Name: LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: חקור תפקוד חלבונים ורשתות אינטראקציה באמצעות יצירת שורות תאים יציבות עם תג LAP ב-HEK293. שיטה זו מאפשרת ניתוח רב-עוצמה של חלבונים ומסלולים ביולוגיים בצורה מבוקרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF-MCB1243645 של הקרן הלאומית למדע (JZT), כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את העמדות של הקרן הלאומית למדע. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

<ol><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+for+the+localization+and+tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans.</a> Sci STKE. , (2005).</li>
<li>Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+tagged+stable+cell+lines+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis.</a> Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).</li>
<li>LaCava, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+proteomics+to+study+endogenous+protein+complexes%3A+pointers%2C+pitfalls%2C+preferences+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives.</a> Biotechniques. 58, 103-119 (2015).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>ORFeome Collaboration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ORFeome+Collaboration%3A+a+genome-scale+human+ORF-clone+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource.</a> Nat Methods. 13, 191-192 (2016).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORFeome+cloning+and+systems+biology%3A+standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).</li>
<li>Lamesch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hORFeome+v3.1%3A+a+resource+of+human+open+reading+frames+representing+over+10%2C000+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes.</a> Genomics. 89, 307-315 (2007).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ORFeome+version+1.1%3A+a+platform+for+reverse+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics.</a> Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).</li>
<li>Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%26%2334%3Bin-out%26%2334%3B+strategy+using+gene+targeting+and+FLP+recombinase+for+the+functional+dissection+of+complex+DNA+regulatory+elements%3A+analysis+of+the+beta-globin+locus+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An &#34;in-out&#34; strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).</li>
<li>Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tool+for+efficient+transfection+of+dog+and+human+thyrocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture.</a> Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).</li>
<li>Senese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+insertion+in+STARD9%27s+motor+domain+regulates+its+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability.</a> Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).</li>
<li>Gholkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Linked-Intellectual-Disability-Associated+Ubiquitin+Ligase+Mid2+Interacts+with+Astrin+and+Regulates+Astrin+Levels+to+Promote+Cell+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division.</a> Cell Rep. 14, 180-188 (2016).</li>
<li>Graumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+of+tandem+affinity+purification+MudPIT+to+pathway+proteomics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).</li>
<li>Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoflourescent+staining+of+cytoplasmic+and+spindle+microtubules+in+mouse+fibroblasts+with+antibody+to+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).</li>
<li>Gholkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tctex1d2+associates+with+short-rib+polydactyly+syndrome+proteins+and+is+required+for+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).</li>
<li>Cheung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+the+Mammalian+Katanin+Family+of+Microtubule-severing+Enzymes+Defines+Katanin+p80+subunit+B-like+1+%28KATNBL1%29+as+a+Regulator+of+Mammalian+Katanin+Microtubule-severing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing.</a> Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).</li>
<li>Torres, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STARD9%2FKif16a+Kinesin+Associates+with+Mitotic+Microtubules+and+Regulates+Spindle+Pole+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly.</a> Cell. 147, 1309-1323 (2011).</li>
<li>Garcia-Gonzalo, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transition+zone+complex+regulates+mammalian+ciliogenesis+and+ciliary+membrane+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition.</a> Nat Genet. 43, 776-784 (2011).</li>
<li>Chih, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ciliopathy+complex+at+the+transition+zone+protects+the+cilia+as+a+privileged+membrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain.</a> Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Poser, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+TransgeneOmics%3A+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mammalian+centrosome+structure+using+BioID+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation.</a> Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioID%3A+a+screen+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">BioID: a screen for protein-protein interactions.</a> Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).</li>
