Name: טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: חקור את שיטת הכליה העכברית המבודדת והמושרית לניתוח תפקוד כלייתי ללא השפעות מערכתיות. שיטה זו מאפשרת חקר פציעת כליה חריפה במודל אקס ויוו למשך שעה אחת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות להנס-יואכים שורק על עצות מדעיות שלא יסולא בפז. המחברים רוצים להודות למוניק קארל ומישל היידמאייר על הסיוע הטכני המצוין, לדיוויד פנטון ריבאס ונורדין פארס על קריאה ביקורתית של כתב היד ולקרסטן וגנר ויורג ביבר על הנוגדן NaPi-2a. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי השוויצרי לכשירות במחקר "Kidney.CH" ועל ידי מענק פרויקט (310030_143929/1) מהקרן הלאומית למדע של שווייץ.

כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים המתוארים בכתב היד הזה נערכו על פי חוק השויצרי ואושרו על ידי ממשל הווטרינרים של קנטון ציריך, שוויץ. 1. הצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות 1 - 4 ואת הורמון נוגד השתנה (ADH) פתרון (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ דיאליזה (טבלה 1). הערה: זהו המאגר משמש חיץ הדיאליזה במהלך זלוף. מאוחר יותר, אריתרוציטים ידוללו במאגר זה כדי ליצור את perfusate הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה כדורי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 250 מיליליטר של תרכיז כדורי אדם (חומר נבדק המתקבל מבנק הדם המקומי) ל -500 מיליליטר עם חיץ דיאליזה. צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 8 דקות. הסר את החוצץ, נזהר שלא להסיר כל אריתרוציטים. חזור 3x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את (אלבומין בסרום שור; BSA) אלבומין חיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת 200 מ&quot;ל של dialysiחיץ s, לפזר 44 גרם של BSA באמצעות בר ומערבב. סנן את הפתרון עם נייר סינון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את perfusate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את אריתרוציטים משלבים 1.3.1 דרך נייר סינון לתוך מאגר BSA. מלאו עד נפח כולל של 800 מ&quot;ל עם חיץ דיאליזה. הערה: זהו perfusate הסופי. ההמטוקריט צריך להיות עכשיו בין 8 ל 12%. את perfusate ניתן לאחסן עד 12 שעות ב 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. דיאליזה ייזום חמצון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל באמבט המים המקיף את המאגר למאגר הגדול, מאגר מאגר קטן, ובית נבחרים הלחים (תא קטן, דופן כפולה הביא 37 ° C ו 100% לחות מאוחר יותר להחזיק הכליה) עד 37 ° C (איור 2) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את מיכל חיץ גדול עם למאגר דיאליזה המאגר קטן עם perfusate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת הגז 5% CO 2/95% O 2 למאגר דיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דיאליזה רציפה של perfusate נגד מאגר הדיאליזה. תשמור על עצמך כדי להשתמש צינורות דיאליזה נמוכים שטף. המשך לשלב 3. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> איור 2: ציור סכמטי של מעגל זלוף. ערכת מוצגי הרכיבים העיקריים של מעגל זלוף ואת כיוון זרימת חיץ. כל הרכיבים מוקפים הכחול כהה נשמרים על 37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים / תרמוסטט. 1: דיאליזת חיץ של לפחות 3 פעמים את הנפח של למאגר זלוף הוא מבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. 2: דיאליזת חיץ חיץ זלוף הם dialyzed ברציפות אחד נגד שני בתוך שפופרת דיאליזה באמצעות משאבת הרים. 3: בשל דיאליזה זה, למאגר זלוף מועשר 9% O 2/5% CO 2 ורמות אלקטרוליטים נשמרות througho מתמידזלוף ut. 4: משאבת הרים מניעה למאגר זלוף לכיוון הכליה. 5: windkessel מסיר גלי peristaltic ופועל כמלכודת בועה. 6: רגשי לחץ (מחובר 4. (משאבת הרים) כדי לשמור על לחץ מתמשך ובמקביל לאפשר זרימה לסירוגין בחופשיות). 7: במהלך זלוף, הכליה נשארה בתא לח עבור לחות באוויר 100% וטמפרטורת כליות 37 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 3. הליך כירורגי חלק 1 (עבור תרשים של כל ליגטורות, ראה איור 3) הערה: בצע את כל ליגטורה באמצעות 5-0 חוט כירורגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בזריקה intraperitoneal (10 μl / גרם של משקל הגוף, 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין ו xylazine 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מומס 0.9% NaCl). אשר עומק מספיק של anesthEsia ידי בדיקת עדר רפלקסים אחורי רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העכבר במצב שכיבה בתא לח. להגן על העיניים עם משחת וטרינר. מניחים מזרק 1 מ&quot;ל מתחת השדרה לרומם את כלי המותני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy החציוני מפסגת הערווה לפתיחת החזה הראשון העור, אז שרירי הבטן, עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי ומניח אותו בצד השמאלי של העכבר לרוחב מהבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את השלפוחית ​​מרקמות חיבור ולחקור הן השופכנים ואת השופכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב השופכן השמאלי (אני ליגטורה). סגור את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב השופכה (ליגטורה השנייה). סגור את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה &quot;לאסו&quot; סביב השלפוחית ​​כולה (ליגטורה III). