Name: גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למדו שיטה יעילה להכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM). הפרוטוקול מדגים עיבוד תאי גזע המטופואטיים לקבלת תוצאות איכותיות וכמותיות אמינות במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליבת המחקר הפתולוגית על הסיוע במחקרי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים במרכז הרפואי לילדים בסינסינטי. העבודה נתמכה על ידי NIH (פרס גשר האגודה האמריקאית להמטולוגיה ל-MDF; R01 DK102890 ל-MDF).

כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית קרן המחקר של סינסינטי הילדים. לצורך המחקר, בתאי גזע hematopoietic בודדו ממח העצם של עכברים מולדים C57Bl / 6 בגילים 2 - 4 חודשים. מיון תאים באמצעות FACS לאחר צביעה של BM עם מקבלי משטח שונים כולל Lineage, c-Kit, SCA-1, FLT3 ו- CD34 שימש לטיהור HSC מבוסס על Lin- SCA-1 + c-kit + FLT3 - CD34 - gating אסטרטגיה כמו פרוטוקול סטנדרטי תיאר לפני 8. זהירות: כימיקלים רעילים מספר מאוד משמשים במהלך הליך זה. אלו הם רעילים משאיפת ומגע עור. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. לעבוד במנדף תוך כדי עבודה עם כימיקלים אלה. 1. תאים, קיבוע, מכתים טרום הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין 10,000 בתאי גזע hematopoietic (באמצעות לין - SCA-1 <sup&gt; + c-kit + FLT3 - CD34 - gating האסטרטגיה; LT-HSC אוכלוסייה) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 600 μl השונה של Iscove הבינוני של Dulbecco (IMDM) עם 10% בסרום שור עוברי באמצעות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה HSCs מיון XG ב 1000 במשך 10 דקות בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge באמצעות צנטריפוגות עם דליים התנופה-אאוט. הסר בינוני על ידי שאיפה עדינה ולהשאיר 200 בינוני μl של צינורות בכל שלב. בשלב זה, התא הגלול אינו נראה בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של תמיסת מקבע 2x בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1 1,9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון מקבע טרי לפני השימוש. בשעה 1x, הפתרון מורכב glutaraldehyde paraformaldehyde 3% ו -2.5% במאגר M 0.1 cacodylate. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות עם דליים-אאוט התנופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylateבאמצעות צנטריפוגה ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים קבוע על ידי הוספת 200 μl של 2 פתרון מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של כחול אוונס במאגר cacodylate דגירה במשך 20 דקות ב RT. התא יהיה בצבע כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים 3 פעמים עם 600 μl של 0.1 מ &#39;צנטריפוגה באמצעות חיץ cacodylate ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התאים 200 חיץ μl ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 0.5 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. הסר חוצץ בעדינות מבלי להפריע גלולה תא זעיר נראה כעת, ולהשאיר חיץ 50 μl בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 מ&quot;ג התכה נמוכה agarose עד 5 מ&quot;ל של 0.1 M חיץ cacodylate בצינור 15 מ&quot;ל פתרון agarose 4%. ממיסים את agarose על ידי העברת צינור למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית 100 מ&quot;ל ולשמור פושרים עד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 4% התכה נמוכה מומס agarose ב 0.1 M cacodylate חיץ ההשעיה תא צינור 0.5 מ&quot;ל ומיד צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אישור תאים pelleted בתחתית הצינור 0.5 מ&quot;ל לתוך agarose חצי מוצק לאחר צנטריפוגה, מיד להעביר את הצינור עד 4 מעלות צלזיוס או קרח למשך 20 דקות כדי לחזק את agarose. שלב זה הוא קריטי מאוד, כמו תא גלול גלוי קטן תוצאות שלב זה מקבץ טוב של תאים מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה מהצינור על צלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ פטרי המכילה חיץ באמצעות 3,10 מחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה לתוך חתיכה אחת של כ 1 - 2 מ&quot;מ עם אזמל. מעבירים את פיסת agarose המכיל גלולה לתא צינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 - 3 פעמים באמצעות 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylate ידי הוספה והסרה של חיץ באמצעות פיפטה ללא צנטריפוגה. השתמש חתיכת agarose זה המכיל את התא גלול עבור לשלב הבא. