Name: מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למדו מודל תרבות תאי אנדותל לחקר טרנספורמציה ממארת המושרית על ידי KSHV. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי גנים ומנגנונים אונקוגניים מוקדמים בסרקומת קפוסי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921, P51 OD011092 (AVM); פרס 14PRE20320014 של איגוד הלב אמריקה (SB).

הערה: כל ההליכים המתוארים פרוטוקול זה צריך להתבצע בתנאים BSL-2-
 1-KSHV מניות הכנה <ol><li>TNE להכין מאגר: להמיס מ"ג 292.24 EDTA ddH 2 O להביא עד 225 מ"ל, להתאים את ה-pH 8. להמיס 605.7 מ"ג טריס ddH 2 O, להביא עד 225 מ"ל, להתאים את ה-pH 8. שילוב פתרונות EDTA, טריס, להוסיף 4.38 g NaCl, להתאים את עוצמת הקול הסופי עד 500 מ"ל, לסנן לחטא, ולאחסן ב 4 ° C .</li>
	<li>תרבות את KSHV-חיובית, EBV-שלילי תפליט העיקרי לימפומה תא קו BCBL-1 בחממה humidified 37 ° C בתוספת 5% CO 2 ב- RPMI בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- antimicrobials 1 ל 1.2 x 10 6 תאים לכל mL-</li>
	<li>כדי לעודד ייצור KSHV, לפצל את תרבויות 1:2 בינונית טרייה להוסיף Phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ריכוז סופי של 20 ng/mL, דגירה תרבויות במשך 5 ימים. כחלופה, יטפל בתאים עם butyrate נתרן (NaB; 0.1 מ מ) במשך 3 ימים לזירוז lytic שכפול ויראלי.</li>
	<li>הקציר נגיפים, תחילה centrifuge התרבות supernatant-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר הצניפה התאים ולהעביר supernatants ל צינורות טריים.</li>
	צנטריפוגה <li>להבהיר עוד יותר את תגובת שיקוע כדי למנוע העברה של פסולת הסלולר, ב 2,500 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס 
	הערה: כחלופה במהירות גבוהה צנטריפוגה הבהרה של התרבות supernatants, סינון דרך 0.45 סטרילי מיקרומטר מסנן יכול להתבצע. הבחנו ירידה משמעותית כייל נוגדנים באמצעות סינון; לכן, אנחנו באופן שגרתי ביצוע השלב השני צנטריפוגה במקום.</li>
	<li>הבא, כיסוי 5 מ של 25% סוכרוז פתרון מאגר TNE עם 30 מ של התרבות מובהר supernatant 6 צינורות ultracentrifuge.</li>
	<li>צנטריפוגה מאוזנת צינורות ב 75,000 g x עבור 2 h ב 4 ° C תחת ואקום.</li>
	<li>Decant התרבות supernatant, כתם בקצה כל שפופרת להסיר כמה שיותר פתרון תגובת שיקוע וסוכרוז ככל האפשר ולאחר מכן resuspend בגדר וירוס, אשר עשוי לא להיות גלויות, ב- µL 150 מאגר TNE.</li>
	<li>בריכה כל resuspended וירוס, מערבבים היטב, ומקפיאים aliquots 25 µL ב-80 מעלות צלזיוס .</li>
</ol> 2. התמרה חושית של EC E6, E7 וירוס הפפילומה גנים הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי תרביות רקמה סטנדרטי מבחנות לגידול העיקרי לכלכלת עם זאת, אם צמיחה משביעת רצון של EC מתקבלים ואז השימוש של תרבות מסחרית מבחנות לשקול.
<ol><li>תרבות ראשי האדם עורי microvascular או הלימפה EC ב חממה humidified 37 ° C בתוספת 5% CO 2 ב- EC מדיום הגידול (EGM; מכיל EC הבזליים בינוני [EBM] בתוספת BulletKit EGM-2 [המכיל FBS, הידרוקורטיזון האנושי פיברובלסט גורם גדילה-B, כלי הדם גורם הגדילה EC, פקטורי גדילה דמויי אינסולין-1, חומצה אסקורבית, גורם הגדילה האפיתל אנוש, אנטיביוטיקה, הפארין]) בבקבוקון תרבות תא T75 עד כ 50% הנהרות.</li>
	<li>עבור התמרה חושית, תרבות PA317 LXSN 16E6E7 תאים 24 , 35 חממה humidified על 37 ° C פלוס 5% CO 2 ב- DMEM בתוספת 10% FBS ו antimicrobials ב T150 הבקבוק של התרבות התא עד כ- 90% confluent. ואז דגירה בין לילה ב- mL 16 בינוני.</li>
	<li>להבהיר את המדיום PA317 על ידי צריך שתוציאו על 300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את EGM EC התרבות התאים וכיסוי 12 מ של המדיום PA317 שקופה ולאחר תקופת דגירה של 4 h. 
	הערה: צריך שתוציאו 16 מ"ל של מדיום ממוזגים ב g x 300 לתוצאות 5 דקות בגלולה קומפקטי זה לא מופרעת על ידי הסרת עוקבות זהיר 12 מ של תגובת שיקוע שקופה. עם זאת, אם העברת תאי 16E6E7 PA317 LXSN לתרבויות EC הראשי דאגה (הקו תא אריזה במהירות נגמלים EC), ואז סינון של תגובת שיקוע ממוזגים דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לפני העברת יכול להתבצע.</li>
	<li>להחליף 6 מ של המדיום PA317 EGM טריים, דגירה בין לילה.</li>
	<li>Refeed EC 12 מ ל EGM טריים דגירה של ה 48 נוסף</li>
