Name: ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: חקור גנומיקה פונקציונלית באמצעות מסך siRNA כדי לזהות מטרות תרופה חדשות בספירואידים של תאי סרטן. שיטה זו מאפשרת הערכת גנים בדגם תלת-ממדי המחקה את הסביבה הגידולית של הגידול בגוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפרדריק וולברג (FACS ומתקן הדמיה, ICR) על הסיוע במיקרוסקופיה. עבודה זו מומנה על ידי Breast Cancer Now. RN היא זוכת מלגת פיתוח קריירה של סרטן השד עכשיו (2011MaySF01).

1. הכנת צלחות siRNA 96-היטב הערה: השוליים החיצוניים של צלחת 96-גם נוטים יותר אידוי לעומת בארות אחרות, ובכך להגביל את כמות siRNAs 60 לכל 96-גם צלחת. מלאו בארות חיצוניות עם מדיום רגיל או PBS להגביל זה. בנוסף, מסך אימות של להיטים מומלץ להקל הטיות צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את siRNAs 250 - 500 ng / μL במדיום סרום מופחת (לפי המלצות יצרן) ו aliquot 10 μL על הבארות המתאימות צלחת המצורף אולטרה-הנמוך. בצע את כל המסכים בשלושה עותקים. הערה: שלב המתאים ללא מיקוד (שלילי) והרג (חיובי, כגון UBB ו PLK1) שולטת siRNA בעיצוב הצלחת על מנת להבטיח יעילות transfection ניתן להעריך. שימוש צלחות נמוכה התקשרות עבור עבודת siRNA הוא קריטי, כמו תאים יתווספו לתערובת transfection. אנחנו לא יכולים לשלול כי חלק מהיצרנים מצורף אולטרה-נמוכהצלחות יכולות להיות השפעות עדינות על צמיחה אליפטית. וככזה אנו ממליצים אלה נבדקים על ידי משתמש הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטמים עם חותמות ולאחסן דבק ב -20 ° C. </li></ol> 2. Transfection ההפוך של שורת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של המסך, להפשיר את הצלחות בטמפרטורת החדר ומסובב למשך 5 דקות XG ב 1000 באמצעות צנטריפוגות הספסל העליון. הוסף 10 μL של מדיום סרום מופחת המכילים את מגיב transfection אופטימיזציה היטב כל באמצעות פיפטה רבה. השאירו צלחות במשך 15 דקות עבור מתחמי transfection המכילים siRNA להיווצר. הערה: מחקר זה נצל את סרטן שד תא קו BT474 להקרנה גנומית תפקודית (בתרבית DMEM גלוקוז גבוהה (בינוני הנשר השונה של Dulbecco) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS) ואנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize את התאים שיוקרנו (טריפסין 0.05% ו 0.53 mM EDTA) עד שניתקו מהבקבוק, לנטרל באמצעות נפח מתאים של specif שורת תאיםic בינוני ספין במשך 5 דקות XG ב 1000 על צנטריפוגות ספסל עליונים להסיר טריפסין. Resuspend התאים עם נפח מתאים של המדיום ולקבוע מספר הסלולרי מדויק באמצעות מונה תא. הערה: בדרך כלל 5,000 תאים לכל טוב מספיקים להיווצרות אליפטית על פני רוב שורות תאים הנבדקות. חשוב לספור את התאים במדויק כמו השעית תא בודדת להשוואות גודל מדויקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאי 5,000 תאים לכל 180 μL במדיום קר (4 ° C). הערה: התוספת של רכיבי מטריצת קרום במרתף מחדש תשפיע באופן שלילי יעילות transfection ומומלץ כי הוא אינו בשימוש. אופטימיזציה הקו הסלולרית כדי לאשר קיבולת ויוצרי אליפטית ויעילות מציאה צריכה להתבצע לפני המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השעית התא למאגר, pipet לערבב ולהוסיף 180 μL היטב כל הצלחת המצורפת אולטרה-נמוך 96-היטב המכילה את siRNA שהוכן קודם לכן (2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugדואר הצלחת XG ב 1000 בצנטריפוגה 4 ° C precooled למשך 10 דקות ולאחר מכן לחזור חממה בתרבית רקמה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: התאים יופיעו כמו פסיפס בתחתית הבארות. במהלך 12 הבאות - 24 השעות התאים המצרפי יהיו ביחד כדי ליצור כדור בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להתבונן התאים יוצרים אליפטית יחיד במרכז הבאר. הוספת 100 μL של בינוני מלא כל טוב כדי לעודד את הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדש בינוני לאחר שלושה ימים. הוצא בעדינות 100 μL של המדיום מבאר כל ולהוסיף 100 μL של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, לכמת את גודל אליפטית האוטומטית על קורא צלחת שיכולה לפקח צמיחת אליפטית כמותית לאורך זמן (ראה סעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לקבוע כדאיות התא באמצעות צבע כדאיות התא זורח (ראה סעיף 4). </li></ol> 3. תמונה אוטומטית רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הצלחות על הדמיה צלחת הספסל העליון, מיקרו-היטב cytometer ביום 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; פתח את התוכנה, בחר את האפשרויות הבאות: צלחת &quot;טוב -96 &#39;, בחר את סוג הצלחת המתאים וזן שם ניסוי. הערה: כל מידע נוסף ניתן גם להוסיף לתוך התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום &#39;Tumorsphere&#39;. לשנות את המיקוד כך אליפטית בפוקוס יש ניגודיות אופטימלית. הערה: אנו ממליצים על דימוי מבוסס מיקוד &quot;כמו וריאציות משמעותיות בגדלים אליפטית צפויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הבארות הדורשות סריקה &#39;סריקה התחל &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת סורק הצלחת, להבטיח כי מסכת האובייקט מייצגת את הגודל אליפטית במדויק. עושים זאת על ידי התאמת קוטר המושבה, התרחבות הגבול, הגדרות עובי ודיוק מינימום, באופן ספציפי עבור כל שורת תאים נבדק 11,12. הערה: אזור אליפטית אז יחושב באמצעות אלגוריתם תוכנה. לדוגמה, כדי לחשב את השטח במדויק spheroids BT474 גדל במשך שבעה ימים להתאים דיוק ל &#39;גבוהה&#39;ד להגדיר את קוטר מושבת מינימום 200 מיקרומטר. פעולה זו אמורה לייצר נציג מסכה אליפטית מתאים של אזור אליפטית. הערה: נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא מהמכונה, באמצעות פונקציית היצוא, בשינה בצורת קובץ נתונים מבואר. תאריך הוא צלחת החציוני מנורמלת, בשילוב ונותח באמצעות כשל או הבדל סטנדרטי ממוצע לחלוטין (SSMD) לזהות siRNAs אשר השפיע באופן מובהק סטטיסטי על אזור אליפטית. </li></ol></li></ol> 4. קביעת כדאיות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר באזור אליפטית חושב, לקבוע את הכדאיות באמצעות צבע תא כדאיות זורח. כן מגיב בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות 100 μL של המדיום מבאר כל ולהוסיף 100 μL של צבע הכדאיות. דגירת צלחות במשך 15 דקות ולאחר מכן סרוקות באמצעות קורא צלחת זורח. הערה: נתונים אלה לאחר מכן ניתן לייצא מהמכונה, באמצעות פונקציית היצוא, ב בבצורת קובץ נתונים מבואר. תאריך הוא צלחת החציוני מנורמלת, בשילוב ונותח באמצעות כשל או הבדל סטנדרטי ממוצע לחלוטין (SSMD) לזהות siRNAs אשר השפיע באופן מובהק סטטיסטי על כדאיות אליפטית. </li></ol>