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני המעבר לשלב הבא. </li></ol> 2. Osmification, התייבשות, והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ cacodylate מהצינור 1.5 מ&quot;ל עם תא גלולה המכילה באמצעות agarose טפטפת. להוסיף 1.0 מ&quot;ל של 1% אוסמיום ארבע-חמצני (OSO 4) פתרון במנדף, דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 600 μl של 0.1 מ &#39;cacodylate חיץ ולהעביר את המדגם כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ&quot;ל עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את המדגם עבור התייבשות, חדירה והטבעה לתוך שרף (למשל, LX-112) עם שינויים סידוריים של הפתרונים הבאים לפי צלחת גם 6. הזז את פיסת agarose תא גלול באמצעות מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 25% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 50% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם ב 75%<html> אתנול ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 95% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 100% ב RT במשך 15 דקות, פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (3: 1) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 1) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 3) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם שרף טהור ב RT במשך 60 דקות, פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם לתחתית תבנית גומי בצורת קצה הפירמידה באמצעות מלקחיים בזהירות ולהוסיף שרף טהור יותר על גבי המדגם למלא את התבנית. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עבור פילמור שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר הפירמידה שרפה polymerized מהתבניות על ידי סיבוב עובש הגומי. אשכול שחור קטן של תאים צריך להיות גלוי בפירמידת שרף polymerized, כפי שתואר קודם לכן 7. צרף הפירמידה שרף polymerized על גליל הרכבה באמצעות cyanoacrylate. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. חתך במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את בלוק הפירמידה עם סכין גילוח וסכין יהלומים לאחר הרכבת הבלוק על-microtome אולטרה. ליצור צורה טרפזית רחבה קצרה עם החלק העליון והחלק התחתון של מקבילי בלוק זה לזה, ועם צדדים זוויתי באופן שווה. צורה זו של הפירמידה מסייעת עבור חתך סדרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן, לקצץ את הבלוק סביב התא גלול עם סכין היהלום ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב יצירת agarose תא הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 1 מיקרומטר חלקים באמצעות-microtome אולטרה. הזז את 1 מיקרומטר חלקים מהסירה למים לשקופית זכוכית באמצעות כלי עפעף ו כלי לולאת מתכת כפי שדווח בעבר 7. העברת חלקים בשקופיות ומגלשות העברת הצלחת החמה (37 מעלות צלזיוס) במשך ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של תמיסת toluidine הכחולה בסעיפים באמצעות מזרק מצויד 0.22 מיקרומטר מסנן דגירה במשך 3 דקות. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים let בסעיפים לייבוש. בדוק עם מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים סעיפים דקים (70 - 100 ננומטר) באמצעות סכין יהלום. זז 2 - 3 חלקים על רשתות 200-רשת מהסירה למים בכלי זכוכית פטרי באמצעות כלי עפעף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה רשתות עם קטעים על צלחת חמה ב 30 מעלות צלזיוס לייבוש חלקים למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הרשתות עם טיפות של אצטט uranyl 1% ב RT במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. הכתם עם ריינולדס להוביל ציטראט, ב RT במשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה את הרשתות על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס לייבוש חלקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ב 80 kV 7. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ulstract+Res%22%5BJournal%5D)">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li>
<li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li>
<li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li>
<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+between+formaldehyde%2C+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide%2C+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li>
<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