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את שלפוחית ​​השתן 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate הפתיחה עם צינורות 2 סנטימטר PE 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> III סביב צינור ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השופכן שמאלה דיסטלי השופכה מן ליגטורה. דפדףדר כעת מצורף השופכן התקין רק ובחופשיות נעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אבי העורקים בבטן של רקמות שומן החיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ליגטורה אמצע אבי העורקים בבטן (IV ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב האאורטה מתחת לסרעפת בין העורק mesenteric מעולה המטען צליאק (V ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב עורק mesenteric מעולה (VI ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ליגטורה אבי העורקים ישירות מתחת ימינה ומעל עורק הכליה השמאלית (VII ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב חבילת וריד הזנב (קאווה) (VIII ליגטורה). המשך לשלב 4. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> איור 3: ציור סכמטי של ליגטורות להציב במהלך הניתוח. מראה כללי של הבטן הפתוחה לאחר פיום הבטן. המעי מועבר אל מחוץ שמאלה. L ו- R מצביעים הכליה הימנית והשמאלית. הקווים שחורים להציג את האזור של ליגטורה בהתאמה. ליגטורות ממוקמות ראשונה ולאחר מכן סגור, ברצף הנתון בטקסט. X מסמן את מיקום החתך עבור cannulation אבי העורקים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 4. לקרקע של סבב זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הסיבובית למלא את הצינורות עם perfusate. תשמור על עצמך כדי לרוקן את כל בועות האוויר ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המכשיר windkessel לכ מהדרג הבינוני עם perfusate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את מתמר לחץ 0 מ&quot;מ כספית כאשר כל הצינורות מתמלאים ותזרים הוא 0. שמור את מחט זלוף ברמת הכליות במהלך הזמן הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור זרימת ברמה מינימלית קבועה (0.6 מ&quot;ל / דקה) והמשך לשלב 5. </li></ol> 5. חלק הליך כירורגי 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מהדק בין IV ליגטורה ואת ההסתעפות של רנה עזבהעורק l. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קטן זנב אב העורקים של IV ליגטורה, נזהר שלא לחתוך את הקיר הגבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב את פתח אב העורקים עם מרחיב כלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate אבי העורקים עם מחט (2 ס&quot;מ, משך PE 50), דוחף את קצה רק כדי מהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את קצה המחט cranially עד שהוא מגיע לצומת של העורק בכליה הימנית לבין אבי העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VII ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IV ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החזה עם מספריים על ידי לנתח את הסרעפת. עם חתך אחד, להפריד את אב עורקים, וריד נבוב, לב ועצבים וגטטיבי. עם צעד זה, החיה הוא הקריב באמצעות exsanguination מהירה תחת הרדמה עמוקה רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את תכנית בקרת לחץ של משאבת זלוף. לשמור על לחץ הממוצע בין 80 ל -100 מ&quot;מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> V. ליגטורה Close </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VI ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VIII ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליות חינם מימין של tissu החיבורדואר והטבעה שלה לתוך הקפסולה השומן במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אבי העורקים proximally כדי ליגטורה V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העורק mesenteric מעולה distally כדי ליגטורה VI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את צרור כלי החוצה תומכת כליות, מקפיד לא לחתוך לתוך כלי עצמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הכבד על הקשר לכליה. תשמור על עצמך כדי לשחרר את הכליה, אך להשאיר חלק קטן של החסיד הכבד אליו, כך הווריד הנבוב נשמר פתוח על ידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צרור הכליות מתוך העכבר. הסר את העכבר מהאולם הלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה &quot;לאסו&quot; סביב החיבור של הכבד והכליות (IX ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate את הווריד הנבוב עם קו ורידי (2 ס&quot;מ PE 50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IX ליגטורה סגור. יצוא ורידי דרך קו הוורידים צריך להתחיל מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את התא הלח. </li></ol> 6. ניתוח Downstream <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השעה הבאה, לפקח באופן רציף את זרימת הדם ואת intravascular לחץ 15. אסוף יצוא ורידי, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח של, למשל, שחרור רנין כליות 7. אסוף שתן לניתוח ריכוז אלקטרוליטים ו -14 קצב הסינון הגלומרולרי. אחרי שעת 1 של זלוף, כליות ניתן snap-קפוא במשך מערבי סופג או להיות קבוע עבור הדמיה מתקרבות 16. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים ושום דבר אחר לחשוף.