<ol><li>Seton-Rogers, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+the+ErbB2+receptor+and+transforming+growth+factor+beta+in+induction+of+migration+and+invasion+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Chia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+a+novel+hypoxia-regulated+marker%2C+carbonic+anhydrase+IX%2C+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma.</a> J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).</li>
<li>Trastour, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1alpha+and+CA+IX+staining+in+invasive+breast+carcinomas%3A+prognosis+and+treatment+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome.</a> Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).</li>
<li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).</li>
<li>Ros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+metabolic+screen+identifies+6-phosphofructo-2-kinase%2Ffructose-2%2C6-biphosphatase+4+as+an+important+regulator+of+prostate+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival.</a> Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).</li>
<li>Baenke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+MCT4+as+a+key+regulator+of+breast+cancer+cell+metabolism+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival.</a> J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).</li>
<li>Schug, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-CoA+synthetase+2+promotes+acetate+utilization+and+maintains+cancer+cell+growth+under+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress.</a> Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).</li>
<li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+is+a+bioenergetic+substrate+for+human+glioblastoma+and+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases.</a> Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).</li>
<li>Comerford, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+dependence+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetate dependence of tumors.</a> Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+tumor+spheroid+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686(2015).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).</li>
<li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li>
<li>Maguire, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SF3B1+mutations+constitute+a+novel+therapeutic+target+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer.</a> J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).</li>
<li>Brough, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+viability+profiles+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Functional viability profiles of breast cancer.</a> Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).</li>
<li>Ferber, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO3a+regulates+reactive+oxygen+metabolism+by+inhibiting+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression.</a> Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).</li>
<li>Jensen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO3A+promotes+metabolic+adaptation+to+hypoxia+by+antagonizing+Myc+function%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function.</a> EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).</li>
<li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li>
<li>Bitler, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethality+by+targeting+EZH2+methyltransferase+activity+in+ARID1A-mutated+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers.</a> Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).</li>
</ol>

עמלות הגישה הפתוחה נתמכו על ידי Nexcelom Bioscience, LLC.