שיטה זו מאפשרת ניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים, באמצעות אוונס מכתים כחול agarose ההטבעה למקם תא גלול זעיר במהלך ההתייבשות, הטבעת השרף ו חתך תהליכים. חשוב לציין, היא שומרת צבירי תאים יחד ושומרת על אולטרה-מבנה התא, אשר רצוי לבחון מספר תאי כימות של נתונים. במחקרי TEM, תא גלולה המכילה מיליוני תאים נדרשה לעתים קרובות עבור embedment ביותר לתוך מטריצת agarose / ג&#39;לטין לשטיפה, התייבשות וחדירה לקבל נתונים מתאיים ר...

Ultra-מבניים תת-אברון הפרטים של תאים נחשפו בעיקר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) מחקרים מרקמות או כדורי תא 1,2. חתיכות מוצקות של רקמות יכולות בקלות להיות מנוצלות ללימודים במיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, TEM מנתח 1,3 על תאים בתרחיף להישאר מאתגר להצריך מספרים סלולריים גבוהים, כלומר, מיליוני תאים. בגלל זה, ניתוחים אולטרה-מבניים של אוכלוסיות תאי נדירות השעיה, למשל, בתאי גזע hematopoietic (HSCs), אינם להעריך בקלות. ניסיונות מרובים עבור ניתוח TEM ממדגמים נדירים תוך שימוש בגישות cytospin או בשכבה מצליחים לקבל נתונים כמותיים משמעותי ממספר מצומצם של תאים. לכן, הדרישה של מספר תאים גבוהים מגבילה את השימוש של כלי רב עצמה זה כדי להבין את פרטי ultrastructural subcellular של אוכלוסיות תאים נדירות. מגבלת מפתח ללימודי TEM עם מספר מצומצם של תאs השעיה הוא הלוקליזציה של התאים לעיבוד ולכן, מחקרי TEM מתאי מוגבל עם מידות קטנות במיוחד להישאר מאתגר. מספר גישות חלופיות אומצו כדי להתמודד עם מגבלה זו: ארגון ה- BSA / bisacrylamide (BSA-BA) פילמור בתיווך של השעיה התא, צביעת תאים עם צבע כדי לגרום להם גלוי על תמיכה סרט דק כולל coverslips, ו TEM מנתח מן ההכנות cytospin 4-6. עם זאת, הצלחה מוגבלת מאוד הושגה, כמו מעט מאוד תאים נמצאו בסעיפים לאחר חתך אולטרה. האתגר המרכזי של לזיהוי תאים דלילים נמשך משום monolayer התא אינה נראית בעיקר ג&#39;ל הקרושה עבור חתך. יתר על כן, הכנת cytospin של תאים עשויה לשנות הארגון הסלולר שלהם בשל הפצת תא ואת השבריריות של מבנה התא. לפיכך, חסרונות הגלומים אלה מתחייבים גישה חדשנית לבצע מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות עם יותרעֲקֵבִיוּת. כדי להתגבר על בעיה זו, שתארנו רומן ושיטת הכנת מדגם חלופי מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות 7. כאן אנו מדווחים פרוטוקול הכנת מדגם יעיל לבצע TEM מ דגימות ביולוגיות נדירות עם תוצאות איכותיות וכמותיות עקביות. כתמי כחולי אוונס בוצעו לאחר הקיבוע למקם תא גלול זעיר מתאי מספר נמוך, כלומר, 10,000 מח עצם גזע hematopoietic ו ובתאים שאחרת נותרו בלתי נראה, לבין הגלולה הייתה מוטבעת לתוך agarose לפני תהליכי הטמעת התייבשות שרף. שיטה זו אשכולות התאים יחד ומאפשר ניתוח יעיל של ultrastructure וארגון subcellular של תאי גזע hematopoietic (מזוהה לין - SCA-1 + c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC), 0.2 נדיר - האוכלוסייה 0.5% התא במח העצם. פרו ניסיוני זהtocol יכול להיות שימושי כדי לבצע מחקרים אולטרה-מבניים להשיג תוצאות כמותיות על אוכלוסיות נדירות רבות אבל מאוד חשובות.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>CAUTION רעיל בשאיפה, מגע בעור. ללבוש כפפות, להשתמש במכסה המנוע.</td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד 70%</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> מימית של סולן מדעי <td>16350</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל בשאיפה, מגע עם העור. ללבוש כפפות, להשתמש במכסה המנוע.</td></tr><tr><td>מאגר קקודידאט&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>12300</td><td>הכינו 0.1 מ' מאגר קקודילדאט (pH 7.4) במים מזוקקים, אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס <חזק>זהירות</חזק> מגרה בשאיפה או במגע עם העור, ללבוש כפפות ולעבוד במכסה אדים.</td></tr><tr><td>אוונס בלו&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 גרם ב 50 מ"ל של 0.1 M cacodyladate buffer להכנת 2% OsO4 מלאי, <חזק>זהירות</חזק> רעיל מאוד בשאיפה או במגע עם העור, מחמצן חזק, ללבוש ביגוד מגן, הגנה על העיניים, להשתמש במכסה אדים.</td></tr><tr><td>ערכות הטמעה LX-112 (LADD&reg;)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (דודצ'נילסוקסיניק אנהידריד)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>מערבבים 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 יחד ולאחר מכן מוסיפים 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)LADD</td><td></td> <td>21350</td><td></td></tr><tr><td>שרפי אפוקסי Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל בשאיפה, במגע עם העור. ללבוש כפפות, ביגוד מגן, להשתמש במכסה אדים.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds עופרת ציטראט (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td> <td><חזק>זהירות</חזק> רעיל בשאיפה, יש להימנע ממגע עם העור או העיניים.</td></tr><tr><td>אורניל אצטט (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td><חזק>זהירות</חזק> רעיל בשאיפה, יש להימנע ממגע עם העור או העיניים.</td></tr><tr>הרכב <td>המדיום של Dulbecco (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td> של Iscove<td>: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. לפרטים https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>תבנית קצה פירמידה&nbsp;</td><td>טד פלה</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>צילינדרים הרכבה</td><td>טד פלה</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-מיקרוטום&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 רשתות רשת (nikil)</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>היטאצ'י דגם H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מנוע לכידת תמונות</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ פלסטיק פטרי צלחות</td><td>פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מהיר בונד סופר דבק ציאנואקרילט&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>סכיני</td><td></td><td></td><td></td>גילוח</tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ מזכוכית&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי</td><td></td><td></td><td></td>ריסים</tr><tr><td>הכלי לולאת מתכת&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח tem

