גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין דגימות עם מספרי תאים נמוכים לביצוע ניתוח TEM בצורה יעילה וניתנת לשחזור. שיטה זו יכולה לעזור לחשוף את כל המבנים של תאים אמיתיים והגדרות פיזיולוגיות טובות יותר בתחום הביו-רפואי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג תוצאות איכותיות וכמותיות ממספרי תאים נמוכים בצורה הניתנת לשחזור.

כדי להתחיל, השתמש בעובדות כדי למיין 10,000 תאי גזע המטופויאטיים, או HSC לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מכיל 600 מיקרוליטר של מדיום דולבקו שונה עם 10% FBS. בעזרת צנטריפוגה עם דליים מתנדנדים החוצה, סובב את ה- HSC הממוין ב -1, 000 פעמים G למשך 10 דקות.

השתמש בשאיפה גויה כדי להסיר את כל המדיום מלבד 200 מיקרוליטר. כדי לתקן את התאים, הוסף 0.2 מ"ל של תמיסת קיבוע טרייה שהוכנה על ידי שני X, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של 0.1 מאגר קקודילאט מולארי כדי לשטוף את התאים.

שוב צנטריפוגה של התאים, הפעם ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לאחר צנטריפוגה, והסרת כל המאגר מלבד 200 מיקרוליטר, הוסף 200 מיקרוליטר של שני מיליגרם למיליליטר של אוונס כחול במאגר קקודילאט, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי להכתים את התאים. השתמש ב-600 מיקרוליטר של מאגר קקודילאט מולארי 0.1 כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-200 המיקרוליטרים הנותרים של המאגר לפני העברת תרחיף התא לצינור של 0.5 מ"ל. בשלב זה הגלולה צריכה להיות גלויה בצינור. בעזרת צנטריפוגה על השולחן, סובב את התאים ב -1, 000 פעמים G למשך 10 דקות.

לאחר מכן הסר בעדינות את המאגר מבלי להפריע לכדור התא הזעיר הנראה כעת, והשאיר 50 מיקרוליטר של מאגר בצינור. הכן תמיסת אגרוז של 4%, על ידי הוספת 200 מיליגרם של אגרוז נמס נמוך לחמישה מיליליטר של מאגר קקודילאט מולארי של 0.1 בצינור של 15 מ"ל. ממיסים את האגרוז על ידי העברת הצינור למים רותחים בבקבוק זכוכית של 100 מ"ל.

הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת האגרוז לצינור של תרחיף התא. צנטריפוגה מיד ב -1, 000 פעמים G ו -30 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר אישור שהתאים התגלגלו לתוך האגרוז המוצק למחצה בתחתית הצינור, העבירו מיד את הצינור לארבע מעלות צלזיוס, או קרח, למשך 20 דקות כדי למצק את האגרוז.

בעזרת מחט בגודל 27, העבירו בזהירות את האגרוז המוצק, המכיל את גלולת התא, לצלחת פטרי פלסטיק של 35 מ"ל המכילה 0.1 מאגר קקודילאט מולרי. בעזרת עיטור אזמל האגרוז המוצק המכיל את כדור התא לחתיכה אחת של כמילימטר עד שני מילימטרים. לאחר מכן העבירו אותו לצינור חדש של 1.5 מ"ל.

הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר קקודילאט מולארי של 0.1 ושטוף את כדור תאי האגרוז באמצעות פיפטה כדי להוסיף ולהסיר את המאגר. הסר את המאגר מכדור תאי האגרוז ובמכסה אדים, תוך לבישת ביגוד מגן וכפפות, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת טטרוקסיד אוסמיום 1%. דגרו את כדור התא בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה יש לשטוף את הדגימה שלוש פעמים. העבירו אותו לבקבוקון נצנוץ זכוכית של 20 מ"ל עם מכסה. לאחר מכן יש לייבש את הדגימה באמצעות סדרת אתנול.

