מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין מוק מותאם גיל ומעבר בתאי אנדותל נגועים ב-KSHV כדי לאפשר מחקר של שינויים הקשורים ל-KSHV בביטוי הגנים של תאי המארח, כולל שינויים המניעים טרנספורמציה ממאירה בהקשר של בקרות מתאימות. שיטה זו יכולה לסייע בהגדרת השינויים הפתופיזיולוגיים העיקריים בביולוגיה של תא המארח המובילים לסרטן הקשור ל-KSHV, ובכך לזהות מטרות טיפוליות חדשות למניעה או טיפול במחלות. היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שהתמרה ממאירה של תאי אנדותל בעקבות זיהום ב-KSHV מתרחשת במהירות ובאופן שחזורי ומאפשרת לחקור אירועים מוקדמים בתהליך האונקוגני עם תאי ביקורת מותאמי גיל ומעבר.

למרות שמודל זה של אונקוגנזה ויראלית יכול לספק תובנה לגבי התפתחות סרקומה קפוסי, ניתן ליישם אותו גם על סוגי סרטן אחרים. מכיוון שסרקומה של קפוסי היא גידול בכלי הדם, ההשלכות של מודל תרבית תאים זה מתרחבות להבנת תהליכי מחלה אחרים המונעים על ידי אנגיוגנזה פתולוגית. כדי להתחיל, הכן וסנן מאגר TNE מעוקר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן אחסן את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס. תרבית קו תאי לימפומה ראשונית שלילית של EBV חיובי ל-KSHV BCBL-1 בבקבוק T150 מלא ב-60 מיליליטר של מדיום RPMI. שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני כדי לקבל השעיה של בערך 1 עד 1.2 פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר.

לאחר שמגיעים לצפיפות המתאימה, יש לפצל את התאים אחד לשניים עם מדיום טרי ולהוסיף PMA לריכוז סופי של 20 ננוגרם למיליליטר כדי לגרום לייצור KSHV. לאחר מכן דגרו על התרבויות למשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימי דגירה, קצרו חלקיקים נגיפיים על ידי סיבוב תרחיפי התאים ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנטים לצינור חדש. צנטריפוגה את הסופרנטנטים פעם נוספת ב-2, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר פסולת תאית. כעת, לאחר שהובהר, שכבו חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז 25% ב-TNE עם כ-30 מיליליטר של הסופרנטנט בשישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה.

צנטריפוגה את הצינורות המאוזנים ב-75,000 פעמים גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס בוואקום. לאחר השלמת הצנטריפוגה, יש לשפוך את הסופרנטנט ולספוג את שפת כל צינור כדי להסיר כמה שיותר מהנוזל. לאחר מכן השעו מחדש את הנגיף הגלולי ב-150 מיקרוליטר של מאגר TNE ואגד את כל הדגימות.

מערבבים היטב את המתלה המאוגד ומחלקים אותו ל -25 מיקרוליטר. אחסן את נגיף המלאי במינוס 80 מעלות צלזיוס. תרבית תאי אנדותל עוריים, מיקרו-וסקולריים או לימפתיים אנושיים ראשוניים במדיום EGM בבקבוק T75.

שמור על תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני עד להגעה למפגש של כ-50%. לפני התמרת תאי אנדותל, תרבית תאי PA317 LXSN 16E6E7 בבקבוק תרבית תאים T150 מלא ב-20 מיליליטר DMEM ב-37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני. לאחר השגת מפגש של כ-90%, החלף את המדיום מתרבית התאים PA317 ב-16 מיליליטר של מדיום טרי ודגר את התאים למשך הלילה.

לאחר דגירה של לילה, אוספים את המדיום מתרבית התאים PA317 ומבהירים אותו על ידי צנטריפוגה ב-300 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. החלף את מדיום ה-EGM מתרבית תאי אנדותל קונפלונטית של 50% ב-12 מיליליטר של מדיום PA317 המובהר. דגרו על התאים למשך ארבע שעות.

לאחר מכן החלף שישה מיליליטר של מדיום PA317 בשישה מיליליטר של מדיום EGM טרי ודגר על התאים למשך הלילה. לאחר מכן, הסר את המדיום מתרבית תאי האנדותל והאכיל את התאים ב-12 מיליליטר EGM טרי. המשיכו לדגור על התאים למשך 48 שעות נוספות.