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) ניתן פרטים על ארגון ultrastructure הסלולר. עם זאת, ניתוח TEM של אוכלוסיות תאים נדירות, במיוחד התאים בתרחיף כמו בתאי גזע hematopoietic (HSCs), נשאר מוגבל בשל הדרישה של מספר תאים גבוה במהלך הכנת המדגם. ישנן כמה גישות cytospin או בשכבה לניתוח TEM ממדגמים נדירים, אבל הגישות האלה לא מצליחות לקבל נתונים כמותיים משמעותיים מהמספר המצומצם של תאים. הנה, גישה חלופית ורומן להכנת מדגם במחקרי TEM מתוארת על אוכלוסיות תאים נדירות המאפשרות ניתוח כמוני. מספר תאים נמוך יחסית, כלומר, 10,000 HSCs, שימש בהצלחה לניתוח TEM לעומת מיליוני תאים המשמשים בדרך כלל ללימודי TEM. בפרט, מכתים אוונס הכחול בוצע לאחר paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) קיבעון לדמיין את pel התא הזעירבואו, אשר הקלו מוטבע agarose. אשכולות של תאים רבים נצפו בסעיפים דקים. היו תאי מורפולוגיה השתמרה היטב, ואת הפרטים אולטרה-המבניים של המיטוכונדריה המורכב וכמה Golgi נראו. פרוטוקול יעיל, קל לשחזור זו מאפשר הכנת מדגם ממספר תא נמוך וניתן להשתמש בו לצורך ניתוח TEM איכותי וכמותיים על אוכלוסיות תאים נדירות מ דגימות ביולוגיות מוגבלות.

