הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב תסיסנית Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים
29 בדצמבר 2016
כאן אנו מתארים הליך ללכידת תמונות חיות של גסטרולציה של דרוזופילה. זה אפשר לנו להבין טוב יותר את ההתכווצות האפיקלית הכרוכה בהתפתחות מוקדמת ולנתח עוד יותר מנגנונים השולטים בתנועות התאים במהלך שינוי מבנה הרקמה.
המטרה הכוללת של הליך זה, היא להבין טוב יותר את הצורה והתנועה של התא, במהלך גסטרולציה של דרוזופילה. כאן אנו מספקים שיטת מדידה חסונה של גסטרולציה של דרוזופילה, כדי לבחון את התחלת התנועה התאית המורפוגנטית, בשלב זה של ההתפתחות העוברית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות סידור מחדש של תאים בזמן הקיבה, יחד עם התכווצות אפיקלית, במהלך הקיבה.
כדי להתחיל בניסוי, הכינו תערובת של 375 מיליליטר מים. 125 מיליליטר 100% מיץ תפוחים זמין מסחרית. 12.5 גרם אגר.
12.5 גרם גלוקוז. לאחר מכן, מחממים את התערובת במיקרוגל, עד שהאגר נמס. ושופכים אותו לתבנית תרבית תאים של שלושה סנטימטרים.
אחסן את התערובת בחום של 4 מעלות צלזיוס, לשימוש עתידי. לאחר הכנת צלחת התפוחים מוסיפים מעליו שכבה דקה של רסק שמרים לישה, כדי לאפשר לזבובים להטיל ביצים. מניחים 25 זכרים ו -25 נקבות זבובים בבקבוק על צלחת תפוחים מכוסה בשמרים לישה.
עטפו את בקבוקי הפלסטיק של Drosophilas בנייר אלומיניום כדי לעודד את הזבובים להטיל ביצים נוספות. שמור את הבקבוק הפוך באינקובטור למשך הלילה. למחרת בבוקר, החלף את צלחת מיץ התפוחים בצלחת טרייה.
לאחר מכן עטפו את הבקבוק בנייר אלומיניום ואפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר שהזבובים הטילו ביצים, שחררו את הביצים מהצלחת בעזרת ניצן כותנה. אספו את העוברים במסננת, ושטפו אותם עם מי מלח עם פוספט, או PBS.
שטפו את העוברים שלוש פעמים נוספות עם PBS, בכלי תרבית של 12 בארות. Dechorionate את העוברים עם 50% אקונומיקה, בכלי תרבית של 12 בארות. לאחר תהליך הדכוריון, שטפו את העוברים שלוש פעמים נוספות עם PBS.
העבירו את העוברים לצלחת תרבית תאים של שלושה סנטימטרים המכילה PBS. ולבחור עוברים בשלב 5 תחת המיקרוסקופ, על סמך רמת השקיפות בגבולותיהם. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, אוספים את העוברים המבוימים.
לאחר מכן, הניחו שני עוברים נבחרים על פתק כיסוי זכוכית, והסירו עודפי PBS עם נייר טישו. בעזרת נייר טישו מעוות דק, כוון את הצד הגבי של העוברים כלפי מעלה אל החלקת הכיסוי. לאחר מכן חבר את העוברים לכיסוי הזכוכית עם שומן סיליקון בעזרת מחט דקה.
הוסף טיפה קטנה של שמן פחמן חלול 700 על העוברים, והנח את הכיסוי המכיל את העוברים הפוך על השקופית השקועה. השארת מקום בתחתית השקופית. לאחר מכן הדביקו את תלוש הכיסוי לשקופית.
לבסוף, בחנו את העוברים באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית, לייזר ארגון 488 ומטרה לטבילה בשמן. תמונות זמן-lapse צולמו מהדמיה חיה, תוך שימוש ב-DE-cadherin GFP של תנועת תאים במשך 500 שניות, כדי לנתח את האזורים האפיקליים של תאים בודדים, של דרוזופילה במהלך קיבה. לאחר 500 שניות, התכווצות אפיקלית ופלישה נראים בבירור.
על ידי שימוש בשיטה שלנו. אנו יכולים להבין עוד יותר, את המנגנונים המולקולריים, של גסטרולציה של דרוזופילה, כמו גם, מעבר אפיתל למזנכימלי, המעורב בגרורות סרטניות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוצדורה לצילום תמונות חיות של גסטרוולציה ב-Drosophila, ובכך משפר את הבנתנו לגבי היצרות אפיקלית במהלך ההתפתחות המוקדמת. הטכניקה מאפשרת ניתוח מפורט של תנועות תאיות המעורבות בשינוי מבנה הרקמה.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של התא
רקע
- גסטרולציית ה-Drosophila היא שלב קריטי בהתפתחות העובר.
- הבנת צורת התא ותנועתו חיונית להבנת תהליכי התפתחות.
