טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח את תפקוד הכליות המבודד בכליה של עכבר ex vivo. לא כולל השפעת לחץ דם, הורמונים או מערכת העצבים האוטונומית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של נפרולוגיה.

מתן פנים לתפקוד איברים מבודדים ומשמש ככלי אלגנטי לחקר פגיעה כלייתית חריפה. היתרון העיקרי של ה-IPK הוא שתפקוד האיברים נחקר בהיעדר השפעות מערכתיות. לאחר הכנת העכבר לניתוח, בעזרת מספריים, בצע לפרוטומיה בינונית מפסגת הערווה לעצם החזה.

ראשית פתח את העור, ולאחר מכן את שרירי הבטן. לאחר מכן, הסר את המעיים והניח אותם בצד שמאל של העכבר, לרוחב מהבטן. כעת, שחררו את שלפוחית השתן מרקמת החיבור וחשפו גם את השופכנים וגם את השופכה.

עבור הליכים אלה, הנח את כל הקשרים באמצעות תפרים 5-0. הקשירה הראשונה שיש למקם היא סביב השופכן השמאלי. סגור את זה בחוזקה עם קשר כירורגי כפול.

לאחר מכן, הניחו קשירה סביב השופכה באותה טכניקה. לאחר מכן, הניחו קשירה לאסו סביב כל שלפוחית השתן, אך השאירו אותה לא קשורה. עם שלושת התפרים הראשונים במקומם, השתמש במספריים לעיניים כדי לבצע חתך באורך מילימטר אחד לשלפוחית השתן.

לתוך חתך זה, הניחו צינורית העשויה משני סנטימטרים של צינורות PE-50. כעת סגור את הקשירה שמכסה את שלפוחית השתן, ומאבטח את הצינורית. כששלפוחית השתן קנולטית, חתכו כעת את השופכן השמאלי ואת השופכה הדיסטלית מהקשירה.

כעת יש לחבר את שלפוחית השתן רק לשופכן הימני ולנוע בחופשיות. לאחר מכן, הסר את רקמות החיבור והשומן המקיפים את אבי העורקים הבטני. לאחר מכן הניחו קשירה סביב נקודת האמצע של אבי העורקים החשוף וממש מתחת לסרעפת בין העורק המזנטרי העליון לגזע הצליאק.

שמור על כל אחד מאלה רופף גם כן. לאחר מכן, הנח קשירה סביב העורק המזנטרי העליון. כעת, הנח קשירה שלישית סביב אבי העורקים ישירות מתחת לעורק הכליה הימני ומעל עורק הכליה השמאלי.

זוהי קשירה מספר שבע. לבסוף, שים קשירה סביב חבילת וריד הזנב. כעת הניחו מהדק בין קשירה מספר שבע להסתעפות עורק הכליה השמאלי.

לאחר מכן, בצע חתך קטן באבי העורקים, זנב לקשירה שבע, הקפד לא לחתוך את דופן הגב ולמתוח את הפתח עם מרחיב כלי. לתוך הפתח, הכנס צינורית PE-50 שנמשכה בשני סנטימטרים, ודחף את הקצה ממש לתוך המהדק. לאחר מכן, פתח את המהדק.

לאחר מכן, דחוף את קצה המחט בגולגולת עד שהיא מגיעה לצומת עורק הכליה הימני ואבי העורקים. כעת סגור את הקשירה שבע, ולאחר מכן סגור את הקשירה בנקודת האמצע של אבי העורקים הבטני. המשך על ידי פתיחת החזה במספריים על ידי ניתוח הסרעפת.

לאחר מכן, בחתך בודד, הפרד את אבי העורקים, הווריד הנבוב, הלב והעצבים הצמחיים. כעת, התחל את בקרת הלחץ של משאבת הזלוף ושמור על הלחץ הממוצע בין 80 ל-100 מילימטרים של כספית. כעת, סגור את שלושת הקשרים הלא קשורים הנותרים סביב אבי העורקים וחבילת וריד הזנב.

בעזרת מספריים, שחרר את הכליה הימנית מרקמת החיבור שמסביב ושחרר אותה מקפסולת השומן. חותכים את אבי העורקים בסמוך לקשירה בין העורק המזנטרי העליון לגזע הצליאק. לאחר מכן, חתוך את העורק המזנטרי העליון באופן דיסטלי לקשירה סביב העורק המזנטרי העליון.

כעת, הסר את צרור כלי הדם התומך בכליות, הקפד לא לחתוך את הכלים עצמם. לאחר מכן, חותכים את הכבד בחיבור לכליה, אך משאירים חלק קטן מהכבד מחובר אליו, כך שהווריד הנבוב נשאר פתוח על ידו. השלב הבא הוא הסרת צרור הכליות מהעכבר.

כעת, השאירו את הכליה בתא והסירו את העכבר. בחיבור בין הכבד לכליה, הניחו קשירה לאסו. לאחר מכן, קנול את הווריד הנבוב עם קו ורידי וסגור את קשירת הלאסו.

הכליה צריכה כעת לשבת ביציבות בקופסה. זרימה ורידית דרך הקו הוורידי צריכה להתחיל מיד. יציאת השתן תתחיל לאחר כשלוש דקות.

פריסטלטיקה של השופכן צריכה להתחיל מיד ולהישאר יציבה למשך שעה לפחות. סגור את התיבה. ההכנה הושלמה כעת ואמורה להישאר בת קיימא לפחות שעה.

לאחר שימוש בשיטה המתוארת על C57 שחור 6 עכברים, נבדקה כדאיות הרקמה של ארבע כליות לאחר שעה של זלוף רציף. הלחץ נשמר על 100 מילימטרים רצופים של כספית. זרימת הפרפוזה והתנגדות כלי הדם נותרו יציבות בכל ארבע הכליות.

קצב הסינון הגלומרולרי הוערך באמצעות פינוי אינולין FITC שנועד לעלות עם הזמן אך לא באופן משמעותי. הפרשה חלקית של נתרן ואשלגן הוערכה לאחר 55 דקות של זלוף. פרמטרים אלה גדלו בהשוואה למצב in vivo.

לאחר 55 דקות, מולריות המשתנה לא עלתה מעל האוסמולליות של הזרימה הוורידית. לאחר מכן הכליות תוקנו והאולטרה-מבנה שלהן הוערך באמצעות TEM. גלומרולי במקטעי S1 של צינוריות פרוקסימליות נראו ברובם ללא שינוי.

חלק, אך לא כל מקטעי S2, S3 של הצינוריות הפרוקסימליות בגפיים העולות העבות שלא היו קרובות לצרורות כלי הדם הראו סימנים של נזק לאיברים. בבדיקה מדוקדקת יותר, צינורות מפותלים דיסטליים ותעלות איסוף לא הראו סימני נמק. בסך הכל, הכליות שיקפו את מה שדווח על כליות מבודדות חולדות.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות ניתוח כמו הדמיה או עובדות ואחריהם ניתוח חלבון או RNA על הרקמה כדי לקבל תובנות נוספות.