ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני
26 בדצמבר 2016
זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.
מטרת פרוטוקול מסך siRNA זה היא לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על צמיחת ספרואידים בקו תאי סרטן. בהשוואה לטכניקות תרבית תאים דו-ממדיות מסורתיות, ספרואידים סרטניים מציגים תנאים דומים יותר לאלה שנתקלים בהם בגידולים in vivo. שיטה זו שימושית להערכה תפקודית של גנים המשתנים לעתים קרובות בסרטן אנושי, וחשוב מכך, ניתן להשתמש בה כדי לקבוע אילו גנים הם אונקוגנים פוטנציאליים או מדכאי גידול בתנאי תרבית מורכבים יותר, כמו זה שנראה בתרבית תלת מימדית, ובמיוחד תחת היפוקסיה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה בקלות כך שחוקרים יכולים להשתמש בה כדי לחקור את הגנים הספציפיים המעניינים אותם בקווי התאים המועדפים עליהם. אנו מאמינים שהוא מתבסס על גישות סינון sRNA ממוקדות הנוכחיות. מקובל להעריך שמסכים ממוקדים, ולא זני גנום שלמים, מאפשרים למדענים לשאול שאלות ספציפיות ולהפיק תוצאות חזקות יותר.
ניתחנו את ההשפעה של השתקת גנים על הכדאיות והגודל של הספרואידים, אך ניתן גם להשתמש בצבעים ביומטריים לקריאת מסך שונה, כגון אפופטוזיס. מדגימה את ההליך היא פטי וואי מהמעבדה שלנו. התחל בהפשרת צלחות של 96 בארות המכילות את ספריית ה-siRNA בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן סובב במשך חמש דקות בחום של 1, 000 פעמים גרם, בעזרת צנטריפוגה על ספסל. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת המכיל את מגיב הטרנספקציה האופטימלי לבארות של כל צלחת. דגירה למשך 15 דקות כדי לאפשר היווצרות מתחמי טרנספקציה, המכילים siRNA.
כמו בכל צינור סינון, יש לבצע אופטימיזציה חזקה של יכולת יצירת הכדורים של קווי תאים בתנאי טרנספקציה לפני ביצוע המסך המלא. לאחר מכן, נסו את התאים להקרנה עד שהם מתנתקים מהבקבוק. לאחר שהתאים התנתקו, נטרלו את הטריפסין עם נפח מתאים של תווך ספציפי לקו התא, העבירו לצינור צנטריפוגה וסובבו במשך חמש דקות במהירות של 1,000 פעמים גרם בצנטריפוגה על ספסל כדי לאסוף את התאים.
השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה לתרחיף חד-תאי עם נפח מדיום מתאים. בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן יש לדלל את המתלה ל -5,000 תאים לכל 180 מיקרוליטר עם מדיה קרה.
העבר את תרחיף התאים למאגר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, המוגדרת ב-180 מיקרוליטר, פיפטה כדי לערבב ולהעביר את מתלה התא לצלחת 96 הבארות המכילה את ה-siRNA. צנטריפוגה את הצלחת ב -1, 000 פעמים גרם בצנטריפוגה מקוררת מראש של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז דגרו את הצלחת בחממת תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס.
בשלב זה, התאים יופיעו כפסיפס בתחתית הבארות. לאחר 24 שעות, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ. בשלב זה, יש לצבור את התאים יחד ליצירת ספרואיד יחיד במרכז הבאר.
הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל באר כדי לעודד צמיחה לפני החזרה לחממה. לאחר שלושה ימי צמיחה, הסר בעדינות 100 מיקרוליטר בינוני מכל באר, והוסף 100 מיקרוליטר מדיום טרי. ביום השביעי, בחנו את הספרואידים תחת מיקרוסקופ, ולאחר מכן המשיכו לכמת את גודל הספרואידים בקורא צלחות שיכול לנטר כמותית את צמיחת הספרואידים לאורך זמן.
כדי לכמת את גודל הספרואיד, פתח תחילה את התוכנה במחשב. בחר צלחת 96 בארות, בחר את סוג הצלחת המתאים והזן שם ניסוי. לאחר מכן, הכנס את צלחת 96 הבארות המכילה את הספרואידים לתוך ציטומטר הדמיה של צלחת מיקרו-באר.
לאחר מכן, בחר את היישום Tumorsphere. בחר מיקוד מבוסס תמונה כדי לשנות את המיקוד כך שהספרואיד יהיה ממוקד ויהיה בעל ניגודיות אופטימלית. בחר את הבארות הדורשות סריקה והתחל בסריקה.