	<li>תת תרבות EC, הסר בינוני, לשטוף עם 12 מ של PBS ללא קטיונים, ולא להוסיף 3 מיליליטר דיסוציאציה אנזימטי מסחרי פתרון (למשל, TrypLE) מאת ולהעביר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות</li>
	<li>תא ההשעיה להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה-g 300 x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend בגדר התא שנוצר ב- EGM טריים, לחלק באופן שווה 3 מבחנות x T75 עם נפח סופי של 12 מ ל EGM לכל הבקבוקון.</li>
	<li>כדי לבחור עבור EC transduced עם E6, E7, להוסיף G418 ריכוז הסופי של µg/mL 200 עבור שני קטעים, אחרי אשר transduced EC יכול להיות מצופה זיהום או קפוא חנקן נוזלי.</li>
</ol> 3. זיהום של Transduced EC עם KSHV <ol><li>ביום לפני זיהום הקציר EC על ידי עיכול אנזימטי באמצעות הפתרון דיסוציאציה אנזימטי מסחרי כפי שתואר לעיל. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של EGM. השתמש µL 5 תאים כדי להכין לדילול 1/10 ב- Trypan blue. לספור תאים חיים באמצעות hemocytometer ואת הזרעים 2.5 x 10 תאים חיים 5 ב- 2 מ של EGM לכל טוב ב 6 צלחות טוב.</li>
	<li>ביום של זיהום, להסיר EGM, לשטוף תאים עם 3 מ"ל של PBS עם סידן ומגנזיום לכל טוב, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל EBM. 
	הערה: זה חיוני כדי להשתמש EBM ולא EGM במהלך זיהום, כמו ההפרין ב EGM ימנע קשירה של חלקיקי נגיפי ולדלקת עוקבות של יעד לכלכלת</li>
	<li>להדביק תאים עם KSHV, להוסיף 5 עד 20 µL וירוס מלאי כל טוב ו מערבולת הצלחת לערבב. עבור תאים הנגועים ואימץ להוסיף אמצעי שווה מאגר TNE כל טוב.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחות ב g x 400 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות</li>
	<li>אם המטרה של המחקר היא לחקור בתחילת האירועים הדורשים סינכרונית זיהום נגיפי, למשל, בתחילת האירועים דה נובו זיהום, להסיר את inoculum ויראלי בשלב זה. . שטפי וחזרי refeed התאים עם 2 מ"ל EGM טריים. אחרת, להוסיף 2 מ"ל EGM, דגירה תרבויות בין לילה.</li>
	<li>Refeed תאים עם 2 מ"ל EGM היום לאחר זיהום, אז בכל יום אחר.</li>
	<li>כאשר התאים נמצאים כ 90% confluent, הקציר על ידי עיכול אנזימטי באמצעות פתרון מסחרי דיסוציאציה אנזימטי כמתואר לעיל, ולאחר מכן בריכה התאים משלוש בארות לתוך T75, וציין את המספר הכולל מעבר והן את המעבר לאחר הפגיעה-</li>
	<li>הרחב מוק - ו KSHV-נגוע EC פיצולים 1:3 לפחות שני מעברים יותר ובו בזמן תאים שניתן להשתמש בניסויים או קפוא חנקן נוזלי. 
	הערה: כמו עם פיצול של EC transduced עם E6, E7, תחזוקה תרבויות ואימץ ו- KSHV-תאים הנגועים צריכים להתחלק לפני שהגיע למפגש (~ 85 עד 90%).</li></ol>
 4. זיהום המאשר עם KSHV מאת Immunofluorescence הערה: זיהוי KSHV השהיה-הקשורים גרעיני אנטיגן (לאנה-1/ORF73) מספק מדד כמותי אמין של זיהום. נוגדנים אנטי-לאנה זמינים מסחרית.
<ol><li>ביום שלפני מכתים, הצלחת שתי בארות אחד עם מעושה או KSHV-נגוע EC על צלחת 24-ובכן-עונה 1 פרק 10 5 תאים לכל טוב ב- 1 מ ל EGM ואני דגירה בין לילה.</li>
	µL <li>תאים לשטוף פעמיים עם 500 של PBS בתוספת סידן, magniseum. כביסה ב-30 s על פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>בשכונה fume מבחוץ-ventillated ', לתקן תאים עם 500 µL של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף (0.1% טריטון X-100 בתוספת 0.02% סרום עז PBS בתוספת קטיונים).</li>
	<li>לחסום תאים עם 500 µL של 2% נסיוב עז במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.</li>
	<li>תווית באר אחת של מעושה או KSHV-נגוע EC עם 200 µL של נוגדן ראשוני מדולל 1:100 במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה. דגירה שתי הבארות הנותרים ב 200 µL מאגר לשטוף רק.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.</li>
	<li>תווית כל ארבע בארות עם 200 µL נוגדנים משניים מדולל בטחונות במאגר שטיפת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה.</li>
	<li>לרחוץ תאים שלוש פעמים עם 500 µL מאגר לשטוף.</li>
	<li>אל כל טוב החל µL 20 הגוברת דאפי המכילות בינוני ו- coverslip ולהעריך את מכתים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.</li>
	<li>לקבוע את הזיהום אחוז של תאים הנגועים KSHV על ידי ספירת מספר גרעינים לאנה-חיוביות בתאים לפחות 200. זיהום עם רקומביננטי KSHV-Bac16 ניתן לנטר גם דרך התבוננות של תרבויות להבעה של GFP.</li>
</ol>