<li>Gupta, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Dynamic+Protein+Interaction+Landscape+of+the+Human+Centrosome-Cilium+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface.</a> Cell. 163, 1484-1499 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר מתאר השיבוט של גני העניין לתוך וקטור תיוג LAP, הדור של שורות תאי יציבות מתויג LAP מושרים, והטיהור של קומפלקסי חלבונים-tagged LAP עבור ניתוחי proteomic. עם כל כבוד גישות LAP / TAP תיוג אחרים, פרוטוקול זה התייעל להיות תואם גישות תפוקה גבוהה למפה אינטראקציות לוקליזציה חלבון חלבונים בתוך כל נתיב תאי. גישה זו יושמה באופן נרחב על האפיון הפונקציונלי של חלבונים קריטיים עבור התקדמות מחזור התא, הרכבת ציר mitotic, הומאוסטזיס מוט ציר, ואת ciliogenesis שם כמה ו סייעה להבנה כיצד ויסות לא תקין של חלבונים אלה יכול להוביל למחל אדם 15, 16,19,20. לדוגמא, הקבוצה שלנו לאחרונה מנוצלת במערכת זו כדי להגדיר את הפונקציה והרגולציה של kinesin mitotic STARD9 (מטרת סרטן המועמד) ב הרכבת ציר 15,21, להגדירקישור מולקולרי חדש בין שרשרת אור dynein Tctex1d2 ותסמונות צלע לפולידקטיליות קצרות (SRPS) 19, ולהגדיר קישור מולקולרי חדש להבנה איך מוטציה של אנזים היוביקוויטין Mid2 יכולה להוביל צמודי X רוחניים מוגבלויות 16. מעבדות אחרות לא גם בהצלחה ליישם שיטה זו, כוללת אחד אשר קבעה כי Tctn1, רגולטור של איתות עכבר קיפוד, היה חלק ממכלול החלבון הקשורים ciliopathy כי בהרכב הממברנה ריסי מוסדר ciliogenesis באופן תלוי-רקמות 22,23. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב דיסקציה של כל נתיב תאי. שלב קריטי פרוטוקול זה הוא הבחירה של שורות תאים יציבות מתויג LAP כי הם hygromycin עמיד. זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי להבטיח כי כל התאים בצלחת המלאה מתים לפני בחירת מוקדים בצלחת ניסיוני עבור הגברה. Hygromycin ניתן גם אדהד במהלך culturing תא השיגרתי של שורות תאי יציבות מתויג LAP כדי להבטיח עוד שכל התאים לשמור על הגן מתויג-LAP עניין באתר FRT. אנו מזהירים כי לא כל-tagged חלבונים LAP יהיה פונקציונלי וכי חשוב יש מבחני במקום שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק את תפקוד החלבון. דוגמאות של מבחנים משמשים לבדיקת תפקוד חלבון כוללות הצלת פנוטיפים הנגרמת siRNA וב מבחני פעילות במבחנה. כדי לטפל בבעיות פוטנציאליות של התוספת של תג-LAP גדול, יש לנו שנוצרנו בעבר וקטורי TAP-תג תואמים עם מערכת זו המכילה תגים קטנים, כמו דגל, אשר נוטים פחות לעכב היטב את הפונקציה ולוקליזציה של החלבון של עניין 4. בנוסף, וקטורים התיוג LAP קיימים להפקת חלבונים-tagged LAP C- מסוף או C- מסוף-tagged חלבונים TAP התואמות מערכת זו, אשר ניתן להשתמש בהם במקרים בהם תג LAP / TAP אינו נסבל על N -terminus של חלבון. בנוסף, הריכוזי ה מלח וחומרי ניקוי מאגרי הטיהור (LAPX N) יכולים להיות שונים כדי להגדיל או להקטין את החמרת הטיהור אם אף אחד או יותר מדי אינטראקציות הם נצפו. באופן דומה, הליך טיהור זיקת טנדם הוא מחמיר יותר מאשר יחיד הליכי טיהור ו interactors החלש עלול ללכת לאיבוד, ולכן ערכת טיהור יחידה יכולה לשמש כאשר מעט או לא interactors מזוהה. חשוב לציין כי גישות תיוג epitope GFP אחרות קיימות המאפשרים חלבון ה- GFP בקנה מידה גדולה תיוג ללימודי לוקליזציה חלבון וטיהור 24,25. אלה כוללים את הגישה BAC TransgenOmics אשר מנצל כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי לבטא גנים-tagged GFP עניין מהסביבה מולדתם המכיל את כל האלמנטים רגולטוריות, אשר מחקה ביטוי גנים אנדוגניים 24. לאחרונה, CAS9 / רנ&quot;א חד-מודרך (sgRNA) מתחמי ribonucleoprotein (RNPs) שימשו לסייםogenously לתייג גנים של עניין עם מערכת מפוצלת GFP המאפשרת את הביטוי של גנים-tagged GFP מן הלוקוסים הגנומי אנדוגני שלהם 25. למרות ששתי הגישות הללו לאפשר את הביטוי של חלבונים המתויגים בתנאים אנדוגני, לעומת פרוטוקול LAP התיוג המתואר כאן, הם אינם מאפשרים ביטוי מושרה ו מתכונן מהגנים מתויגים עניין. בנוסף, הם עדיין צריכים להיות מיושמים epitope טנדם תיוג TAP. כמו כן, חשוב לציין כי מערכות תיוג אחרות יכולות גם להיות שונות כדי להיות תואם למערכת המתוארת כאן ליצירת שורות תאי יציבות מתויג epitope מושרים. לדוגמא, זיהוי ביוטין תלוי קרבה (BioID) צבר תשומת לב רבה בשל יכולתו להגדיר ביחסים במרחב ובזמן בין חלבוני אינטראקצית 26. טכניקה זו מנצלת בשילובי חלבון זן מופקר של האנזים ביוטין coli Escherichia הבירה, אשר biotinylateזה כל חלבון ברדיוס ~ 10 ננומטר של האנזים. החלבונים biotinylated אז הם זיקה מטוהרים באמצעות לכידת ביוטין אפיניות ניתוח מעבדתי של הרכב על ידי ספקטרומטריית מסה. בירה תהיה biotinylate חלבון כלשהו בסמיכות, אפילו זמנית, מה שהופך אותו מתאים במיוחד לאיתור שותפים באינטראקציה חלש בתוך 27 מורכבים. בנוסף, את ערכת הטיהור אינה מחייבת כי אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני להישאר שלמות יכולות להתבצע בתנאי denaturing, ובכך להקטין את שיעור תוצאות חיוביות שגויות. בתוך הפרוטוקול הנוכחי שלנו, ההחלפה של וקטור pGLAP1 ידי וקטור בירת תיוג יכולה להפוך מערכת זו מזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על זיקת גילוי אותם על סמך הקרבה. מערכת כזו תהיה יתרון מאוד לאיתור אינטראקציות חלבון חולפות כפי שקורה בין אינטראקציות אנזים-מצע רבים למיפוי inte חלבוני spatiotemporalractions בתוך מבנים המוגדרים בוצע עבור centrosome ואת הריסים 26,28.