לאחר מכן, ודא שמסיכת האובייקט מייצגת במדויק את גודל הכדור. עבור ספרואידים BT474 שגדלו במשך שבעה ימים, התאימו את הדיוק לגבוה והגדירו את קוטר המושבה המינימלי ל-200 מיקרון. השתמש בפונקציה Export כדי לייצא את הנתונים בצורה של קובץ נתונים מבואר שינותח כדי לזהות siRNAs עם השפעה מובהקת סטטיסטית על אזור הספרואיד.
לאחר ההדמיה, הסר 100 מיקרוליטר של מדיום מכל באר, והוסף 100 מיקרוליטר של צבע כדאיות זוהר כדי לקבוע את כדאיות התא. לאחר דגירה של הצלחות למשך 15 דקות, סרוק את הצלחת באמצעות קורא צלחות זוהר. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם גם לשימוש עם קווי תאים סרטניים אחרים.
הליך הטרנספקציה ההפוכה של בקרות שאינן ממוקדות לא השפיע באופן משמעותי על הכדאיות של אף אחד מהקווים שנבדקו, בעוד שהטרנספקציה של יוביקוויטין B, בקרה חיובית להרג תאים, הפחיתה משמעותית את הכדאיות. תאי BT474 עברו טרנספטציה הפוכה עם ספריית siGENOME siRNA אנושית בת 200 גנים בשלוש עותקים. נצפה שטח כדורי וכדאיות.
זוהו חריגים משמעותיים עם ציון z גדול מ-1.7. SiRNAs שהגדילו או הפחיתו משמעותית את שטח הכדור ואת הכדאיות מוצללים בכחול, ואדום מתאר את ה-siRNAs הביקורת. סט מיקרוגרפים זה מציג תמונות מייצגות של ספרואידים BT474 שבעה ימים לאחר טרנספקציה הפוכה עם E-Cadherin, בקרה שאינה ממוקדת, PIK3CA, ERBB2 או SF3B1 siRNA.
היסטוגרמה זו מראה כיצד טיפול בכל siRNA השפיע על כדאיות התא שבעה ימים לאחר טרנספקציה הפוכה. הפלה של ERBB2 ו-PIK3CA הפחיתה משמעותית את כדאיות התאים בהשוואה לבקרות. תמונה זו מדגימה כי ניתן לצבוע את הספרואידים בהצלחה כדי לחשוף את ההשפעה של השתקת גנים על חלבוני המטרה.
לאחר השליטה, ניתן לסנן כמה מאות גנים במספר שורות תאים ביום אחד, וזה מאפשר זיהוי חזק של גנים חדשים פוטנציאליים החשובים להישרדות בתרבית תלת מימדית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית בהצלחה ספרואידים של תאים סרטניים הניתנים להשתקת גנים בתיווך sRNA. תוכל גם לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה על הספרואידים.
זה יכול להציע מידע מרחבי רב ערך שעשוי ליידע אותך על הביולוגיה הבסיסית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג גישה של גנומיקה פונקציונלית לזיהוי מטרות תרופתיות פוטנציאליות, באמצעות בחינת השפעות של דלל גנים (gene depletion) על ספרואידים של תאי סרטן. ספרואידים אלו מספקים מודל מדויק יותר של גידולי אדם in vivo בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) מסורתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנומיקה פונקציונלית
- ביולוגיה של הסרטן
- טכניקות לתרביות תאים
רקע
- השתקה גנטית יכולה לחשוף אונקוגנים ומדכאי גידולים.
- ספרואידים של סרטן מדמים את הסביבה המיקרובית של הגידול באופן הדוק יותר מאשר תרביות דו-ממדיות (2D).
- סריקת siRNA ממוקדת מאפשרת חקירה ספציפית של גנים.
- ניתן לחקור תנאי היפוקסיה באמצעות שיטה זו.
מטרת המחקר
- לבחון את השפעת השתקת גנים על גדילת ספרואידים של סרטן.
- לזהות גנים שעשויים לשמש כמטרות תרופתיות חדשות.
- להגביר את ההבנה של תפקוד גנים בסביבת תרבית תלת-ממדית (3D).
שיטות שבהן נעשה שימוש
- סריקת siRNA בספרואידים של שורות תאי סרטן.
- אופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה ליצירת ספרואידים יציבים.
- כימות של גודל הספרואידים והחיוניות שלהם באמצעות ציטומטריה של דימות.
- ניתוח של השפעות השתיקה הגנית על חיוניות התאים וצמיחתם.
תוצאות עיקריות
- נצפו השפעות משמעותיות של siRNAs ספציפיים על חיות הספרואידים ועל גודלם.
- השתקה (Knockdown) של ERBB2 ו-PIK3CA הפחיתה את חיות התאים בהשוואה לבקרות.
- הושגה זיהוי רב-עוצמה של גנים החשובים להישרדות בתרבית תלת-ממדית (3D).
- הודגמה יכולת ההסתגלות של השיטה עבור קווי תאי סרטן שונים.