כדי לתרבת תאי אנדותל, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 12 מיליליטר PBS ללא קטיונים. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית מסחרית ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה של התאים ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הגלולה, השעו מחדש את התאים במדיום EGM טרי וחלקו את התרחיף באופן שווה לשלוש צלוחיות T75. התאם את נפח התרבויות ל -12 מיליליטר EGM לבקבוק. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוגרם למיליליטר של G418 כדי לבחור תאי אנדותל מותמרים.

קצור את תאי האנדותל המומרים על ידי עיכול אנזימטי כפי שהוצג קודם לכן. השעו מחדש את כדור תאי האנדותל במיליליטר אחד של מדיום EGM. לאחר מכן מערבבים חמישה מיקרוליטרים של תרחיף התא עם 45 מיקרוליטר של תמיסת טריפן כחולה וסופרים תאים ברי קיימא באמצעות המוציטומטר.

זרע 2.5 כפול 10 עד התאים החמישיים ברי קיימא בשני מיליליטר של מדיום EGM לבאר של צלחת של שש בארות. למחרת, הסר את מדיום ה- EGM ושטוף את התאים בכל באר עם שלושה מיליליטר PBS עם סידן ומגנזיום. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר מדיום EBM לכל באר.

כדי להדביק תאים ב-KSHV, הוסיפו חמישה עד 20 מיקרוליטר של מלאי הנגיף לכל באר וסובבו את הצלחת כדי לערבב את התרחיפים. הוסף נפח שווה של מאגר TNE לכל באר המכילה תאים נגועים מדומים. לאחר צנטריפוגה של הצלחת בחום של 400 פעמים גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, דגרו אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.

לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של מדיום EGM לכל באר ודגרו על התרבויות למשך הלילה. לאחר הדגירה, הסר את מדיום ה- EGM מכל באר והחלף אותו בשני מיליליטר EGM טרי. כאשר התאים מגיעים למפגש של כ-90%, קצרו אותם על ידי עיכול אנזימטי כפי שהוצג קודם לכן.

אחסנו את התאים משלוש בארות לבקבוק T75 המסומן במספר המעבר הכולל במעבר לאחר ההדבקה. לפני הבדיקה או ההקפאה, הרחב תרביות תאי אנדותל מדומות ונגועות ב-KSHV על ידי פיצול אחד עד שלושה לשני מעברים נוספים לפחות. מוצגת כאן תמונה מיקרוסקופית של תאי אנדותל נגועים מדומים החושפים מראה מרוצף קלאסי.

חלוקת התאים בתאים אלה מעוכבת במגע כאשר התרבית מגיעה למפגש. תאי אנדותל נגועים ב-KSHV מפתחים מורפולוגיה מוארכת דמוית ציר המזכירה תאי ציר סרקומה של קפוסי. בניגוד לתאים הנגועים המדומה, תאי אנדותל נגועים ב-KSHV ממשיכים להתרבות גם כאשר הם מגיעים למפגש המוביל להתפתחות מוקדי תאים רב-שכבתיים.

כאשר מאבדים מגע עם המצע, תאי אנדותל נגועים מדומה עוברים מוות של תאים אפופטוטיים, אנויקיס, בנוסף הם אינם יוצרים מושבות באגר רך. נהפוך הוא, תאים נגועים ב-KSHV עמידים בפני אנויקיס ומושבות גדלות כאשר הם מתורבתים באגר רך. התפתחות המורפולוגיה בצורת ציר בתאי אנדותל נגועים ב-KSHV מלווה בביטוי של חלבון חביון ויראלי ORF73 ובמידה פחותה גורם תהליכי ויראלי ORF59.

כאשר נדבקו ב-KSHV BAC16 המתויג בחלבון פלואורסצנטי ירוק, תאי אנדותל פיתחו מורפולוגיה בצורת ציר ומדגימים ביטוי GFP המאשר את הקשר המקרי בין זיהום KSHV בפנוטיפ הנצפה. לאחר פיתוחו, מודל תרבית תאים זה סלל את הדרך לחוקרים להעריך שינויים ב-mRNA של תא מארח וביטוי חלבון הנגרמים על ידי זיהום KSHV. כתוצאה מכך, זוהו מנגנונים פתוגניים מרכזיים העומדים בבסיס אונקוגנזה בתיווך KSHV המייצגים מטרות טיפוליות מבטיחות.

אל תשכח, KSHV הוא חומר BSL-2 ויש לטפל בו עם נהלים ונהלים מתאימים לבלימת בטיחות ביולוגית.