תלת ממד דגמים של הסרטן שמתבצעים מועסקים ויותר להעריך את היעילות של תרכובות ידועות רומן אשר עוצבו להרוג באופן סלקטיבי תאי סרטן. Spheroids תאים סרטניים הם מבנים המציגים תנאים נוספים הדומים לאלה נתקל בגידולים in vivo, ובכך תרכובות גדלו יעילות 3D נוטים יותר להיות השפעה in vivo. עם זאת, שיטות אלו אינן מאפשרות זיהוי של מטרות רומן פוטנציאל שלא היו הנושא תכנון תרופות, שיכולה להיות להם יעילות רבה בטיפול בסרטן. פיתחנו גישה גנומיקה תפקודית siRNA שאיפשרו להשתקת גנים עמיד למשך עד שבעה ימים spheroids קו תאים סרטניים. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול הדורשים ייעול לפני מסך siRNA יכול להתבצע. היכולת ליצור spheroids קיימא לשחזור בקנה מידה גדול היא חיונית. יתר על כן,תנאי transfection ppropriate צריכים להיות מותאמים בקפידה. אנו ממליצים trialing מספר ריאגנטים transfection שונים עם זכויות שאינן מקנות מיקוד המתאים והרג שולטת לפני שתנסה המסך. הצלחנו להראות כי שורות תאים סרטניים כמה נפוץ השד, כלומר BT474, MCF10DCIS.com, מד&quot;א- MB-231 ו JIMT1 היו מקובל transfection siRNA. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתונים ההקרנה 200 ביותר גנים שעברו מוטציה לעתים קרובות סרטן השד spheroids BT474, אישר את תלותם הגברה של HER2 מוטציה בשעור של PIK3CA. מעניין, השתקה של FOXO3 גורם שעתוק הביא לירידה בגודל אליפטית אך ללא השפעה משמעותית על כדאיות. FOXO3 ידוע להסדיר את התגובה היפוקסיה, לשנות את קיבולת המטבולית של תאי סרטן ומאפשר להם להסתגל ביתר קלות לסביבתם 16. תפקיד זה באופן פוטנציאלי יכול מפריעים לקריאת כדאיות התא כפי שהוא מזהה שפע ATP, אחד המוצרים העיקריים של חילוף חומרים בתא. בתמיכה של התצפית של צמצום גודל אליפטית, הוכיח כי השתקת FOXO3 ב הלה xenografts לקוי צמיחת גידול לאפופטוזיס 17. חשוב לציין כי חלק גנים עשויים להשפיע לרעה על יכולתו של תאים סרטניים שומרת על ארכיטקטורת 3D שלהם, אשר עלול לגרום חיוביות שגויות. לדוגמא, מציאה של E-cadherin הביאה לפירוק המבנה אליפטית BT474. זה בעבר דיווח באמצעות E-cadherin ממוקד נוגדנים 18. כמו עם כל פלטפורמת הקרנה, מטרות פוטנציאליות, יש rescreened להעריך את השחזור של האפקט שנצפה. ישנן מגבלות על הטכניקה, כלומר האופי הזמני של מציאת הגן בתיווך siRNA. מתמשכת השתקה יותר משבעה ימים לא היה בר השגה עם siRNA. היתרון של גישה זו הוא כי זה יכול להיות בשילוב עם סביבה אקולוגית שונה אחרתצבעי tric ולא רק במקומות להעריך כדאיות אליפטית, למשל, מתן מידע מרחבים של היפוקסיה אליפטית או ניטור תאים העוברים אפופטוזיס. יותר מכך, כיוון הסריקות קוראות צלחת יחסי מהירות ולא פולשנית, ההשפעה של siRNAs על גודל אליפטית ניתן להעריך לאורך זמן ולא רק בנקודת הסיום הניסיונית. ואכן, אנו בוחנים בימים אלה כמה אפיקים אלה נמצאים בצנרת ההקרנה שלנו. גישה חלופית אשר מנצלת תרבויות 3D לזהות תלות רומן היא השימוש בספריות כימיות המעכבות או מגוון רחב של מטרות או משפחות מסוימות של חלבונים. ואכן, Bitler et al. מנוצל גישה ממוקדת זו כדי לזהות את האינטראקציה הקטלנית הסינטתית בין מעמד ARID1A ומעכבי EZH2 ב קרצינומה תאים הברורה השחלות 19. התגלית של עריכת טכנולוגיה גנים CRISPR-Cas9 אפשרה גם לפיתוח מסכי גנטי בתרבויות organoid in vivo. עם זאת, לאגישתו תלויה שיש מתקני חיה מתאימים וניתן לעלות 20 מונע. לסיכום, אנו מאמינים כי גבשנו פרוטוקול בצורה מדויקת יותר מודלים הדרגתי חמצן וחומרי הזנה, שהן תכונות של microenvironment גידול in vivo, המאפשרות זיהוי של מטרות סרטן רומן או אימות חזקות של יעדים שנקבעו. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על כל סוג של שורת התאים המהווה spheroids ומכאן ניתן להשתמש באופן שגרתי דעה בקהילת חקר הסרטן למסכי siRNA תפוקה גבוהה.