Oncogenesis הוא תהליך רב שלבי העוקפות אמצעי חשוב בתוך האורגניזם36. כפי KS נגעים קיימים לאורך קשת של דלקת כרונית כדי סרקומות נכון, הבהרה של תהליכים מסוימים הקשורים pathophysiological מתווכת על-ידי KSHV דורש כי מחקרים להתנהל במודלים התרבות תאים התומכים טרנספורמציה9. יצוין כי אובדן קשר עיכוב וצמיחה תלויי-anchorage, פנוטיפים מעידה על שינוי הסלולר, אינם מפתחים בקלות בעקבות זיהום של ראשי EC או EC מונצחים על ידי ביטוי אקסוגני של טלומראז. לכן, בעוד המודל במבחנה של KS המתוא...

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול רב נקודתית angioproliferative להשפיע על עורי, הרירית, אתרי הקרביים שמתפתח הנפוץ ביותר בסביבה של דיכוי המערכת החיסונית מתקדמים1. 4 טפסים אפידמיולוגיים תוארו: קלאסי, טופס indolent בדרך כלל משפיע על אנשים מבוגרים של הים התיכון והמזרח התיכון מורשת; iatrogenic, הנובע טיפול עם תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת איברים; מגיפה, סרטן איידס, הגדרת; מהם ייחודיים, טופס שאינו תלוי-HIV נפוץ אצל ילדים באזורים אנדמיים באפריקה. עם כניסתו של משטרי סמים אנטי-retroviral שילוב יעיל לטיפול ב- HIV, KS מגיפה מאובחנת הרבה פחות נפוץ במדינות מתפתחות. עם זאת, טפסים אנדמיים, מגיפה קלינית אגרסיבי נשארים בין הנפוץ ביותר סרטן שאובחנו רבים במדינות אפריקה2,3,4. לכן, זיהוי של תרופות ממוקדות פתוגנזה יעילות לטיפול KS היא עדיפות למחקר.
בהיסטולוגיה, KS נגעים מאופיינים כורוידאלית הנרחבים אך חריג לפיו פלך בתאים ממוצא EC בצורת רשתות כלי דם רציף5. אלה כלי נורמלי ("חרכי כלי הדם") לאפשר extravasation של אריתרוציטים, אשר נותנות נגעים הצבע האופייני שלהם. בנוסף, נגעים לכלול לויקוציטים רבות המאפיינות דלקת כרונית (קרי, לימפוציטים מקרופאגים, תאי פלזמה). רגרסיה של נגעים KS ביצוע שיחזור המערכת החיסונית שתיארנו, רומז כי KS יש תכונות של שניהם hyper-ציבוריות ו סרטניים נכון6,7,8,9.
KS ההרפס (KSHV), סוכן סיבתי של KS, זוהתה בשנת 199410. מאז ואז רבים במבחנה תרבית תאים פותחו מודלים כדי לאפשר פתוגנזה מחקרים, כולל תאים explanted מן הגידול ביופסיה חומר ראשוני או לבטא טלומראז EC נגוע KSHV במבחנה11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. אף אחד הדגמים זמין כעת באופן מלא recapitulates microenvironment הגידול של KS, אבל כולם תרמו ידע בעל ערך להבנתנו pathobiology של KSHV זיהום. שלא כמו אחרים הידועים tumorigenic ההרפס האנושי וירוס אפשטיין בר (EBV), KSHV לא בקלות להפוך תאים בתרבות בעקבות דה נובו זיהום19,20,21, 22. עם זאת, יש כבר להתגבר על מגבלה זו על-ידי transducing הראשית EC אנושי גם מעורב מוצא microvascular או הלימפה E6 ו- E7 גנים של וירוס הפפילומה האנושי 16 