העכבר מבודד כליות perfused הוא כלי לחקר תפקוד כליות בסביבה מבוקרת vivo לשעבר עבור שעה 1, לגשר על הפער בין in vivo ניסויים בבעלי חיים שלמים, אשר עשוי להיות פגומים על ידי ההשפעה של גורמים מערכתיים רבים, ובניסויים במבחנה מגזרי נפרון מבודדים או תאים בתרבית, אשר בהכרח להזניח את ההשפעה של מבנה איבר ללא פגע על תפקוד. יש, לידיעת המחברים, לא טכניקה חלופית שבה לבצע משימה ספציפית זו. מחקרים ביוכימיים על רקמת כליה, לעומת זאת, יכול להתבצע בצורה הרבה יותר פשוטה באמצעו...

זלוף מבודד איברים כבר את הנושא של מאמץ מתמשך בין פיזיולוגים במשך עשורים רבים 1. הטכניקה מאפשרת את הפונקציה של האיברים, ללא השפעות מערכתיות כגון לחץ דם, הורמונים, או עצבים, כדי להיחקר. קרל אדוארד Loebell נחשב הראשון תאר את זלוף המוצלח של כליות מבודדות, בשנת 1849 2. מאז, מנגנון זלוף עבר עידון משמעותי. פריי גרובר הציגו ריאות מלאכותיות למשאבות חמצון pulsatile זלוף 2 הרציף. בעוד החוקרים מוקדם בעיקר למד הכליות יונקים-כלומר גדול, חזירים 2 וכלבים 3 -The הדו&quot;ח הראשון של השימוש הכליות עכברוש, על ידי וייס ואח &#39;. , היה ציון דרך בחקר זלוף 4 קטן-יונק-איבר. Schurek et al. דיווח על כך שיש צורך להוסיף אריתרוציטים יונקים אל perfusate אם צינורי כליות מספיקחמצון היה להיות מושגת 5. קריטי עבור ניסויים לטווח ארוך היה המבוא של דיאליזה הרציפה של למאגר על ידי אותה קבוצת המחקר 6. בשנת 2003, Schweda et al. היו הראשונים לדווח כליה perfused תפקודית מבודד העכבר (MIPK) 7, מעודן מאוחר יותר על ידי Rahgozar et al. 18 ו ואח &#39;לינדל. 14. למרות שמבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר החולדה המבודדת כליות perfused, שימוש MIPK נושא את היתרון של המאפשרים השימוש במגוון רחב של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מציג את הפרטים של השיטה &#39;המחברים עבור מרוססת כליות עכבר מבודדות במשך שעה 1. השיטה מאפשרת הערכה הרציפה של קצב זרימת כליות, התנגדות כלי דם, שחרור הורמון, ניתוח גז דם, בדיקת שתן, ואת היישום של סמים. בעקבות ההליך, כליות יכולות להיות מעובד לניתוח מולקולרי ביוכימיים, להיות קבוע עבור מיקרוסקופיה, אוהושתל עכבר נמען (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> איור 1: סקירה כללית של אפשריות קלט / פלט לכליה perfused מבודד. BGA: ניתוח גז דם. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> טכניקה זו עשויה תקבל תשומת לב גוברת בשנים קרובות, כמו יישומים חדשניים רבים בדיונים מול השחר של זלוף כליות normothermic הממושך לפני ההשתלה (עם או בלי היישום של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום) 8, 9, 10 , 11, Bioengineering של הכליות כולו מן הפיגומים decellularized 12, ואת היישום של מינונים גבוהים של צבעי ניאון הדמיה multiphoton 13 </sup&gt;. זהו גם מודל אידיאלי שבה כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים במהלך אי-ספיקת כליות חריפה 14. פרוטוקול צעד אחר צעד ניתן לאפשר מעבדות אחרות לבצע זלוף כלית עכבר המבודד בהצלחה. ראשית, ההרכב והכין למאגר מצוין. לאחר מכן, הניתוח מתואר בפירוט את השלבים הקריטיים מוצגים. נתונים שלישיים, מוצג מייצגות הכנה מוצלחת: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, GFR, והפרשה-כל אלקטרוליט שבר המדידות התפקודיות ליום micrographs אלקטרוני הילוכים-הכדאיות של המורפולוגיה של מגזרים נפרון שונים של כליות perfused שוות אחר שעה 1 של זלוף.