כדי לחקור את התפקוד התאי של חלבון לא מאופיין, חשוב לקבוע את הלוקליזציה התת-תאית המרחבית-זמנית שלו ואת שותפי החלבון האינטראקטיביים שלו. באופן מסורתי, תגי אפיטופ בודדים וטנדמים המאוחים לקצה N או C של חלבון מעניין שימשו כדי להקל על לוקליזציה של חלבונים ומחקרי אינטראקציה בין חלבונים. לדוגמה, טכנולוגיית טיהור הזיקה הטנדם (TAP) אפשרה בידוד של קומפלקסים של חלבונים מקומיים, אפילו אלה שנמצאים בשפע נמוך, הן בשורות תאי שמרים והן ביונקים1,2. טכנולוגיית הלוקליזציה וטיהור הזיקה (LAP), היא פיתוח עדכני יותר המשנה את הליך ה-TAP כך שיכלול רכיב לוקליזציה באמצעות הכנסת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) כאחד מתגי האפיטופ3. גישה זו העניקה לחוקרים הבנה מעמיקה יותר של הלוקליזציה התת-תאית של חלבון בתאים חיים תוך שמירה על היכולת לבצע טיהורי TAP מורכבים כדי למפות רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון. 
עם זאת, ישנן בעיות רבות הקשורות לשימוש בטכנולוגיות TAP/LAP שפגעו בשימוש הנרחב בהן בתאי יונקים. לדוגמה, משך הזמן הדרוש ליצירת קו תאים יציב המבטא חלבון מתויג TAP/LAP מעניין; המסתמך בדרך כלל על שיבוט הגן המעניין לווקטור ויראלי ובחירת אינטגרנטים יציבים של תא בודד עם רמת הביטוי הרצויה. בנוסף, מסלולים תאיים רבים רגישים לביטוי יתר של חלבון מכונן (אפילו ברמות נמוכות) ויכולים לעצור תאים או לעורר מוות תאי לאורך זמן, מה שהופך את יצירת קו התאים היציב TAP/LAP לבלתי אפשרי. אילוצים אלה ואחרים מנעו ממתודולוגיות LAP/TAP להפוך למערכות בעלות תפוקה גבוהה ללוקליזציה של חלבונים והבהרת קומפלקס חלבונים. לכן, היה עניין רב בפיתוח מערכת תיוג LAP-תפוקה גבוהה הניתנת להשראה עבור תאי יונקים המנצלת את החידושים הנוכחיים בטכנולוגיות שיבוט וקווי תאים. 
כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת קווי תאים יציבים עם חלבונים מתויגים ב-LAP הניתנים להשראת דוקסיציקלין/טטרציקלין (Dox/Tet) המיישמים התקדמות הן בטכנולוגיות שיבוט והן בטכנולוגיות קו תאים של יונקים. גישה זו מייעלת את רכישת הנתונים בכל הנוגע ללוקליזציה תת-תאית של חלבון מתויג LAP, טיהור קומפלקס חלבונים וזיהוי חלבונים אינטראקטיביים4. למרות שפרוטאומיקה של זיקה משתמשת במגוון רחב של טכניקות להבהרת קומפלקס חלבונים5, הגישה שלנו מועילה להאצת הזיהוי של קומפלקסים אלה ורשתות האינטראקציה המקוריות שלהם והיא ניתנת לתיוג חלבונים בתפוקה גבוהה הדרוש לחקירת מסלולים ביולוגיים מורכבים המכילים מספר רב של מרכיבי חלבון. המפתח לגישה זו הוא התקדמות באסטרטגיות שיבוט המאפשרות נאמנות גבוהה ושיבוט מזורז של גני מטרה למערך של וקטורים לביטוי גנים במבחנה, באורגניזמים שונים כמו חיידקים ובקולו-וירוס, ובתאי יונקים6,7. בנוסף, שיתוף הפעולה של ORFeome שיבט אלפי מסגרות קריאה פתוחות מאומתות ברצף בווקטורים המשלבים את ההתקדמות הללו בשיבוט, הזמינות לקהילה המדעית8-11. במערכת שלנו, וקטור תיוג ה-LAP של pGLAP1 מאפשר שיבוט בו-זמני של מספר רב של שיבוטים, מה שמקל על תיוג LAP בתפוקה גבוהה. הליך שיבוט מזורז זה משולב בגישה יעילה ליצירת קווי תאים עם גנים מעניינים מתויגים ב-LAP המוכנסים בלוקוס גנומי יחיד שנקבע מראש. זה עושה שימוש בקווי תאים המכילים אתר יעד זיהוי יחיד (FRT) בתוך הגנום שלהם, שהוא אתר האינטגרציה של גנים מתויגים LAP. קווי תאים אלה מבטאים גם את מדכא הטטרציקלין (TetR) שנקשר למפעילי Tet (TetO2) במעלה הזרם של הגנים המתויגים ב-LAP ומשתיק את ביטוים בהיעדר Dox/Tet. זה מאפשר ביטוי השראת Dox/Tet של החלבון המתויג LAP בכל זמן נתון. היכולת של ביטוי חלבון מתויג LAP הניתן להשראה היא קריטית, מכיוון שמסלולים תאיים רבים רגישים לרמות החלבונים הקריטיים השולטים במסלול ויכולים לעצור את צמיחת התאים או לעורר מוות תאי כאשר חלבונים אלה מתבטאים יתר על המידה, אפילו ברמות נמוכות, מה שהופך את היצירה של קווי תאים יציבים שאינם ניתנים להשראה לבלתי אפשרית12.

