלה cytometry זרימת הדמיה.

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

מחקר זה מתאר שיטה לניסויים בתפוקה גבוהה באמצעות מערך LED מודפס בתלת מימד כדי לייעל את ביטוי הגנים המושרה באור בתאי HEK293T.

אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

למד שילוב אופטוגנטיקה עם ציטומטריית זרימה לניתוח תאים Ramos B בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי תקשורת תאית עם בקרה אופטית מדויקת וניתוח אופטוגנטי חדשני.

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

גלה סרטונים נוספים