<table><tbody><tr><td><מעגל זלוף חזק>חזק:</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא לח חזק 834/8</td><td>מנגנון הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>קנולרי עם סל ויציאה צדדית</td><td>מנגנון הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>תרמוסטט TC120-ST5&nbsp;</td><td>מנגנון הרווארד/הוגו זקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V משאבת רולר Reglo אנלוגי</td><td>מנגנון הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מעוטר לתמיסת חיץ 1 ליטר</td><td>מכשיר הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מעוטר לתמיסת חיץ 0.5 ליטר</td><td>מכשיר הרווארד/הוגו זקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>מתמר לחץ APT300&nbsp;</td><td>מכשירי הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D תקעים מתמר</td><td>הרווארד מנגנון / הוגו זאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys בקר סרוו</td><td>הרווארד מנגנון / הוגו זקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>מכשירי הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>רכישת נתונים HSE-USB</td><td>מכשירי הרווארד/הוגו סאקס אלקטרוניק GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>דיאליזטור שטף נמוך דיאקאפ פוליסולפון</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PE לקנולרציה של אבי העורקים 1.19 מ"מ מזהה x 1.70 מ"מ OD</td><td>סיינטיפיק סחורות בע"מ</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים חוצץ:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמינופלזמל 10%</td><td>B.בראון</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית מלח מונוסודיום הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-חומצה מאלית מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן-L-לקטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אלפא-קטוגלוטרית מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>'31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>קריאטינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>רוש</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>רידל-דה-הא&אומל; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>הורמון אנטי-דיורטי dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-אינולין</td><td>מסנן סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td> משמש לסינון אריתרוציטים</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA ניתוח:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 flex</td><td>רדיומטר רפואי ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פיליפס CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. זהו תנאי הכרחי ללימוד הפיזיולוגיה של האיבר מבודד עבור יישומים חדשניים רבים שעשויים להיות אפשרי בעתיד, כולל decellularization זלוף עבור Bioengineering כליות או הממשל של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום במינונים גבוהים פריים הכליה להשתלה. במהלך הזמן של זלוף, הכליה ניתן להשפיע, תפקוד כלייתי ניתן להעריך, ומגוון תרופות מנוהלות. לאחר שהסתיים ההליך, הכליה ניתן להשתיל או מעובדי ביולוגיה מולקולרית, לאנליזה ביוכימית, או במיקרוסקופ. מאמר זה מתאר את perfusate ואת הטכניקה הניתוחית דרושה זלוף vivo לשעבר של כליות עכבר. פרטים של מנגנון זלוף ניתנים ונתונים מוצגים מראים את נiability של הכנת הכליות: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, ונתונים שתנו כמו micrographs אלקטרונים פונקציונלי, שידור של מגזרים נפרון שונים כמו readouts מורפולוגיים, וכתמים מערביים של חלבוני תחבורה של מגזרים נפרון שונים כמו readout המולקולרית.