פרוטוקול יעיל ועקבי להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM ממספר נמוך של תאים מתואר. מכתים שלאחר קיבוע עם אוונס כחול העברת התאים צינור 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge עזר להמחיש את התא גלולה זעירה 7. Osmification עם אוסמיום ארבע-חמצני ב agarose הביא לגילוי קל של התא גלולה כהה במהלך התייבשות והטבעה. חלקים חצי דקה מהבלוקים המכילים תא גלול זעיר אשרו מקבץ ש...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת דגימות עם מספרי תאים נמוכים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין דגימות עם מספר תאים נמוך לצורך ביצוע אנליזת TEM באופן יעיל וניתן לשחזור. שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת כל המבנים של תאים חיים ובקבלת הגדרות פיזיולוגיות טובות יותר בתחום הביו-רפואי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להפיק תוצאות איכותניות וכמותיות ממספר תאים נמוך באופן הניתן לשחזור.בתחילה, השתמש ב-FACS כדי למיין 10,000 תאי גזע המטופואטיים (HSCs) אל תוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL, המכילה 600 µL של מצע Dulbecco המודגם ב-isocoves עם 10% FBS. באמצעות צנטריפוגה עם סלי דליים (swing-out buckets), סבב את ה-HSCs הממויינים ב-1,000 ×g למשך 10 דקות.השתמשו בשאיבה עדינה להסרת כל המצע למעט 200 µL. כדי לקבע את התאים, הוסיפו 0.2 mL של תמיסת קיבוע ריכוז 2X שהוכנה טרי, והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 600 µL של בופר קקודילאט (cacodylate) בריכוז 0.1 M כדי לשטוף את התאים.סבבו את התאים שוב בצנטריפוגה, הפעם בטמפרטורה של 30 °C. לאחר הסבב, הסירו את כל הבאפר למעט 200 µL, והוסיפו 200 µL של evans blue בריכוז של 2 mg/mL בבאפר קקודילאט, והדגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לצביעת התאים. השתמשו ב-600 µL של באפר קקודילאט 0.1 M כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים.לאחר מכן, השביה מחדש את התאים ב-200 µL שנותרו מהבופר לפני העברת תרחיף התאים למבחנה של 0.5 mL. בשלב זה, המשקע צריך להיות גלוי במבחנה. באמצעות צנטריפוגת שולחנית, סובב את התאים ב-1,000 ×g למשך 10 דקות.לאחר מכן, הסירו בעדינות את התמיכה (buffer) מבלי להפריע למשקע התאים הקטן הנראה כעת, כך שיישארו 50 µL של buffer בפרוטובולה. הכינו תמיסת agarose בריכוז 4%, על ידי הוספה של 200 mg של low melting agarose לחמישה מיליליטר של 0.1 M cacodylate buffer בתוך פרוטובולה של 15 mL. המיסו את ה-agarose על ידי העברת הפרוטובולה למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית של 100 mL.הוסיפו 200 µL של תמיסת האגרוז למבחנה המכילה את תרחיף התאים. צנטריפוגו מיד ב-1,000 ×g, ובטמפרטורה של 30 °C למשך 10 דקות. לאחר וידוא שהתאים שקעו אל תוך האגרוז החצי-מוצק בתחתית המבחנה, העבירו את המבחנה מיד לטמפרטורה של 4 °C, או לקרח, למשך 20 דקות כדי להקריש את האגרוז.באמצעות מחט בכילוי (gauge) 27, העבירו בזהירות את האגרוז המוצק, המכיל את משקע התאים, לפטריה מפלסטיק בנפח 35 mL המכילה בופר קקודילט (cacodylate buffer) בריכוז 0.1 molar. בעזרת סקלפל, גזמו את האגרוז המוצק המכיל את משקע התאים ליחידה אחת בגודל של כ-1 עד 2 מילימטרים. לאחר מכן, העבירו אותה לפרוטוקול של מבנה חדש בנפח 1.5 mL.הוסיפו 600 מיקרוליטר של בופר קקודילט (cacodylate) בריכוז 0.1 מולרי ושטפו את משקע התאים באגרוז על ידי הוספה והוצאה של הבופר באמצעות פיפטה. הסירו את הבופר ממשקע התאים ובתוך מ hút (מנדף), תוך לבישת ביגוד מגן וכפפות, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת אוסמיום טטרתוקסיד (osmium tetroxide) בריכוז 1%. דגרו את משקע התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.לאחר הדגירה, שטפו את הדגימה שלוש פעמים. העבירו אותה לבקבוק סנצילציה מזכוכית בנפח 20 mL עם פקק. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לדגימה באמצעות סדרת אתנול.לאחר מכן, בצעו חדירה (infiltrate) של הדגימה בריכוזים עולים של שרף LX 112 באתנול, לפני דגירה בשרף בריכוז 100% פעמיים למשך 60 דקות בכל פעם. באמצעות פינצטה, העבירו בזהירות את הדגימה לתחתית תבנית גומי בצורת קצה פירמידה, והוסיפו שרף טהור מעל הדגימה כדי למלא את התבנית. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 60 °C למשך 72 שעות כדי לפולימריז את השרף.