גידולים מוצקים להציג היסטולוגית משמעותית, גנטי מייקרו-סביבתי ההטרוגניות תוך-גידול, המציג קלינאים עם אתגר משמעותי יכולת לטפל בחולים בהצלחה. רוב המודלים המשמשים לזהות רומן ממוקד טיפולים לא לשלב רב של תכונות אלה. אכן, טיפולים ממוקדים נוכחיים מנוצלים במרפאת פותחו בעשור האחרון העסיקו גישות הקרנה המסתמכות על שורות תאי הסרטן גדלות תחת דו ממדים (2D) תנאי תרבות. אמנם זה הביא הצלחות שונות, כגון מעכבי טירוזין קינאז קולטן, מתחוור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ו להגדיל את מספר טיפולים חדשים שהופכים את המעבר מודלים פרה-קליניים ניסויים קליניים. יתר על כן, הוא מעריך כעת גם כי מערכות תרבות 2D מצליחות לשקףvivo התנהגות 1,2. לדוגמא, בגידולי vascularized גרועים, שכן ביקוש חמצן וחומרים מזינים במייקרו-הסביבה להצליח לספק, אזורים של משלוחים גבוהים ונמוכים לפתח. בנוכחות חמצן נמוך (היפוקסיה) אל תוך גידולים, כפי שזוהה על ידי מכתים immunohistochemical סעיפי גידול סמנים היפוקסי ותיקים כגון anhydrase פחמתית IX (קיי), עולה בקנה אחד עם תוצאות קליניות עניות בסרטן השד 3,4 תכונות שילוב לפיכך כגון היפוקסיה לתוך מודלי הקרנה עשויה לשפר את היכולת שלנו לגלות מטרות תרופה חדשניות כי תהיינה יעיל יותר in vivo. ואכן, בהצלחה מיקוד גידולים אגרסיביים המכילים היפוקסיה היא בעדיפות קלינית 5. שינוי של ההקרנה המסורתית 2D siRNA, בניסיון ליתר דיוק לשחזר אלמנטים של התנאים בהם נתקלים תאים סרטניים במיקרו-סביבה של הגידול, הוביל לזיהוי של מספר גנים הבבית כבר נמצא כחשוב לצמיחת גידול in vivo. אלה כוללים מסכי גנומית תפקודיים להתבצע בתנאים בסרום נמוכים 6, תנאי חוסר חמצן 7 ו בשילוב 8. לדוגמה, השתקת 6-Phosphofructo-2-קינאז / פרוקטוז-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), חלבון האחראי על ויסות הגליקוליזה הזנת פחמן, רק לאפופטוזיס בקווים סרטן הערמונית נגזר גרורות כאשר גדל בסרום נמוך. השתקת PFKFB4 בשורות תאי ערמונית נורמליות באותם תנאים לא הייתה השפעה, ואילו, דלדול של PFKFB4 לחלוטין ablated הצמיחה של שורת תאי סרטן ערמונית xenografts 6. בהרכב מורחב של שורות תאי סרטן השד, השתקת טרנספורטר מונה-carboxylase 4 (MCT4) הובילה מועדף להפחתת צמיחת שורת תאים בתנאים של רמות חמצן נמוכים. פגיעות זו קיבלה תוקף in vivo ב xenogra orthotropic קו תאי סרטן השדFTS. אולי הכי בולט, השתקה של synthetase Acetyl-CoA 2 (ACSS2), אנזים האחראי על ההפיכה תצטט לתוך אצטיל-CoA, מספר תאי סרטן מופחת בתנאי קיצון מזין (חמצן נמוך בדם) אבל היה מעט או ללא השפעה בתנאי תרבות הנורמליות 8. אבלציה של ACSS2 השפיעו על הצמיחה של xenografts סרטן השד והערמונית דבר המצביע על כך שהפרשי מזין אינם קיימים בבידוד במיקרו-סביבה של הגידול וכי תאים הנמצאים באזורים אלו חיוניים התקדמות הגידול 8. יתר על כן, ACSS2 נמצאה גם להיות חשוב גליובלסטומה קרצינומה hepatocellular 9,10, דבר המצביע על כך פעילות ACSS2 מוגברת בגידולים יכול להיות מנגנון יסודי התומכת בצמיחה בתנאים נחותים. ככלל, מחקרים אלה מוכיחים כי משחזרת התנאים נתקלו in vivo וביצוע מסכי siRNA מאפשרת זיהוי של gEnes חיונית להישרדות סרטן. כמו גם להשפיע על גדילת תאים סרטניים 2D בתנאי קיצון מזין, דלדול של גני מטרה במחקרים אלה מעכבות צמיחה אליפטית קו תאים סרטניים, שיקוף מה נצפתה xenografts הגידול 6,8. לפיכך, spheroids קו תאים סרטניים מכילים כמה מן התנאים נתקל במיקרו-סביבה של הגידול המקנים רגישות השתקה ACSS2. ואכן, spheroids להציג הדרגתיים מזינים (סרום וחמצן), שינויים ב- pH, תלת ממדי (3D) קשר בין תאים, אלא גם, שינויי חישת שגשוג עם תאים שעברו עיכוב מחזור תא אפופטוזיס. זה בא לידי ביטוי על ידי נוכחות spheroids סרטן של אזורים נמקי, תכונה לא נמצא בתרבות 2D המסורתית. spheroids תאים סרטניים כבר שימשו מודלים רלוונטיים יותר ביולוגית להקרין מעכבי מולקולה קטנה אבל זה מאפשר רק עבור אימות של יעילות מתחם או repurposing של רכיבי מדיהunds במקור לעצב עבור מחלות אחרות 11. שיטות הקרנה אליפטית נוכחיות אינן מאפשרות הניתוח של דלדול גן ספציפי בתוך תפוקה גבוהה של אופן גבוה תוכן. כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, צינור גנומיקה תפקודית לחשיפת תלות גן ספציפי ניצול RNA התערבות קטנה (siRNA) הטכנולוגיה spheroids קו תאים סרטניים. עצבנו ספרייה העידה עם siRNAs מיקוד 200 הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר של סרטן השד אנושי הערכתי את ההשפעה של דלדול גן על גודל אליפטית ופעילות מטבולית spheroids סרטן שד BT474. הצלחנו וחסונה ו reproducibly לזהות את ההשפעה של ERBB2 ו PIK3CA השתקה בתרבויות 3D. יתר על כן, אנחנו יכולים להעריך את ההשפעה של דלדול הגן על ארכיטקטורת מרחבית של spheroids BT474 באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

<table><tbody><tr><td>שיר ערש-</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&nbsp;</td><td>מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>מגיב טרנספקציה פולימרי דמוי וירוס</td></tr><tr><td>צלחת חיבור נמוכה במיוחד</td><td>קורנינג</td><td></td><td>CLS7007 96</td></tr><tr><td>צלחת נייר כסף אטמי צלחת</td><td>נייר כסף ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>צבע כדאיות תאים זוהר</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>טיפים פיפטה (200 & #956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה (10 ו-#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה (1,000 ו-#956; L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות (5 מ"ל)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות (25 מ"ל)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר פטה</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>ספרייה נבחרת ספריית</td><td></td></tr> רוזנת <tr><td>תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td></td><td>חברת</td><td></td>קשר Nexcelom</tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>חברת</td><td></td>קשר</tr><tr><td>Benchtop צנטריפוגה</td><td>שונות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך</td><td>Zeiss</td><td>חברת</td><td></td>קשר</tr><tr><td>תרבית רקמות CO2; חממה</td><td>מגוונת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה מרובת ערוצים</td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניצול הקרנת genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