עם תארה את השיטה, כליות עכבר מבודדות יכולות להישאר קיימא עבור שעות 1 לפחות. בדקנו את כדאיות הרקמות לאחר 1 hr של זלוף הרציף עם (זרימת דם כליות והתנגדות וסקולרית, ניתוח גז דם של יצוא ורידים, GFR, + Na שבר שתן ו- K + הפרשה, ו osmolality שתן) פונקציונליות מורפולוגיים (אלקטרוני הילוכים מיקרוסקופיה, TEM) שיטות בארבע כליות של wildtype C57Bl / 6 עכברים. בנוסף, כתמים מערביים של חלבוני סמן פסגה של מגזרים אבובית שונים בוצעו, השוואת כליות...

כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. החוצצים טכניקה כירורגית מתוארים בפירוט.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לנתח את תפקוד הכליה המבודד בכליה של עכבר המושרה בביצוע פרפוזיה ex vivo. זאת תוך ה excluded של השפעת לחץ הדם, הורמונים או מערכת העצבים האוטונומית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנפרולוגיה.מספק תובנות לגבי תפקוד של איבר מבודד ומשמש ככלי יעיל לחקר פגיעה חריפה בכליות. היתרון העיקרי של שיטת ה-IPK הוא שניתן לחקור את תפקוד האיבר ללא השפעות מערכתיות. לאחר הכנת העכבר לניתוח, בצע באמצעות מספריים לפרוטומיה מרכזית מהרכם הפוביס ועד לעצם הгруד.ראשית פתחו את העור, ולאחר מכן את שרירי הבטן. לאחר מכן, הוציאו את המעיים והניחו אותם בצדו השמאלי של העכבר, לטרלית לבטן. כעת, שחררו את שלפוחית השתן מרקמה חיבורית וחשפו את שני השופכנים ואת השופכה.עבור הליכים אלה, יש להניח את כל הליגטורות באמצעות תפרים מסוג 5-0. את הליגטורה הראשונה יש להניח סביב השופכן השמאלי. סגרו אותה בחוזקה באמצעות קשר כירורגי כפול.בשלב הבא, הצמידו ליגטורה סביב השופכה (urethra) תוך שימוש באותה טכניקה. לאחר מכן, הצמידו ליגטורת לאסו (lasso ligature) סביב השלפוחית כולה, אך השאירו אותה ללא קשירה. כאשר שלוש התפרים הראשונות במקומן, השתמשו במספרי עיניים כדי לבצע חתך באורך של 1 מילימטר לתוך השלפוחית.אל תוך חתך זה, הכניסו קנולה העשויה משני סנטימטרים של צינור PE-50. כעת הדקו את הקשירה המקיפה את שלפו

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מודל Murine מדויק לפגיעה כליות חריפה (AKI) בשל איסכמיה הוא כלי חשוב לחקור פגיעה כליות חריפה ואולי אף למצוא כלים טיפולית לטיפול פגיעה כלייתית. מערכת המשקל תלוי מציעה כלי חסימה מיידית ואמינה reperfusion עורק הכליה מבלי לגרום גודש כליות.