כאשר השרף פולימרי, הוציאו אותו מהתבניות על ידי סיבוב תבנית הגומי. צבר תאים שחור וקטן אמור להיות נראה בתוך פירמידת השרף הפולימרי. השתמשו בציאנואקרילט כדי להצמיד את פירמידת השרף הפולימרי לגליל הרכבה לצורך חיתוך בחתכים.לאחר קיבוע הבלוק לאולטרה-מיקרוטום, השתמשו בסכין גילוח ובסכין יהלום כדי לקלף את בלוק הפירמידה, כך שייווצר צורה טרפזית קצרה ורחבה, כאשר החלק העליון והתחתון של הבלוק מקבילים זה לזה והדפנות בזווית אחידה. לאחר מכן, השתמשו בסכין היהלום כדי לקלף את הבלוק מסביב למשקע התאים ולהסיר את חלקי הפלסטיק שסביב פיסת האגרוז של משקע התאים. בעזרת האולטרה-מיקרוטום, חתכו פרוסות בעובי של one micrometer והשתמשו בכלי ריסים ובלולאת מתכת כדי להעביר את הפרוסות מאמבט המים לעשמזית זכוכית.לאחר מכן, הניחו את השקופיות על פלטה חמה בטמפרטורה של 37 °C לייבוש. באמצעות מזרק בעל מסנן של 0.22 µm, הוסיפו טיפה של תמיסת teluatine blue לסנחים והדגירה למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות במים מזוקקים והניחו לסנחים להתייבש.לאחר הייבוש, יש לבחון את החתכים תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות את מיקומם של התאים. לאחר מכן, השתמשו בסכין יהלום כדי לחתוך חתכים דקים במיוחד. לאחר מכן, בעזרת כלי ריסים, העבירו שניים עד שלושה חתכים מסירת המים אל רשתות בעובי 200 mesh והניחו אותם בתוך צלחת פטרי מזכוכית.העבירו את הצלחת עם הרשתות לפלטה מחממת בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות לייבוש החתכים. הוסיפו טיפות של 1% uranyl acetate, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לצביעת הרשתות. לאחר מכן, שטפו במים מזוקקים שש עד שמונה פעמים.צבעו ב-Reynolds lead citrate בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני שטיפה של שש עד שמונה פעמים. העבירו את צלחת הפטרי מזכוכית המכילה את הרשתות ללוח חימום ב-37 °C כדי לייבש את החתכים. לבסוף, נתוחו את החתכים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ב-87 kV.מוצגים כאן בהגדלה נמוכה חתכים חצי-דקים שצבעו בטולואידין כחול מתוך בלוקים המכילים משק תאי זעיר, המאשרים קיום של צביר תאים. תמונה זו בהגדלה גבוהה יותר מראה את המורפולוגיה השלמה של התאים. דמות זו מייצגת שדה מבט כללי של צביר התאים מתוך חתכים דקים מאוד שצבעו ב-uranyl acetate וב-lead citrate ונאחרו באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית.כאן מוצג תא HSC בודד, המראה כי המורפולוגיה והמבנה העל של התאים נשמרו היטב. מיקרוגרף אלקטרוני מפורט מאוד של HSC בודד בהגדלה גבוהה יותר מציג את המבנים העל התוך-תאיים. בנוסף, תמונות בהגדלה גבוהה תפסו את המבנה והשלמות שנשמרו היטב של אברונים תת-תאיים כגון מיטוכונדריה.לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה בחמש עד שש שעות; עבור צביעה כחולה מתקדמת וקיבוע בג'ל אגרוז, עיבוד TEM רגיל יארך חמישה עד שישה ימים אם הוא יבוצע כראוי. לכן, לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות מהכנה של תאים חיים לצורך אנליזת TEM.

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להכין תאי יונקים לניתוח פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות ספקטרומטריית מסה באמצעות ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית, עם אפשרויות לפיפטציה ידנית ואוטומטית כאחד.

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לניתוק מהיר של דגימות גידולים אנושיים ועכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי.

דיסוציאציה של דגימות רקמת גידול בבני אדם ובעכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי

פרוטוקול זה מציג שיטה מעשית המשתמשת ב-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק התייחסות לחוקרים להבהיר ביעילות מבנים מקרומולקולריים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM).

אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים חד-תאיים באמצעות אסטרטגיית תיוג איזוטופי דו-פלקס ועיכול ArgC. תהליך עבודה זה מאפשר פרופילינג כמותי, שכפול ורגיש מאוד של הטרוגניות כרומטין ותגובות אפיגנטיות ברזולוציה של תא יחיד.

הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)

למדו שיטה יעילה להכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM). הפרוטוקול מדגים עיבוד תאי גזע המטופואטיים לקבלת תוצאות איכותיות וכמותיות אמינות במחקר ביולוגי.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

גלה סרטונים נוספים