לפני זיהום עם KSHV23,24 . הביטוי של אלה oncogenes אקסוגני מגדיל באופן דרמטי את הפוטנציאל להפוך של KSHV במבחנה באופן חלקי על-ידי מתן עוד עיכוב של רטינובלסטומה חלבון ו- p5323,24. שיטה זו של התמרה חושית EC אפשרה מעבדות מרובים כדי לזהות שינויים מרכזיים של המארח ביטוי גנים תא זה הם המושרה על-ידי זיהום KSHV, המופיעים כדי להקל על KS תא הישרדות והתפשטות25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. הפרוטוקולים המפורטים להלן הן פשוטות וברורות מאוד לשחזור, יביא הדור של מתאימים לגיל המעבר EC הנגועים KSHV ופקדים הנגועים ואימץ יכול להיות תרבותי עבור הרבה יותר זמן ראשי תאים והאם לאפשר החקירה של מנגנונים oncogenic מועסק על ידי KSHV. למרות הפרוטוקול כולל שיטה לייצור פראי סוג KSHV מהקו הראשי תפליט לימפומה תא BCBL-1, EC E6/E7-מונצח גם הם רגישים מאוד זיהום עם BACmid רקומביננטי נגזר KSHV-BAC1630. פרוטוקולים עבור הכנת BAC16 מתוארים במקומות אחרים33,34.

<table><tbody><tr><td>תאי BCBL-1</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>תאי PA317</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים ילודים</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 בסיסי בינוני</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-KSHV LANA/ORF 73</td><td>מתקדם Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS עם סידן ומגנזיום</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול יוצא דופן המורכבת מתרבים פלך בתאים, הוא שיזם זיהום של תאי אנדותל (EC) עם KSHV, והוא מתפתח לרוב בסביבה של החיסוני. למרות עשורים של מחקר, הטיפול האופטימלי של KS נשאר גרוע מוגדרים, התוצאות הקליניות שלילי במיוחד הגדרות משאב מוגבל. נגעים KS מונעים על ידי אנגיוגנזה פתולוגי, דלקת כרונית, oncogenesis, במבחנה תא תרבות מודלים שונים פותחו כדי לחקור תהליכים אלו. KS נובע תאים הנגועים KSHV ממוצא אנדותל, כך EC-שושלת התאים מספקים המתאים ביותר במבחנה המחליפים למבשר התא כישור. עם זאת, כי EC יש תוחלת חיים מוגבלת במבחנה , כמו המנגנונים oncogenic מועסק על ידי KSHV יעילה פחות מאלה של וירוסים אחרים, tumorigenic, מתקשים להעריך תהליכי טרנספורמציה של ראשי או לכלכלת מונצחים טלומראז לכן, מודל תרבות המבוססת על EC הרומן פותחה שתומך ברצון מטרנספורמציה בעקבות זיהום עם KSHV. חוץ רחמי הביטוי של הגנים E6, E7 מסוג וירוס הפפילומה האנושי 16 מאפשר לתרבות מורחבת של מתאימים לגיל המעבר ואימץ ו- KSHV-נגוע EC ותומך הפיתוח של טרנספורמציה באמת (כלומר tumorigenic) פנוטיפ של תרביות תאים נגועים . מודל זה צייתן ולא מאוד לשחזור של KS הנחתה את הגילוי של כמה חיוני איתות המסלולים עם פוטנציאל גבוה לתרגום לתוך הגדרות קליניים.