מסקנות
- גישה זו מאפשרת סריקה של מאות גנים ביום אחד.
- היא מספקת כלי בעל ערך לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות בסרטן.
- השיטה משפרת את ההבנה של תפקוד גנים בהקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
סריקת גנומיקה תפקודית במודלים של ספרואידים סרטניים בתלת-ממד משפרת את תיקוף המטרות על ידי חשיפת תלות גנטית בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מטרות תרופתיות חדשות באמצעות לכידת השפעות של מיקרו-סביבת הגידול, שלעיתים קרובות מוחמצות בתרביות דו-ממדיות. השיטה תומכת בהחלטות גילוי מוקדמות על ידי קישור השפעות השתקת גנים לצמיחה ולחיוניות של הספרואידים, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות מועמדות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי הערכת ההשפעה של השתקת גנים על גדילה וחיוניות של ספרואידים של סרטן.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה פונקציונלית של גנים שעוברים שינויים שכיחים בסרטני אדם תחת תנאי תרבית מורכבים.
- ערך ניבוי: מזהה אונקוגנים פוטנציאליים או מדכאי גידולים הקריטיים להישרדות בתרבית תלת-ממדית (3D), ובכך תומך בתעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: עושה שימוש בסריקת siRNA כדי להפיק מדדים כמותיים של שטח הספרואיד והחיוניות שלו לצורך ניתוח השפעת גנים.
- ערך תפעולי: דורש אופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה ויכולת היווצרות הספרואידים כדי להבטיח תוצאות סריקה חסונות וניתנות לשחזור.
- מוכנות הבדיקה: משלב ציטומטריית דימוי וצבעי חיוניות לומניסצנטיים כדי לאפשר ניטור כמותי בעל תוכן גבוה של צמיחת ספרואידים לאורך זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מאשר את ההשפעה המרחבית של תלויות גנטיות באמצעות אימונוהיסטוכימיה, ובכך מקשר בין ממצאים מולקולריים לשינויים ברמת החלבון בספרואידים.
- המשכיות פרה-קלינית: מדגים תלות בהגברה של HER2 ובמוטציה ב-PIK3CA בספרואידים של BT474, ובכך מתקף מניעי סרטן ידועים במודל תלת-ממדי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מספק תיקוף מרחבי ותפקודי של השפעות גנטיות, ובכך מפחית עמימות לגבי מנגנון המטרה לפני השקעה בשלבים הבאים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization), במיוחד עבור מטרות הדורשות תיקוף במודלים גידוליים מורכבים הנוטים להיפוקסיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי קישור השתקת גנים לשינויים בחיוניות ובגודל של ספרואידים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים של טרנספקציה הפוכה ויצירה סטנדרטית של ספרואידים בפורמט של 96 בארות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים כמותיים של שטח וחיוניות הספרואידים באמצעות ציטומטריה של תמונות וקריאות לומנסנטיות, מה שמאפשר זיהוי סטטיסטי של תוצאות משמעותיות (למשל, z-score >1.7).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין השפעות השתקת גנים לבין ביטוי חלבוני מרחבי באמצעות אימונוהיסטוכימיה, ובכך משפרת את התאמה של סממנים ביולוגיים ואת התובנה המכניסטית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למגוון קווי תאי סרטן וספריות siRNA, מה שממצב אותה כפלטפורמה רב-שימושית למסעות של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי חשיפת תלות גנטית בהקשר תלת-ממדי הרלוונטי לגידולים סרטניים.
- ערך תפעולי: מקדם שחזוריות באמצעות יצירת ספרואידים סטנדרטית, אופטימיזציה של טרנספקציה ותהליכי דימוג כמותיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות ממודלים דו-ממדיים והגברת הביטחון בחיוניות המטרה.
- השפעה על תיק הפיתוח (Portfolio): מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס ראיות תפקודיות ממודלים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, בטכניקות טרנספקציה ובטיפול במודלים תלת-ממדיים כדי להבטיח יצירה יציבה של ספרואידים.
- התהליך תלוי בגישה לציטומטריית דימות ולקוראי לוחות לומניסצנטיים לצורך הערכה כמותית של גודל הספרואידים וחיוניותם.
- נדרשת אופטימיזציה של תנאי הטרנספקציה ושל צפיפות התאים (5,000 cells/180 µL) להבטחת יצירה עקבית של ספרואידים בכל הבארות.
- יש לשקול התאמות בעת הרחבה לקווי תאי סרטן אחרים או לתנאים המודולים על ידי היפוקסיה.
- מגבלה מעשית: תפוקת הסריקה תלויה בגודל ספריית ה-siRNA וביכולת הדימות, אם כי ניתן לסרוק מאות גנים ביום לאחר ביצוע אופטימיזציה.