- היצמקות אפיקלית ממלאת תפקיד משמעותי בתנועות מורפוגנטיות.
- טכניקות של דימיון חי (Live imaging) יכולות לספק תובנות לגבי התנהגויות תאיות דינמיות.
מטרת המחקר
- לשיפור ההבנה של תנועות תאיות במהלך הגסטרולציה של *Drosophila*.
- לפיתוח שיטה חזקה למדידת תנועה תאית מורפוגנטית.
- לזיהוי סידורים מחדש של תאים וכיווץ אפקלי במהלך הגסטרולציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תערובת ספציפית לדימוי.
- דימוי חי של עוברים של Drosophila במהלך הגסטרוולציה.
- ניתוח של תנועות תאיות ושינויים במבנה.
- זיהוי של אירועים מורפוגנטיים מרכזיים.
תוצאים עיקריים
- צילום מוצלח של תמונות חיות של גסטרולציה ב-Drosophila.
- זיהוי של התכווצות אפיקלית וארגון מחדש של תאים.
- הבנה משופרת של דינמיקה תאית במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- מתודולוגיה חסונה למחקרים עתידיים בביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- הפרוצדורה מספקת תובנות בעלות ערך לגבי הגסטרולציה של Drosophila.
- דימות חי הוא כלי רב עוצמה לחקר תנועות תאיות.
- הממצאים תורמים להבנה רחבה יותר של תהליכי התפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות חי של שינויים בצורת התא ותנועה במהלך גסטרולציה של Drosophila מספק פלטפורמה חסונה לניתוח המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס המעבר מאפיתל למזנכימה (EMT), תהליך המעורב בפיברוזיס ובגרורות סרטניות. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של התכווצות אפיתלית (apical constriction) וארגון מחדש של תאים, ובכך תומכת בביטחון ניבוי באישור יעדים בשלבים מוקדמים עבור מסלולים הקשורים ל-EMT. גישה זו מחזקת את הרצף התרגומי מביולוגיה התפתחותית למחקרי מנגנונים רלוונטיים למחלות במחקר ופיתוח בביופארמה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של תפקודי גנים ודינמיקה של מסלולים הקשורים ל-EMT בהקשר רב-תאי חי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של אירועים מורפוגנטיים הקשורים למכניזמי מחלה.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור גנים השולטים בכיווץ אפקלי (apical constriction) ובמעברי גורל תאי.
- מספק ביטחון חיזוי לצורך תיעדוף מטרות מווסתות EMT בפורטפוליו של אונקולוגיה ופיברוזיס.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכונן מערכת דימות מאומתת לכימות תנועת תאים ושינויים במורפולוגיה בזמן אמת.
- מאפשר מדידה הדירה של התכווצות אפיתליאלית (apical constriction) וארגון מחדש של תאים כתוצרי בדיקה כמותיים.
- תומך בסטנדרטיזציה של פלטפורמות לסריקה פנוטיפית של תרכובות המשפיעות על EMT.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות עבור תהליכי עבודה של סריקת תוכן גבוהה (high-content screening) בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים תהליכי EMT התפתחותיים למודלים רלוונטיים למחלה של גרורות ושקיעה מחדש של רקמות.
- מספק תובנות מכניסטיות המכוונות בחירת ביומארקרים תרגומיים למחקרים פרה-קליניים.
- מאפשר קידום מותאם סיכון של מועמדים המטרגים EMT, בהסתמך על ראיות פנוטיפיות בתאי חיים.
- מחזק את הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני בתחומי מחלה המונעים על ידי EMT.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת דימות זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקה ראשונית של השערות ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים למטרות הקשורות ל-EMT.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים עבור ווסתים של EMT ומורפוגנזה.
- סריקה: מספק תוצרים כמותיים וניתנים לשחזור של צורת התא ותנועתו, המאפשרים מוכנות של הבדיקה.
- אנליטיקה: מספק נתוני דימוג בעלי תוכן גבוה לצורך ניתוח השוואתי של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנוני התפתחות לדגמי EMT רלוונטיים למחלות לצורך התאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת דימוג הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למגוון מחקרי EMT ומורפוגנזה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים עבור תוכניות גילוי המכוונות ל-EMT.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות וניתנות להרחבה של דימות לצורך הדירות בין פרויקטים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באינדיקציות המונעות על ידי EMT.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדרי עדיפויות מותאמי סיכון של נכסים מווסתים EMT בתחומי טיפול שונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות חי, מיקרוסקופיה קונפוקאלית ואמבריולוגיה של Drosophila.
- מחייב גישה למכשור דימות מתקדם ולתוכנות אנליטיות לניתוח סרטי time-lapse.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של שלבי התפתחות העוברי ושל פרוטוקולי הדימות לצורך שחזוריות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של מבני דוחות (reporter constructs) ותנאי דימות.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצי תפוקה (throughput) וצורך בטיפול מדויק בעוברים.