המורפולוגיה של EC העיקרי מתואר בסגנון קלאסי "חלוק אבן", מורפולוגיה זו אינה משתנה על ידי ביטוי של וירוס הפפילומה E6, E7 גנים (איור 1 א'). הביטוי של הגנים E6, E7 לבד לא לגרום הפנוטיפ טרנספורמציה; לפיכך, התאים רגישים ליצור קשר עם עיכוב, תחדל חלוקת בהגיעם הנהרות בתרבות. התאים אולם להתרבות, ולצמיחה מחודשת אל הנהרות על trypsinization ועל replating על צפיפות נמוכה יותר, המאפשר קיום מתאימים לגיל המעבר תרבויות לשימוש כפקדי הנגועים מעושה.
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול הנגרמת על ידי זיהום עם oncogenic וירוס ההרפס-8/KS ההרפס האנושי (HHV-8/KSHV). המודל התרבות תאי אנדותל המתואר כאן הוא לצורכיכם לימוד המנגנון שבאמצעותו KSHV המרות התאים המארחים.

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין מוק מותאם גיל ומעבר בתאי אנדותל נגועים ב-KSHV כדי לאפשר מחקר של שינויים הקשורים ל-KSHV בביטוי הגנים של תאי המארח, כולל שינויים המניעים טרנספורמציה ממאירה בהקשר של בקרות מתאימות. שיטה זו יכולה לסייע בהגדרת השינויים הפתופיזיולוגיים העיקריים בביולוגיה של תא המארח המובילים לסרטן הקשור ל-KSHV, ובכך לזהות מטרות טיפוליות חדשות למניעה או טיפול במחלות. היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שהתמרה ממאירה של תאי אנדותל בעקבות זיהום ב-KSHV מתרחשת במהירות ובאופן שחזורי ומאפשרת לחקור אירועים מוקדמים בתהליך האונקוגני עם תאי ביקורת מותאמי גיל ומעבר.למרות שמודל זה של אונקוגנזה ויראלית יכול לספק תובנה לגבי התפתחות סרקומה קפוסי, ניתן ליישם אותו גם על סוגי סרטן אחרים. מכיוון שסרקומה של קפוסי היא גידול בכלי הדם, ההשלכות של מודל תרבית תאים זה מתרחבות להבנת תהליכי מחלה אחרים המונעים על ידי אנגיוגנזה פתולוגית. כדי להתחיל, הכן וסנן מאגר TNE מעוקר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן אחסן את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס. תרבית קו תאי לימפומה ראשונית שלילית של EBV חיובי ל-KSHV BCBL-1 בבקבוק T150 מלא ב-60 מיליליטר של מדיום RPMI. שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני כדי לקבל השעיה של בערך 1 עד 1.2 פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר.לאחר שמגיעים לצפיפות המתאימה, יש לפצל את התאים אחד לשניים עם מדיום טרי ולהוסיף PMA לריכוז סופי של 20 ננוגרם למיליליטר כדי לגרום לייצור KSHV. לאחר מכן דגרו על התרבויות למשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימי דגירה, קצרו חלקיקים נגיפיים על ידי סיבוב תרחיפי התאים ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן העבירו את הסופרנטנטים לצינור חדש. צנטריפוגה את הסופרנטנטים פעם נוספת ב-2, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר פסולת תאית. כעת, לאחר שהובהר, שכבו חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז 25% ב-TNE עם כ-30 מיליליטר של הסופרנטנט בשישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה.צנטריפוגה את הצינורות המאוזנים ב-75,000 פעמים גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס בוואקום. לאחר השלמת הצנטריפוגה, יש לשפוך את הסופרנטנט ולספוג את שפת כל צינור כדי להסיר כמה שיותר מהנוזל. לאחר מכן השעו מחדש את הנגיף הגלולי ב-150 מיקרוליטר של מאגר TNE ואגד את כל הדגימות.מערבבים היטב את המתלה המאוגד ומחלקים אותו ל -25 מיקרוליטר. אחסן את נגיף המלאי במינוס 80 מעלות צלזיוס. תרבית תאי אנדותל עוריים, מיקרו-וסקולריים או לימפתיים אנושיים ראשוניים במדיום EGM בבקבוק T75.שמור על תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני עד להגעה למפגש של כ-50%. לפני התמרת תאי אנדותל, תרבית תאי PA317 LXSN 16E6E7 בבקבוק תרבית תאים T150 מלא ב-20 מיליליטר DMEM ב-37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני. לאחר השגת מפגש של כ-90%, החלף את המדיום מתרבית התאים PA317 ב-16 מיליליטר של מדיום טרי ודגר את התאים למשך הלילה.