זיהוי של אירועי נהג תפקודיים בסרטן הוא מרכזי בקידום ההבנה שלנו של ביולוגית הסרטן והכרחי על הגילוי של הדור הבא של מטרות תרופה חדשניות. זה נהיה ברור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ולהגדיל את היעילות של טיפולים חדשניים שהופכים את המעבר ממודלים טרום קליניים ניסויים קליניים. כאן אנו מציגים מתודולוגיה להפקה spheroids גידול אחיד לשחזור שניתן נתון ההקרנה פונקציונלית siRNA. spheroids אלה מפגינים מאפיינים רבים הנמצאים בגידולים מוצקים שאינם נוכחים בתרבות דו מימד המסורתית. אנו מראים כי שורות תאים כמה נפוץ סרטן השד ניתן בפרוטוקול זה. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתוני ניצול BT474 שורת תאי סרטן השד, מאשר שלהםהתלות הגברה של הקולטן לגורם הצמיחה אפידרמיס HER2 ו מוטציה של phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) כאשר גדל כמו spheroids הגידול. לבסוף, אנו מסוגלים לבדוק את העניין לעומק ולאשר את ההשפעה המרחבית של תלות אלה באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

מבחני אליפטית בהתקשרות אולטרה-נמוכה 96-גם הצלחות לספק הערכה פנוטיפי תפוקה גבוהה עבור oncogenicity פוטנציאל בהקשר זה יותר בקלות משחזר את התנאים הפיזיולוגיים נמצא בסרטן in vivo. אכן, שורות תאי הסרטן MCF10DCIS.com וצורת BT474 מבנים אליפטית חזקים (איור 1 א) וחקירת immunohistological סעיפים אליפטית הראו שינויים מובחנים במורפולוגיה הסלולר גרעינית. במשך הזמן, כמה spheroids כגון spheroids BT474 לפתח אזורים נמקי, תכונה משותפת של גידולים מוצקים אגרסיבי (איור 1B). Spheroids מסוימת אינה לפתח ליבות נימקים, כגון קו הסלולרי מד"א- MB-231, אבל לעשות תצוגת וריאציה מסומנת בסמן השגשוג Ki67, אשר ביחס הפוכים בקורלציה עם ביטוי caspsase -3 בקע, סמן של אפופטוזיס (איור 1 ג). כדי לקבוע כי שורות תאים מרובים הם אכן רג'פמגני אוזניים כדי BT474 להשתקת גנים בתיווך siRNA, MCF10DCIS.com, מד"א- MB-231 ותאי JIMT1 היו transfected הפוכה עם siRNA במשך שבעה ימים. הנוכחות של מגיב transfection (מדומה) או transfection של siRNAs מלאה לא הייתה השפעה על כדאיות אליפטית, תוך השתקה של הגן חיוני יוביקוויטין B (UBB) הכדאיות אליפטית הקטינה באופן משמעותי בכל שורות תאים שנבדקו (איור 1D). עצבנו ספריית siRNA אנושית שהקיפה את הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר שלא נבחר, ER +, HER2 + וסוגי סרטן שד שלילי לשלושה סמנים. ספריה זו כוללת גנים של פונקציה ידועה, כגון MYC, PIK3CA ו TP53 ואלה שתרומתם סרטן אינו מבוסס דיו. המסך כולל גם מספר siRNAs השליטה הלא מיקוד (בקרת # 1, בקרת # 2) ו siRNAs מיקוד גנים חיוניים, כגון PLK1 ו UBB, אשר פועלים כמו הרג שולטת (טבלה 1). בחרנו להשתמש canc השדאה שורות תאי BT474 כפי שהם יוצרים קושי spheroids ללא תוספת של קרום במרתף מחדש, מוקמות שורות תאי סוס עבודה ויש ארכיטקטורת גנומי ידועה. לדוגמא, תאי BT474 הם חיוביים עבור קולטן אסטרוגן (ER +), ביטוי היתר לקולטן גורם הגדילה באפידרמיס אדם 2 (HER2 +) ומוטציות נמל TP53 (E285K) ו PIK3CA (K111N) 13. העסקת הפרוטוקול שתואר לעיל, אנו פיקוח דלדול גן ההשפעה היה על גודל כדאיות אליפטית לאחר שבעה ימים של transfection ההפוכה siRNA (האיור 1E). מעניין לציין, כי רוב הגנים לא להיות השפעה מהותית על תחום אליפטית או כדאיות (איור 2 א). השתקת FOXO3, PIK3CA, ERBB2 ו SF3B1, הביא לקיטון לשחזור המשמעותי ביותר גודל אליפטית. הפחתה זו נצפתה גם כדאיות אליפטית לאחר השתקת ERBB2 ו SF3B1. בנימה מעודדת, אנו confirmed השפעת PIK3CA, ERBB2 ו SF3B1 השתקה על גודל אליפטית באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2 ב). כבר זיהינו SF3B1 כמו גן חיוני במודלים שורת תאים רבים ובכך siSF3B1 מייצג פקד הרג טוב בנוסף UBB 14. מעניין לציין, כי כל 200 גנים בלבד והשתקת E-cadherin הביאה לעלייה משמעותית הכדאיות אליפטית (איור 2 א). חקירת מורפולוגיה אליפטית הראתה כי E-cadherin השתקה הביאה פירוט מלא של אדריכלות אליפטית, עם תאי קיימא הנשענים על הקרקעית של הקובץ המצורף הנמוך היטב (איור 2 ב). reinvestigation הידני של נתוני מסך נפח אליפטית הראה כי גם זה נצפה אבל שנוטרל מן כימות באזור בשל חפץ להיות מעל מגבלות גודל סט. מודגש כמו בעבר, תאי BT474 overexpress טירוזין קינאז קולטן HER2 נמל מוטציה שבעור ב PIK3CA (K111N). אנו מאשרים כי השתקת ERBB2 ו PIK3CA הביאה כדאיות אליפטית מופחתת ואילו transfection עם פקדים ללא מיקוד לא הייתה השפעה (איור 2 ג). הבא חקרנו את ההשפעה של דלדול siRNA על היסטולוגיה אליפטית. spheroids BT474 היו transfected הפוכה עם siRNA השליטה הלא מיקוד siRNAs מיקוד PIK3CA, ERBB2 ו UBB. השתקת ERBB2 ו UBB הביאה לירידה של הסמן פרו-שגשוג Ki67 לעומת שליטת siRNA (איור 2 ד). ההפעלה של הסמן פרו-אפופטוטיים בקעה caspase-3 נצפה רק לאחר השתקת UBB, הדבר המצביע על דלדול של HER2 ו PIK3CA לא לגרום אפופטוזיס אבל היה cytostatic ולא ציטוטוקסיות. ואכן, השתקת HER2 ו PIK3CA לא לגרום לעלייה בביטוי חלבון של p27 חלבון מעצר התא מחזור לעומת שליטה spheroids transfected. אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "&gt; יחדיו, תוצאות אלה מראים כי תאי BT474 מונעים על ידי בשעור HER2 ו PIK3CA איתות כאשר גדל כמו spheroids 3D יתרה מכך, תוצאות אלו מראים כי אפשר. לתכנן וליישם ספריית הקרנת siRNA העידה של מאה גני spheroids קו תאים סרטניים וחסון ו reproducibly. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg"> איור 1: אופטימיזציה Cell קו לצמיחת 3 ממדים. א שורות תאי סרטן השד, MCF10DCIS.com ו BT474 היו בתרבית צלחות מצורפות נמוכות למשך 7 ימים. תמונות מייצגות Brightfield נלקחו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. ב MCF10DCIS.com ו spheroids BT474 היו בתרבית במשך 28 ימים. 100 μL של תקשורת הטריה היה מתחדש כל 3 - 4 ימים. Spheroids היה קבוע 3.8% פורמלדהיד, דוארmbedded, מחולק ומוכתמים hematoxylin ו eosin (H &amp; E). נציג תמונות מוצגות בהגדלה נמוכה וגבוהה. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר ו 33 מיקרומטר, בהתאמה. ג spheroids מד"א- MB-231 היו בתרבית במשך 21 ימים. 100 μL של תקשורת הטריה היה מתחדש כל 3 - 4 ימים. Spheroids תוקנו בפורמלין 3.8%, מוטבע, מחולק ומוכתם Ki67 ו ביקע caspase-3. נציג תמונות מוצגות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. ד BT474, MCF10DCIS.com, מד"א- MB-231, ו JIMT1 שורות תאים היו transfected הפוכות עם (מגיב transfection בלבד) המדומה ואת siRNAs המלא UBB, צלחות מצורפות נמוכות במיוחד היו הסתחררו יוצרי spheroids. בינוני טרי (100 μl) נוספה בימים 1 ו- 4. לאחר 7 ימים, כדאיות התא היה לכמת. נתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי עצמאי בוצע בשלושה עותקים המנורמלים לשלוט # 1. מובהקות סטטיסטיות חושבו באמצעות unpaסטודנטים IRED מבחן t (p &lt;0.05). א תרשים זרימה המסכם את פרוטוקול transfection הפוכה נהג לחקור תלות גן פונקציונלי spheroids קו תאים סרטניים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg"> איור 2: חקירת הגנום פונקציונלי של תלות בשעור חושף BT474 Spheroids. תאי א BT474 היו transfected הפוכות עם ספריית siRNA siGENOME אדם 200-גן בשלושה עותקים. גודל ואת הכדאיות אליפטית נצפו. ערכים נתונים גולמיים היו מנורמל ו- Z-score החציוני צלחת חושבו לזהות חריגות משמעותיות יותר מאשר 1.7x סטיית התקן של צלחת 15 החציוני. הערה גנים הפריפריה ERBB2, SF3B1, PLK1 ו UBBnd E-CAD. siRNAs כי גדל באופן משמעותי או מופחת באזור ואת כדאיות אליפטית מוצללות בצבעים כחול ואדום, שבו אדום מתאר את השליטה siRNA. תאים ב היו transfected הפוכות עם שליטה ללא מיקוד, E-cadherin (E-CAD), PIK3CA, ERBB2 או UBB siRNA ואז הסתובבו צלחת מצורפת נמוכה במיוחד כדי ליצור spheroids. לאחר 7 ימים, Brightfield תמונות אליפטית נציג נלקחו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. תאי ג היו transfected הפוכות עם ללא מיקוד שליטה, PIK3CA, ERBB2 או UBB siRNA ואז הסתובבו צלחת מצורפת נמוכה במיוחד כדי ליצור spheroids. לאחר 7 ימים, כדאיות התא היה לכמת. נתונים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי עצמאי בוצע בשלושה עותקים המנורמלים לשלוט # 1. המובהקות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן t-מזווג סטודנטים (p &lt;0.05). ד לאחר 7 ימים, spheroids שתוקן, מוטבע, מחולק ומוכתםעבור H &amp; E, Ki67, ביקע caspase-3, ו p27. נציג תמונות מוצגות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. הערה H &amp; E של spheroids siControl להיראות קטנות יותר עקב artefact של spheroids עיבוד הפרט ללא פגע שנבחר מכתים. עם זאת אין בכך כדי לגרוע מן השינויים שנצפו עם התמונות הסרוקות ותוצאות כדאי תא. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד 1 </td><td> TP53 </td><td> DST </td><td> KMT2C </td><td> מטופל 1 </td><td> FCGBP </td><td> ARID1B </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> ללא מיקוד 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> AHNAK </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> ITPR2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> apoB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> LAMA2 </td><td> אֵס </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PCLO </td><td> CACNA1B </td><td> ERBB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> SYNE1 </td><td> LYST </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> מטופל 2 </td><td> VHL </td><td> RYR1 </td><td> COL6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד 1 </td><td> ENAM </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> מטופל 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> סִי </td><td> ללא מיקוד 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RYR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> חוֹד </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> UBR5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td> PLK1 </td><td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> מטופל 2 </td><td> VHL </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד 1 </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> מטופל 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCOR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><t atr><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> "טש </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></t></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> כַּספּוֹמָט </td><td> LRP1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> SPEN </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> SCN2A </td><td> IPTR3 </td><td> ERBB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> CHD4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> EYS </td><td> שקי </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> מטופל 2 </td><t vhl><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></t></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ללא מיקוד </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> מטופל 1 </td><td> SDK1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> ללא מיקוד 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> ATRX </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> ITPR1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> Vcan </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> מטופל 2 </td><td> VHL </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1: פריסה פלייט ו- Human siRNA הספרייה דה-קונבולוציה. הטבלה מכילה את התוכן של כל ברכות siRNA והפריסה עבור הצלחות המצורפות הנמוכות המשמשות במסך.