<table><tbody><tr><td>ערכת ליבה Flp-In T-REx</td> ערכת <td>Invitrogen</td><td>K6500-01</td><td>ליצירת קווי תאים המכילים אתר FRT וביטוי TrtR</td></tr><tr><td>PETG, 5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-734</td><td>בקבוק רולר לגידול תאים</td></tr><tr><td>PETG, 2.5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-420</td><td>בקבוק רולר לגידול תאים</td></tr><tr><td>מערמי תאים</td><td>Corning CellSTACK</td><td>3271</td><td>מערם תאים לגידול תאים</td></tr><tr><td>500 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td>431123 צינורות לקצירת תאים</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>ארנב נוגדן נגד GFP</td></tr><tr><td>חרוזי חלבון A</td><td>Biorad</td><td>156-0006</td><td>משמש כמטריצה לצימוד נוגדנים נגד GFP</td></tr><tr><td>Dimethylpimelimidate (DMP)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>21667</td><td>משמש לצימוד נוגדנים נגד GFP לחרוזי חלבון</td></tr><tr><td>A צינורות TLA100.3</td><td>Beckman</td><td>349622</td><td>Tubes לצנטריפוגה של ליזטים חלבונים במהלך שלב הפינוי</td></tr><tr><td>פרוטאז TEV</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td>משמש לפיצול תג GFP מחלבונים מתויגים ב-N מסוף</td></tr><tr><td>Precession GE</td><td>Healthcare</td><td>27-0843-01</td><td>משמש לפיצול תג GFP מחלבונים מתויגים ב-C-terminal LAP חלבון</td></tr><tr><td>S agarose</td><td>Novagen</td><td>69704</td><td>משמש כמטריצת זיקה שנייה במהלך הטיהור של קומפלקסי חלבון מתויגים ב-LAP</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAquick DNA</td><td>Qiagen</td><td>28704/28706</td><td>לשימוש בטיהור מוצרי PCR מג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>BP clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td>משמש לשיבוט מוצרי ORF PCR לתוך וקטור המעבורת pDONR221</td></tr><tr><td>LR clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>משמש לשיבוט ה-ORF של הגן המעניין לתוך וקטור התיוג pGLAP1 LAP</td></tr><tr><td>ccdB Survival 2 T1R E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>A10460</td><td>משמש לקידום וקטורי מעבורת ווקטורים ריקים של pGLAP</td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td>מגיב טרנספקציה להעברת וקטורים לתאים אנושיים</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Invitrogen</td><td>Q100-19</td><td>תרופה להשראת ביטוי חלבון המעורר Dox/Tet&nbsp;</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>קלונטק</td><td>631311</td><td>תרופה להשראת ביטוי חלבון מעורר Dox/Tet&nbsp;</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td>תרופה לבחירת אינטגרנטים יציבים מתויגים LAP</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Corning</td><td>61-176-RG</td><td>תרופה לבחירת מושבות חיידקים עמידות לקנמיצין</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td>תרופה לבחירת מושבות חיידקים עמידות לאמפיצילין</td></tr><tr><td>4-20% Tris Glycine SDS-PAGE ג'לים</td><td>Biorad</td><td>4561094</td><td>משמש להפרדת דגימות חלבון וטיהור סופי של תג LAP מבהיר</td></tr><tr><td>את ערכת Silver Stain Plus Biorad</td><td></td><td>1610449</td><td>משמש לצביעת כסף של דגימות ודגימות מתויגות LAP שנאספו לאורך תהליך הטיהור&nbsp;</td></tr><tr><td>Coomassie כתם כחול</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>משמש לצביעה של ג'לים SDS-PAGE כדי להמחיש טיהורים מתויגים ב-LAP וחיתוך רצועות חלבון, תואם ספקטרומטריית</td></tr><tr><td>מסה וקטור מעבורת pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td>וקטור מעבורת לשיבוט ה-ORFs של גנים מעניינים</td></tr><tr><td>Flippase המבטא וקטור pOG44</td><td>Invitrogen</td><td>V600520</td><td>וקטור המבטא את הרקומבינאז של Flippase לשילוב גנים מתויגים ב-LAP בגנום של אתר FRT המכיל קווי תאים</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td>משמש להגברת PCR של ה-ORFs של גנים מעניינים</td></tr><tr><td>4x מאגר דגימת Laemmli</td><td>Biorad</td><td>1610747</td><td>מאגר דגימה לסילוק קומפלקסים חלבונים מטוהרים מתויגים ב-LAP ממדיית מרק</td></tr><tr><td>Luria (LB) מטריצת החרוזים</td><td>פישר</td><td>BP9723-2</td><td>משמש לגידול DH5 ואלפא; ערכת</td></tr><tr><td>מיני-הכנה ל-DNA</td> של חיידקים <td>Promega</td><td>A1222</td><td>משמש לייצור מיני-הכנה של פלסמיד DNA</td></tr><tr><td>מדיה DMEM/F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td>לגידול תאים אנושיים Hek293</td></tr><tr><td>FBS חסר Tet</td><td>Altanta Biologicals</td><td>S10350</td><td>משמש לייצור מדיה -Tet DMEM/F12 לייצור וגידול קווי תאים יציבים הניתנים להשראה עם תיוג LAP</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>היקלון</td><td>SH30042.01</td><td>להרמת מוקדי תאי Hek293 מצלחות</td></tr><tr><td>טבליות מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>משמש לייצור חוצצי פרוטוקול, ללא EDTA</td></tr><tr><td>10% נוניל פנוקסיפוליאתוקסילאתנול&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>נתרן בוראט</td><td>פישר</td><td>S249-500</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>פישר</td><td>A78-500</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>משמש להכנת מאגרי פרוטוקול</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>משמש לייצור מאגרי פרוטוקולים</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>משמש לייצור מאגרי פרוטוקול</td></tr></tbody></table>