לאחר מכן הסתנן לדגימה בריכוזים הולכים וגדלים של שרף LX 112 באתנול לפני הדגירה ב-100% שרף פעמיים למשך 60 דקות בכל פעם. בעזרת מלקחיים מעבירים בזהירות את הדגימה לתחתית תבנית גומי בצורת קצה פירמידה, ומוסיפים שרף טהור על גבי הדגימה למילוי התבנית. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות כדי לפלמר את השרף.

כאשר השרף מפולימר, הסר אותו מהתבניות על ידי סיבוב תבנית הגומי. אשכול תאים שחור קטן צריך להיות גלוי בפירמידת השרף הפולימרית. השתמש בציאנואקרילט כדי לחבר את פירמידת השרף המפולמר על גליל הרכבה לצורך חתך.

לאחר הרכבת הבלוק על אולטרה-מיקרוטום, השתמש בסכין גילוח ובסכין יהלום כדי לקצץ את גוש הפירמידה, וליצור צורה טרפזית קצרה ורחבה כאשר החלק העליון והתחתון של הבלוק מקבילים זה לזה, ועם דפנות בזווית שווה. לאחר מכן השתמש בסכין היהלום כדי לקצץ את הבלוק סביב גלולת התא ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב חתיכת האגרוז של כדור התא. בעזרת האולטרה-מיקרוטום חתכו מקטעים של מיקרומטר אחד והשתמשו בכלי ריסים ולולאת מתכת כדי להעביר את החלקים מסירת המים למגלשת זכוכית.

לאחר מכן הניחו את השקופיות על פלטה חמה בחום של 37 מעלות צלזיוס לייבוש. בעזרת מזרק עם פילטר של 0.22 מיקרומטר, מוסיפים טיפה של תמיסה כחולה טלואטין לחלקים ודוגרים למשך שלוש דקות. ואז עם מים מזוקקים, העלו את המגלשות ותנו לחלקים להתייבש.

לאחר הייבוש בדוק את החלקים במיקרוסקופ אור כדי לזהות את מיקום התאים. לאחר מכן, השתמש בסכין יהלום כדי לחתוך חלקים דקים במיוחד. לאחר מכן, בעזרת כלי ריסים, העבירו שניים עד שלושה חלקים על 200 רשתות רשת מסירת המים והניחו בצלחת פטרי מזכוכית.

מעבירים את המנה עם הרשתות לצלחת חמה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לייבוש החלקים. הוסיפו טיפות של 1% אורניל אצטט, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להכתים את הרשתות. לאחר מכן, השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף שש עד שמונה פעמים.

מכתים עם ריינולדס ציטראט עופרת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני שטיפה שש עד שמונה פעמים. מעבירים את צלחת הפטרי מזכוכית המכילה את הרשתות לפלטה חמה בחום של 37 מעלות צלזיוס לייבוש החלקים. לבסוף, נתח את הקטעים במיקרוסקופ אלקטרונים ב 87 קילו-וולט.

מוצגים כאן בהגדלה נמוכה קטעים דקים למחצה מוכתמים בכחול טולואידין מבלוקים המכילים כדור תא זעיר המאשרים מקבץ תאים. תמונת הגדלה גבוהה יותר זו מציגה את המורפולוגיה השלמה של התאים. איור זה מייצג שדה תצוגה של אשכול התאים ממקטעים דקים במיוחד שנצבעו באורניל אצטט וציטראט עופרת ונותחו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים.

מוצג כאן HSC יחיד, המדגים כי המורפולוגיה ומבנה האולטרה של התאים נשמרו היטב. מיקרוגרף אלקטרונים מפורט מאוד בהגדלה גבוהה יותר של HSC בודד מראה את מבני האולטרה התוך-תאיים. בנוסף, תמונות בהגדלה גבוהה לכדו מבנה ושלמות שמורים היטב של אברונים תת-תאיים כגון מיטוכונדריה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד שש שעות, ועבור צביעה כחולה מתקדמת, והטמעת אגרוז, ולאחר מכן עיבוד TEM רגיל ייקח חמישה עד שישה ימים אם הוא מבוצע כראוי. אז אחרי שצפית בסרטון הזה יש לך הבנה טובה כיצד להכין דגימות מהכנת תאים אמיתיים לניתוח TEM.