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

מטרת פרוטוקול מסך siRNA זה היא לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על צמיחת ספרואידים בקו תאי סרטן. בהשוואה לטכניקות תרבית תאים דו-ממדיות מסורתיות, ספרואידים סרטניים מציגים תנאים דומים יותר לאלה שנתקלים בהם בגידולים in vivo. שיטה זו שימושית להערכה תפקודית של גנים המשתנים לעתים קרובות בסרטן אנושי, וחשוב מכך, ניתן להשתמש בה כדי לקבוע אילו גנים הם אונקוגנים פוטנציאליים או מדכאי גידול בתנאי תרבית מורכבים יותר, כמו זה שנראה בתרבית תלת מימדית, ובמיוחד תחת היפוקסיה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה בקלות כך שחוקרים יכולים להשתמש בה כדי לחקור את הגנים הספציפיים המעניינים אותם בקווי התאים המועדפים עליהם. אנו מאמינים שהוא מתבסס על גישות סינון sRNA ממוקדות הנוכחיות. מקובל להעריך שמסכים ממוקדים, ולא זני גנום שלמים, מאפשרים למדענים לשאול שאלות ספציפיות ולהפיק תוצאות חזקות יותר.ניתחנו את ההשפעה של השתקת גנים על הכדאיות והגודל של הספרואידים, אך ניתן גם להשתמש בצבעים ביומטריים לקריאת מסך שונה, כגון אפופטוזיס. מדגימה את ההליך היא פטי וואי מהמעבדה שלנו. התחל בהפשרת צלחות של 96 בארות המכילות את ספריית ה-siRNA בטמפרטורת החדר.לאחר מכן סובב במשך חמש דקות בחום של 1, 000 פעמים גרם, בעזרת צנטריפוגה על ספסל. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת המכיל את מגיב הטרנספקציה האופטימלי לבארות של כל צלחת. דגירה למשך 15 דקות כדי לאפשר היווצרות מתחמי טרנספקציה, המכילים siRNA.כמו בכל צינור סינון, יש לבצע אופטימיזציה חזקה של יכולת יצירת הכדורים של קווי תאים בתנאי טרנספקציה לפני ביצוע המסך המלא. לאחר מכן, נסו את התאים להקרנה עד שהם מתנתקים מהבקבוק. לאחר שהתאים התנתקו, נטרלו את הטריפסין עם נפח מתאים של תווך ספציפי לקו התא, העבירו לצינור צנטריפוגה וסובבו במשך חמש דקות במהירות של 1,000 פעמים גרם בצנטריפוגה על ספסל כדי לאסוף את התאים.השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה לתרחיף חד-תאי עם נפח מדיום מתאים. בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן יש לדלל את המתלה ל -5,000 תאים לכל 180 מיקרוליטר עם מדיה קרה.העבר את תרחיף התאים למאגר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, המוגדרת ב-180 מיקרוליטר, פיפטה כדי לערבב ולהעביר את מתלה התא לצלחת 96 הבארות המכילה את ה-siRNA. צנטריפוגה את הצלחת ב -1, 000 פעמים גרם בצנטריפוגה מקוררת מראש של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז דגרו את הצלחת בחממת תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס.בשלב זה, התאים יופיעו כפסיפס בתחתית הבארות. לאחר 24 שעות, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ. בשלב זה, יש לצבור את התאים יחד ליצירת ספרואיד יחיד במרכז הבאר.הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל באר כדי לעודד צמיחה לפני החזרה לחממה. לאחר שלושה ימי צמיחה, הסר בעדינות 100 מיקרוליטר בינוני מכל באר, והוסף 100 מיקרוליטר מדיום טרי. ביום השביעי, בחנו את הספרואידים תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן המשיכו לכמת את גודל הספרואידים בקורא צלחות שיכול לנטר כמותית את צמיחת הספרואידים לאורך זמן.כדי לכמת את גודל הספרואיד, פתח תחילה את התוכנה במחשב. בחר צלחת 96 בארות, בחר את סוג הצלחת המתאים והזן שם ניסוי. לאחר מכן, הכנס את צלחת 96 הבארות המכילה את הספרואידים לתוך ציטומטר הדמיה של צלחת מיקרו-באר.לאחר מכן, בחר את היישום Tumorsphere. בחר מיקוד מבוסס תמונה כדי לשנות את המיקוד כך שהספרואיד יהיה ממוקד ויהיה בעל ניגודיות אופטימלית. בחר את הבארות הדורשות סריקה והתחל בסריקה.