lap-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks

קומפלקסים מרובי חלבונים, במקום חלבונים בודדים הפועלים בבידוד, שולטים לעתים קרובות במסלולים מולקולריים המווסתים את ההומאוסטזיס התאי. בהתבסס על עיקרון זה, טיהור החלבונים הקריטיים הנדרשים לתפקוד מסלולים אלה יחד עם שותפיהם המקומיים האינטראקטיביים לא רק איפשר מיפוי של מרכיבי החלבון של מסלולים אלה, אלא גם סיפק הבנה עמוקה יותר של האופן שבו חלבונים אלה מתאמים כדי לווסת מסלולים אלה. בהקשר זה, הבנת הלוקליזציה המרחבית-זמנית של חלבון ורשת האינטראקציה בין חלבון לחלבון יכולה לסייע בהגדרת תפקידו בתוך מסלול, כמו גם כיצד ויסות שגוי שלו עלול להוביל לפתוגנזה של מחלה. כדי לענות על צורך זה, מספר גישות לטיהור חלבונים כגון טיהור זיקה טנדם (TAP) ולוקליזציה וטיהור זיקה (LAP) תוכננו ונעשה בהם שימוש מוצלח. עם זאת, על מנת ליישם גישות אלה לניתוחים פרוטאומיים בקנה מידה של מסלול, יש להשלים אסטרטגיות אלה עם פיתוחים טכנולוגיים מודרניים בשיבוט ויצירת קווי תאים יציבים של יונקים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת קווי תאים יציבים הניתנים להשראה אנושית מתויגים על ידי LAP לחקירת לוקליזציה תת-תאית של חלבון ורשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון. גישה זו יושמה בהצלחה על דיסקציה של מסלולים תאיים מרובים כולל חלוקת תאים ותואמת לניתוחים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה.

כדי להדגיש את התועלת של מערכת זו, את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של חלבון מחייב microtubule טאו שובט לתוך וקטור הסעות ידי הגברה ORF טאו עם פריימרים המכיל אתרים attB1 ו attB2 (טבלה 1) ו דוגרים המוצרים PCR עם וקטור הסעות וכן recombinase שמתווך החדרת המוצרים PCR לתוך וקטור הסעות. מוצרי התגובה שמשו להפוך חיידקי DH5α 13 ו- DNA פלסמיד ממושבות עמידות Kanamycin היה רצף כדי להבטיח חיבור טאו. וקטור תוקף רצף הסעות-טאו ששימש אז להעביר את ORF טאו לתוך וקטור pGLAP1, אשר התמזגו טאו ב מסגרת עם LAP (EGFP-TEV-S-חלבון) תג, על ידי דוגרים וקטור-טאו הסעות עם וקטור pGLAP1 ואת recombinase שמתווך העברת ORF מפני שיטת הסעות pGLAP1. מוצרי התגובה שמשו להפוך חיידקי DH5α13 ו- DNA פלסמיד ממושבות עמידות אמפיצילין היה רצף על מנת להבטיח כי היתוך LAP-טאו היה בתוך מסגרת. רצף תוקף pGLAP1-LAP-טאו היה שותף transfected אז עם וקטור המבטא את אנזים רקומבינציה flippase לתאי HEK293 שהכיל יעד הכרת flippase יחיד (FRT) באתר בתוך הגנום שלהם, המהווה את האתר של אינטגרציה עבור גני LAP-tagged 14. גם שורת תאים זו ביטאה את TetR הנקשרת מפעילי ט במעלה הזרם של גנים מתויג LAP ושתיקות הביטוי שלהם בהעדר ט / Dox. integrants יציבה נבחרו עם התקשורת -Tet DMEM / F12 עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin במשך 5 ימים. מוקדי תאים בודדים hygromycin עמיד נבצרו ידי הוספת 20 μl של טריפסין על גבי pipetting למעלה ולמטה 2 פעמים. תאים הונחו בצלחת 24 גם והורחבו נמשכה צמיחת תקשורת -Tet DMEM / F12. כדי לוודא תא hygromycin העמידהים היה מסוגל לבטא LAP-טאו, HEK293 תאי LAP-טאו היו מושרים עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר Dox במשך 15 תמציות hr וחלבון הוכנו מ הלא מושרה ואת מושרה Dox תאים. תמציות אלה הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועבר קרום PVDF, ו immunoblotted עבור GFP ו טובולין כמו טעינה מלאה. כפי שניתן לראות באיור 4 א, LAP-טאו (דמיינו עם נוגדנים אנטי GFP) באה לידי ביטוי רק בנוכחות Dox. כדי לאמת כי LAP-טאו היה מקומי כראוי ציר microtubule mitotic במהלך מיטוזה, כפי שהוכיחו בעבר עבור טאו אנדוגני 18, HEK293 תאי LAP-טאו היו מושרים עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר Dox במשך 15 שעות ותאים תוקנו עם 4% paraformaldehyde ושיתוף מוכתם עבור DNA (Hoechst 33342) ו microtubules (נוגדנים נגד טובולין). באופן עקבי, LAP-טאו היה מקומי אל ציר mitotic במהלך metaphase של מיטוזה (איור 4B). כדי לוודא LAP-טאו וחלבוני האינטראקציה שלה יכול להיות מטוהר עם sys זהTEM, HEK293 תאים LAP-טאו גדלו בקבוקי רולר ל ~ 70% confluency, המושרה עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​Dox במשך 15 שעות, שנקטפו על ידי תסיסה, lysed עם חיץ LAP300, ו LAP-טאו היה מטוהרים באמצעות פרוטוקול לעיל. Eluates מן טיהור LAP-טאו נפתרו על ידי SDS-PAGE ו הג'ל היה מוכתם כסף. איור 4C מראה את טיהור LAP-טאו, המסומנים בכוכבית היא LAP-טאו וכמה להקות אחרות מעידים על חלבוני אינטראקצית טאו ניתן