השימוש במערכת תלוי במשקל עבור חסימת עורק הכליה מבודדת

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך מיצוי הכליה מהחלל הרטרופריטוניאלי של העכבר. ניתן לנתח את הכליה המופקת במיקרודיסקציה נוספת כדי לקבל כליה שלמה ללא כמוסת הכליה ושכבת השומן שמסביב.

חילוץ כליה שלמה מעכבר: טכניקה להשגת כליה ללא כמוסת כליות מדגמי מורין

סרטון זה מתאר את השיטה לבידוד גלומרולי שלם מכליות עכבר. הגלומרולי העטוף והמכוסה המתקבל כך יכול לשמש גם לטיפוח גידולי תאי אפיתל קודקודיים מהכליה המורין.

בידוד גלומרולי: טכניקה להשגת גלומרולי שלם מכליה מורין

אנו מתארים מודלים של פגיעה בכליות הנגרמות איסכמיה reperfusion בינוניות וקשות שבו העכברים עוברים הידוק חד צדדי ואחרי כריתת כליה הנגדית בו זמנית או עיכוב, בהתאמה pedicle כליות. מודלים אלה נותנים באופן עקבי עלייה לפגיעה בתפקוד הכלייתי וסיסטיק לאחר פציעה, אך חומרת פציעה והישרדות תלויות ברקע, גיל וכירורגי ציוד עכבר.

דגם איסכמיה reperfusion של פגיעה חריפה בכליות ופגיעים ההודעה פיברוזיס בעכברים

טכניקות אמינות ויעילות לבידוד תאי חיסון כליות נחוצות ליישומים במורד הזרם. זה דורש תיוג נוגדנים על פני השטח של מספר קטן של תאי חיסון כליות. כאן אנו מתארים שיטה תמציתית לבידוד תאי חיסון בכליות שלכאורה משיגה מטרה זו.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית כדי לבודד ולאפיין העכבר הראשי כליות צינורי תאים יכולים לאחר מכן להיות תת תרבותי להערכת תפקודים ביולוגיים כליות ex-vivo, כולל ביואנרגיה מיטוכונדריאלי.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

מאמר זה מספק הוראות מפורטות כדי לאפשר לחוקרים לבצע חסימת שופכן חד צדדית הפיכה בעכברים באמצעות מודל סטנדרטי המאפשר ניתוח של התוצאות המבניות והתפקודיות ארוכות הטווח לאחר היפוך חסימת שופכן ממושכת.

מודל עכבר להערכת התוצאות המבניות והתפקודיות ארוכות הטווח לאחר היפוך של חסימה חד צדדית ממושכת בשופכן

מאמר זה מציג מודל CKD איסכמי המשתמש ב-IRI כלייתי חד-צדדי עם נפרקטומיה נגדית שבוצעה יום לפני איסוף הדגימה; פרוטוקול זה מאפשר הערכה פונקציונלית מבוססת סרום, הישרדות גבוהה ופתולוגיה של CKD ניתנת לשחזור ב-28 ו-42 ימים, ומספק פלטפורמה גמישה למחקרים מכניים והתערבותיים.

מודל העכבר של מעבר ממחלת כליות חריפה לכרונית שנגרם מאיסכמיה כליתית/פגיעה ברפרפוזיה

מערכת הדמיית ניגודיות בלייזר עם נקודות שימשה למעקב אחר השינויים בזרימת הדם המיקרו-כלי דם בכליה במהלך איסכמיה-ריפרפוזיה חד-צדדית לאחר כריתת הכליה הימנית בעכברים.

פרפוזיה מיקרווסקולרית במעקב באמצעות הדמיית ניגודיות בלייזר ספקל במהלך פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה בכליה בעכברים

חקור את שיטת הכליה העכברית המבודדת והמושרית לניתוח תפקוד כלייתי ללא השפעות מערכתיות. שיטה זו מאפשרת חקר פציעת כליה חריפה במודל אקס ויוו למשך שעה אחת.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

גלה סרטונים נוספים