לאחר מכן, ודא שמסיכת האובייקט מייצגת במדויק את גודל הכדור. עבור ספרואידים BT474 שגדלו במשך שבעה ימים, התאימו את הדיוק לגבוה והגדירו את קוטר המושבה המינימלי ל-200 מיקרון. השתמש בפונקציה Export כדי לייצא את הנתונים בצורה של קובץ נתונים מבואר שינותח כדי לזהות siRNAs עם השפעה מובהקת סטטיסטית על אזור הספרואיד.לאחר ההדמיה, הסר 100 מיקרוליטר של מדיום מכל באר, והוסף 100 מיקרוליטר של צבע כדאיות זוהר כדי לקבוע את כדאיות התא. לאחר דגירה של הצלחות למשך 15 דקות, סרוק את הצלחת באמצעות קורא צלחות זוהר. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם גם לשימוש עם קווי תאים סרטניים אחרים.הליך הטרנספקציה ההפוכה של בקרות שאינן ממוקדות לא השפיע באופן משמעותי על הכדאיות של אף אחד מהקווים שנבדקו, בעוד שהטרנספקציה של יוביקוויטין B, בקרה חיובית להרג תאים, הפחיתה משמעותית את הכדאיות. תאי BT474 עברו טרנספטציה הפוכה עם ספריית siGENOME siRNA אנושית בת 200 גנים בשלוש עותקים. נצפה שטח כדורי וכדאיות.זוהו חריגים משמעותיים עם ציון z גדול מ-1.7. SiRNAs שהגדילו או הפחיתו משמעותית את שטח הכדור ואת הכדאיות מוצללים בכחול, ואדום מתאר את ה-siRNAs הביקורת. סט מיקרוגרפים זה מציג תמונות מייצגות של ספרואידים BT474 שבעה ימים לאחר טרנספקציה הפוכה עם E-Cadherin, בקרה שאינה ממוקדת, PIK3CA, ERBB2 או SF3B1 siRNA.היסטוגרמה זו מראה כיצד טיפול בכל siRNA השפיע על כדאיות התא שבעה ימים לאחר טרנספקציה הפוכה. הפלה של ERBB2 ו-PIK3CA הפחיתה משמעותית את כדאיות התאים בהשוואה לבקרות. תמונה זו מדגימה כי ניתן לצבוע את הספרואידים בהצלחה כדי לחשוף את ההשפעה של השתקת גנים על חלבוני המטרה.לאחר השליטה, ניתן לסנן כמה מאות גנים במספר שורות תאים ביום אחד, וזה מאפשר זיהוי חזק של גנים חדשים פוטנציאליים החשובים להישרדות בתרבית תלת מימדית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית בהצלחה ספרואידים של תאים סרטניים הניתנים להשתקת גנים בתיווך sRNA. תוכל גם לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה על הספרואידים.זה יכול להציע מידע מרחבי רב ערך שעשוי ליידע אותך על הביולוגיה הבסיסית.

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מוצג פרוטוקול להדפסה רובוטית של ספרואידים של תאים סרטניים בפורמט צלחת של 96 בארות בתפוקה גבוהה באמצעות מערכת דו-פאזית מימית.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

כאן, שיטה מתוארת עבור הכנת ספרואיד תלת-ממדי (3D) תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts, ואחריו מדידה של פונקציות מטבוליות באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

כאן, אנו מציגים מספר שיטות פשוטות להערכת הכדאיות והמוות ב-3D הסרטן תאים spheroids, אשר לחקות את פיזיקאלית-כימיים מעברי הצבע של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תרבות דו-ממדית. מודל ספרואיד, לכן, מאפשר הערכה של יעילות התרופה לסרטן עם תרגום משופר בתנאים vivo.

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לבניית ספרואידים תלת מימדיים של גידולים. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לתצפית ספרואידית וניתוח למידה עמוקה מבוססת תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

כאן, אנו מקימים פלטפורמת פרופיל מטבולי המשלבת ספרואידים גליומה תלת מימדיים (תלת מימדיים) ונורמליזציה מבוססת הדמיה באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי. גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת יותר של התגובות המטבוליות של הגידול לטיפולים תרופתיים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני עמידות פוטנציאליים.

התקדמות בפרופיל מטבולי של ספרואידים תלת מימדיים של גידולי מוח לבדיקת תרופות

חקור גנומיקה פונקציונלית באמצעות מסך siRNA כדי לזהות מטרות תרופה חדשות בספירואידים של תאי סרטן. שיטה זו מאפשרת הערכת גנים בדגם תלת-ממדי המחקה את הסביבה הגידולית של הגידול בגוף.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

גלה סרטונים נוספים