לאחר דגירה של לילה, אוספים את המדיום מתרבית התאים PA317 ומבהירים אותו על ידי צנטריפוגה ב-300 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. החלף את מדיום ה-EGM מתרבית תאי אנדותל קונפלונטית של 50% ב-12 מיליליטר של מדיום PA317 המובהר. דגרו על התאים למשך ארבע שעות.לאחר מכן החלף שישה מיליליטר של מדיום PA317 בשישה מיליליטר של מדיום EGM טרי ודגר על התאים למשך הלילה. לאחר מכן, הסר את המדיום מתרבית תאי האנדותל והאכיל את התאים ב-12 מיליליטר EGM טרי. המשיכו לדגור על התאים למשך 48 שעות נוספות.כדי לתרבת תאי אנדותל, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 12 מיליליטר PBS ללא קטיונים. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית מסחרית ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה של התאים ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הגלולה, השעו מחדש את התאים במדיום EGM טרי וחלקו את התרחיף באופן שווה לשלוש צלוחיות T75. התאם את נפח התרבויות ל -12 מיליליטר EGM לבקבוק. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוגרם למיליליטר של G418 כדי לבחור תאי אנדותל מותמרים.קצור את תאי האנדותל המומרים על ידי עיכול אנזימטי כפי שהוצג קודם לכן. השעו מחדש את כדור תאי האנדותל במיליליטר אחד של מדיום EGM. לאחר מכן מערבבים חמישה מיקרוליטרים של תרחיף התא עם 45 מיקרוליטר של תמיסת טריפן כחולה וסופרים תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר.זרע 2.5 כפול 10 עד התאים החמישיים ברי קיימא בשני מיליליטר של מדיום EGM לבאר של צלחת של שש בארות. למחרת, הסר את מדיום ה- EGM ושטוף את התאים בכל באר עם שלושה מיליליטר PBS עם סידן ומגנזיום. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר מדיום EBM לכל באר.כדי להדביק תאים ב-KSHV, הוסיפו חמישה עד 20 מיקרוליטר של מלאי הנגיף לכל באר וסובבו את הצלחת כדי לערבב את התרחיפים. הוסף נפח שווה של מאגר TNE לכל באר המכילה תאים נגועים מדומים. לאחר צנטריפוגה של הצלחת בחום של 400 פעמים גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, דגרו אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של מדיום EGM לכל באר ודגרו על התרבויות למשך הלילה. לאחר הדגירה, הסר את מדיום ה- EGM מכל באר והחלף אותו בשני מיליליטר EGM טרי. כאשר התאים מגיעים למפגש של כ-90%, קצרו אותם על ידי עיכול אנזימטי כפי שהוצג קודם לכן.אחסנו את התאים משלוש בארות לבקבוק T75 המסומן במספר המעבר הכולל במעבר לאחר ההדבקה. לפני הבדיקה או ההקפאה, הרחב תרביות תאי אנדותל מדומות ונגועות ב-KSHV על ידי פיצול אחד עד שלושה לשני מעברים נוספים לפחות. מוצגת כאן תמונה מיקרוסקופית של תאי אנדותל נגועים מדומים החושפים מראה מרוצף קלאסי.חלוקת התאים בתאים אלה מעוכבת במגע כאשר התרבית מגיעה למפגש. תאי אנדותל נגועים ב-KSHV מפתחים מורפולוגיה מוארכת דמוית ציר המזכירה תאי ציר סרקומה של קפוסי. בניגוד לתאים הנגועים המדומה, תאי אנדותל נגועים ב-KSHV ממשיכים להתרבות גם כאשר הם מגיעים למפגש המוביל להתפתחות מוקדי תאים רב-שכבתיים.כאשר מאבדים מגע עם המצע, תאי אנדותל נגועים מדומה עוברים מוות של תאים אפופטוטיים, אנויקיס, בנוסף הם אינם יוצרים מושבות באגר רך. נהפוך הוא, תאים נגועים ב-KSHV עמידים בפני אנויקיס ומושבות גדלות כאשר הם מתורבתים באגר רך. התפתחות המורפולוגיה בצורת ציר בתאי אנדותל נגועים ב-KSHV מלווה בביטוי של חלבון חביון ויראלי ORF73 ובמידה פחותה גורם תהליכי ויראלי ORF59.כאשר נדבקו ב-KSHV BAC16 המתויג בחלבון פלואורסצנטי ירוק, תאי אנדותל פיתחו מורפולוגיה בצורת ציר ומדגימים ביטוי GFP המאשר את הקשר המקרי בין זיהום KSHV בפנוטיפ הנצפה. לאחר פיתוחו, מודל תרבית תאים זה סלל את הדרך לחוקרים להעריך שינויים ב-mRNA של תא מארח וביטוי חלבון הנגרמים על ידי זיהום KSHV. כתוצאה מכך, זוהו מנגנונים פתוגניים מרכזיים העומדים בבסיס אונקוגנזה בתיווך KSHV המייצגים מטרות טיפוליות מבטיחות.אל תשכח, KSHV הוא חומר BSL-2 ויש לטפל בו עם נהלים ונהלים מתאימים לבלימת בטיחות ביולוגית.

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

תא גורמים מארח לשחק תפקיד קריטי בהקמת ותחזוקה של סרקומה של קפוסי (KS). אנו המתאר שיטות לזיהוי התא המארח גורמים להשתנות KSHV תאים הנגועים DMVEC, וכן רקמת הגידול KS. גנים נייד שינו ידי וירוס תשמש יעד פוטנציאלי (ות) עבור הרפוי הרומן.

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

שיטה של ​​מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח...

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

אנו מתארים פרוטוקול ניצול הקרינה היברידיזציה באתרו (דג) כדי להמחיש RNAs מרובים של הרפס בתוך תאים אנושיים נגועים ליקיה, או בהשעיה או חסיד. פרוטוקול זה כולל כימות של זריחה המייצרת יחס נוקלאוציטוסמטי וניתן להארכה להדמיה סימולטני של חלבונים מארחים ונגיליים עם immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של המודל הנושא הגידול העכבר כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול.

הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים במבחנה כדי להעריך את הטרנספורמציה של תאי אם אנושיים. מתוארים שלבים מפורטים לקצב התפשטות תאים, יכולת צמיחה בלתי תלויה בעיגון והפצה של שושלת תאים בתרבויות תלת-מימד עם מטריצת קרום מרתף.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

פרוטוקול זה מתאר מערכת חוץ גופית למודל זיהום ליטי דה נובו של נגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי באמצעות נגיפים שמקורם ב-BAC16. השיטה מאפשרת לחקור שכפול והפצה מוקדמים של הנגיף. ייצור הנגיף הזיהומי מכומת על ידי בדיקות יחידות זיהומיות מבוססות GFP ו-PCR בזמן אמת של גנומים נגיפיים עטופים.

ביסוס וכימות של זיהום ליטי דה נובו על ידי וירוס הרפס הקשור לסרקומה של קפוסי נטול תאים

למדו מודל תרבות תאי אנדותל לחקר טרנספורמציה ממארת המושרית על ידי KSHV. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי גנים ומנגנונים אונקוגניים מוקדמים בסרקומת קפוסי.

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

גלה סרטונים נוספים