לראות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig1.jpg"> איור 1: סקירה כללית של דור שורות תאים יציבות ועין מתנהלת-tagged LAP לכל חלבון עניין. מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של גנים של עניין הם מוגברים עם אתרי attB1 ו attB2 איגוף 5 'ו 3' הרצפים סוף, בהתאמה (רצפים פריימר ניתנים טבלה 1) ו משובטים לתוך וקטור ההסעות. וקטורי הסעות אומת רצף עם הגן של עניין משמשים לאחר מכן כדי להעביר את הגן של עניין לתוך וקטור pGLAP1. רצף אומת וקטור pGLAP1 עם הגן של עניין הוא אז שיתוף transfected עם הווקטור המכיל את recombinase flippase לתוך קו התא הרצוי המכיל יעד הכרת flippase יחיד (FRT) באתר בתוך הגנום שלהם, המהווה את האתר של אינטגרציה עבור LAP גני -tagged. שורות תאים אלה גם לבטא את מדכא ט (TetR) הנקשרת מפעילי ט (TETO 2) במעלה הזרם של גנים מתויג LAP ושתיקות הביטוי שלהם בהעדר ט / Dox. הגן-tagged LAP של ריבית recombined מכן לתוך אתר FRT ו integrants היציבה נבחרת עם hygromycin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2 "src =" / files / ftp_upload / 54,870 / 54870fig2.jpg "/&gt; איור 2: סקירה של בקשות שורות תאים יציבות מתויג LAP. LAP-tagged שורות תאי יציבות מושרות הם המושרה להביע את חלבון LAP-tagged עניין ידי תוספת Dox ויכולות להיות מסונכרנות בשלבים שונים של מחזור התא או יכולות להיות מגורה עם כימיקלים או הליגנדים כדי להפעיל כל מסלול איתות רצויה. לוקליזציה subcellular של חלבון LAP-tagged עניין יכולה להיות מנותחת על ידי תא חי או הדמית תא קבועה. חלבונים-tagged LAP יכול גם להיות מטוהרים זיקה טנדם וחלבונים אינטראקציה שלהם ניתן לזהות על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS / MS). לבסוף, cytoscape יכול לשמש כדי ליצור רשת אינטראקציה בין חלבונים של חלבון הפיתיון. Dox מציין דוקסיציקלין, IP מציין immunoprecipitate, EGFP מציין משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק, Tev מציין אתר מחשוף פרוטאז TEV, ו- S מציין תג S.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig3.jpg"> איור 3: מבט כולל של ביטוי חלבון LAP-tagged, טיהור והכנת ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול יש 9 שלבים: 1) צמיחה אינדוקציה של ביטוי חלבון LAP-tagged, 2) קציר התא תמוגה, 3) הכנת lysates, 4) עקידת lysates חרוזים אנטי GFP, 5) מחשוף פרוטאז TEV של GFP-תג, 6) עקידת lysates חרוזים S-חלבון, 7) elution של חלבון הפיתיון וחלבונים אינטראקציה, ו 8-9) הכנת דגימות עבור ניתוחים proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig4.jpg"> איור 4: אימות ביטוי LAP-טאו. (א) כתם המערבי (WB) ניתוח של דגימות חלבון מן המושרה הלא המושרה ואת Dox LAP-טאו HEK293 תאים נחקר עם אנטי GFP ואנטי-טובולין נוגדנים לגילוי החלבון טאו-tagged LAP ואת טעינה מלאה טובולין, בהתאמה. שים לב LAP-טאו מתבטאת רק כאשר התאים הם המושרה עם Dox. (ב) בתאים mitotic להביע LAP-טאו קובעו שיתוף מוכתם עבור DNA (Hoechst 33342) ו טובולין (ג'קוזי) עם נוגדנים נגד טובולין ואת לוקליזציה subcellular של טאו LAP נותח על ידי microcopy הקרינה. שים לב LAP-טאו localizes לקטבים ציר ציר mitotic במהלך מיטוזה. (C) כסף מוכתם ג'ל של טיהור LAP-טאו. MW מציין משקל מולקולרי, CL מציין lysates פינה, ו- E הודיתeluates הסופי אטס. דוגמאות היו לרוץ על SDS-PAGE 4-20% ואת ג'ל הוכתם כסף לדמיין חלבונים מטוהרים. שים לב הלהקה המתאימה LAP-טאו מסומנת בכוכבית וכמה להקות אחרות המתאים חלבוני שיתוף לטיהור ניתן לראות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> היתוך N-terminal </td><td></td></tr><tr><td> קָדִימָה </td><td> 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> לַהֲפוֹך </td><td> 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> היתוך C-terminal </td><td></td></tr><tr><td> קָדִימָה </td><td> 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> לַהֲפוֹך </td><td> 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr></tbody></table> טבלה 1: קדימה לאחור תחל עבור הגברה ORFs או ריבית כדי להכניסו הסעות וקטור. אתרי attB מודגשים באותיות קידוש לבנות, GSN מציין כי יותר מ -18 נוקלאוטידים גנים ספציפיים מתווספים פריימר. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> שלב </td><td> טֶמפֶּרָטוּרָה </td><td> זְמַן </td></tr><tr><td colspan="2"> denaturation הראשונית </td><td> 94 ° C </td><td> 2 דקות </td></tr><tr><td rowspan="3"> מחזורי הגברת PCR (35) </td><td> לְפַגֵל </td><td> 94 ° C </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td> לְחַשֵׁל </td><td> 55 ° C (תלוי פריימר Tm) </td><td> 30 שניות </td></tr><tr><td> לְהַאֲרִיך </td><td> 72 ° C </td><td> 1 דקות / kb </td></tr><tr><td colspan="2"> לְהַחזִיק </td><td> 4 ° C </td><td> ללא הגבלת זמן </td></tr></tbody></table> טבלה 2: PCR תנאי ההגברה של ORFs עניין. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וֶקטוֹר </td><td> פריימר רצף קדימה </td><td> הפוך רצף פריימר </td></tr><tr><td> וקטור הסעות </td><td> 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 " </td><td> 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 " </td></tr></tbody></table> טבלה 3: קדימה ההפוך הרצף Primers עבור שירות ההסעות של הווקטור. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תְעוּדַת זֶהוּת </td><td> מִבְנֶה </td><td> שֶׁל הַהוֹרִים </td><td> מְקַדֵם </td><td> מיל Bac </td><td> מיל אמא </td><td> Reg ט? </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> N לטווח EGFP-TEV-S פפטיד </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> amp </td><td> מוצרי היגיינה </td><td> כן </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> N לטווח דגל-TEV-S פפטיד </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> amp </td><td> מוצרי היגיינה </td><td> כן </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> N לטווח EGFP-TEV-S פפטיד; C לטווח V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> amp </td><td> מוצרי היגיינה </td><td> לא </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> N לטווח דגל-TEV-S פפטיד; ; C לטווח V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td amp></td><td> מוצרי היגיינה </td><td> לא </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> C לטווח S פפטיד-PreProt x2-EGFP </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> amp </td><td> מוצרי היגיינה </td><td> לא </td></tr></tbody></table> לוח 4: רשימת וקטורי LAP / TAP זמינים עם יזמים משתנים, epitope-תגים, וכן יכול ביטוי Dox ועין מתנהל עבור N או תיוג חלבון-מסוף C. וקטורים זמינים מסחרית. מיל Bac מציין סמן עמיד חיידקים, מיל אמא מציינת סמן התנגדות תאים יונק, רג ט? הביטוי מציין אם הוא ט / Dox regulatable. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וֶקטוֹר </td><td> פריימר רצף קדימה </td><td> הפוך רצף פריימר </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 " </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 " </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 " </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 " </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 " </td><td> 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 " </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 " </td><td> 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 " </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 " </td><td> 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 " </td></tr></tbody></table> לוח 5: קדימה ההפוך הרצף Primers עבור וקטורי pGLAP.

אנו מתארים שיטה ליצירת לוקליזציה וטיהור זיקה (LAP) קווי תאים יציבים הניתנים להשראה לחקירת תפקוד חלבון, לוקליזציה תת-תאית מרחבית-זמנית ורשתות אינטראקציה בין חלבון-חלבון.

LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור לוקליזציה וטיהור זיקה, או קווי תאים יציבים מתויגים LAP, לחקירת תפקוד החלבון, לוקליזציה מרחבית-זמנית ורשתות אינטראקציה עם חלבונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה מולקולרית ותאית הקשורות לתפקוד חלבון, לוקליזציה תת-קרקעית של מחזור תא חלבון ואינטראקציות חלבון. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא ניתנת לניתוח תפוקה גבוהה של קבוצות חלבונים, וניתן להשתמש בה כדי לנתח את מרכיבי החלבון של מסלולים ביולוגיים.כדי להתחיל בהליך זה, שכפל את מסגרת הקריאה הפתוחה של הגן המעניין לווקטור המתויג ב-LAP והעביר אותו לתאי HEK293 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. יום אחד לאחר הטרנספקציה, החלף את המדיה מינוס Tet DMEM/F12 במדיה חדשה. יומיים לאחר הטרנספקציה, פיצל את התאים למפגש של 25%.אפשר לתאים כחמש שעות להתחבר. לאחר מכן, הוסף מדיה המכילה היגרומיצין מינוס Tet DMEM/F12 בריכוז שנקבע מראש. עבור תאי HEK293, השתמש ב-100 מיקרוגרם למיליליטר היגרומיצין.החלף את המדיה לפי הצורך עד להופעת מוקדי תאים מובהקים הדומים לכתמים אטומים על הצלחת השקופה. הוסף 20 מיקרוליטר טריפסין על גבי כל מוקד תא וצנר אותו למעלה ולמטה פעמיים עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. העבירו את התאים בצלחת של 24 בארות והרחיבו את התאים על ידי צמיחה מתמשכת במדיה המכילה היגרומיצין מינוס Tet DMEM/F12.הרחב את קו התאים המתויג ב-LAP לטיהור זיקה טנדם, או TAP, בידוד של קומפלקסים חלבונים. לשם כך, העבירו ללא הרף את כל תאי ה-HEK293 לצלחות גדולות יותר ו/או לבקבוקי רולר, ובניכוי מדיה Tet DMEM/F12 ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. עבור קווי תאים הניתנים להשראת Tet/Dox, השראת התאים למשך 10 עד 15 שעות על ידי הוספת ריכוז של 0.2 מיקרוגרם למיליליטר Tet/Dox כאשר התאים מגיעים לכ-70% מפגש.קצור את התאים על ידי תסיסה או טריפסיניזציה. לאחר מכן, גלולה אותם ב 875 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות. כדי לחבר את הנוגדן נגד GFP לחרוזי חלבון A, יש לאזן 160 מיקרוליטר של חרוזי חלבון A בנפח ארוז עם PBST בשפופרת של 1.5 מיליליטר.שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBST. לאחר כל שלב כביסה לאורך הליך זה, החרוזים עוברים צנטריפוגה ב -5000 פעמים גרם למשך 10 שניות, והסופרנטנט מוסר. לאחר השעיה מחדש של החרוזים ב-500 מיקרוליטר PBST, הוסף 80 מיקרוגרם של נוגדן אנטי-GFP מהיר מטוהר זיקה לכל צינור, המכיל 160 מיקרוליטר חרוזים.מערבבים שעה בטמפרטורת החדר. שוטפים את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBST, ואז שוטפים את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של 0.2 נתרן בוראט מולרי, pH לאחר הכביסה הסופית, הוסף 900 מיקרוליטר ממאגר הנתרן בוראט, כדי להביא את הנפח הסופי למיליליטר אחד. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 220 DMP מולארי לתרחיף החרוזים, לריכוז סופי של 20 מילימולר.סובב את הצינורות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה עם DMP, שטפו את החרוזים פעם אחת עם מיליליטר אחד של 0.2 אתנולמין מולרי, 0.2 נתרן כלורי מולרי pH 8.5, כדי לנטרל את הקישור הנותר. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של אותו מאגר, וסובבו למשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר כדורי החרוזים, השעו אותם מחדש ב-500 מיקרוליטר נוספים של המאגר. החרוזים המוכנים יציבים במשך מספר חודשים בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את הליזטים של התאים, השעו מחדש 500 מיקרוליטר של נפח תא ארוז ל-2.5 מיליליטר של LAP 300, עם 0.5 מילי-מולרי DTT ומעכבי פרוטאז.מוסיפים 90 מיקרוליטר של 10% פנוקספוליאתוקסילתנול, ומערבבים בהיפוך. מניחים את התערובת על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 21, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות.לאחר צנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט הזה במהירות נמוכה והניחו בצד דגימה של 10 מיקרוליטר לניתוח ג'ל. לאחר העברת הסופרנטנט במהירות נמוכה לצינור TLA 100.3, סובב ב-100,000 פעמים גרם למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט המהיר הזה בשפופרת והניחו על קרח, ושמרו דגימה של 10 מיקרוליטר לניתוח ג'ל.ללכידת הזיקה הראשונה באמצעות קשירה לחרוזים נגד GFP, יש לשטוף מראש את החרוזים המחוברים לנוגדנים על ידי שטיפתם שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר פליטה כדי להסיר את הנוגדנים הלא מחוברים ולהקטין את הרקע. בצע זאת במהירות. אל תשאיר חרוזים במלח גבוה לאורך זמן.לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של LAP 200 N.לאחר מכן, ערבבו את תמצית הסופרנטנט המהירה עם חרוזי נוגדנים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של התמצית ב -21, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות, שמור דגימה של 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט לניתוח ג'ל. בצע שלוש שטיפות מהירות של החרוזים עם מיליליטר אחד של LAP 200 N, המכיל 0.5 מילי-מולרי DTT ומעכבי פרוטאז.השתמש באותו מאגר כדי לשטוף את החרוזים פעמיים נוספות עם זמן דגירה של חמש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, שטפו את החרוזים במהירות פעמיים נוספות עם 1 מיליליטר של LAP 200 N המכיל 0.5 מילי-מולרי DTT וללא מעכבי פרוטאז, לפני הוספת וירוס תחריט הטבק, או TEV, פרוטאז. הוסיפו לחרוזים 10 מיקרוגרם של פרוטאז TEV במיליליטר אחד של LAP 200 N, וסובבו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, גלו את החרוזים והעבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. שטפו את החרוזים פעמיים עם 160 מיקרוליטר של LAP 200 N, המכילים 0.5 מילי-מולרי DTT ומעכבי פרוטאז כדי להסיר כל שאריות חלבון. ללכידת הזיקה השנייה באמצעות קשירה לאגרוז חלבון S, שטפו שפופרת אחת של 80 מיקרוליטר אגרוז חלבון S שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של LAP 200 N. הוסיפו את הסופרנטנט המצופה TEV לחרוזי חלבון S, ונדנדו אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר כדורי החרוזים, שטפו אותם שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של LAP 200 N המכיל 0.5 מילי-מולרי DTT ומעכבי פרוטאז. לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של LAP 100. הסר את החלבונים מהאגרוז של חלבון S על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מאגר דגימת Laemmli פי 4 וחימום ב-97 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.כדי לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה, בדוק את איכות הטיהור על ידי ניתוח הדגימות שנאספו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל סולפט. כסף מכתים את הג'ל שנוצר. כמו כן, אימונו-כתם משחרר ובודק עם נוגדנים נגד GFP כדי להבטיח שהטיהור המתויג ב-LAP עבד.כדי לזהות מינים סטוכיומטריים וסובסטויכיומטריים, קחו את דגימת הפליטה הסופית והפרידו אותה על ידי SDS-PAGE. מכתים את הג'ל בכתם חלבון תואם ספקטרומטריית מסה. הסר את הרצועות הבולטות ביותר בג'ל ואת הרווח שביניהן כדי לעבד את הרצועות בנפרד לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה.מוצג כאן ניתוח כתם מערבי מייצג של דגימות החלבון מתאי LAP-Tau HEK293 שאינם מושרים ומושרים על ידי Dox. התאים נבדקים עם נוגדנים נגד טובולין כדי לזהות את בקרת הטעינה של טובולין, ונבדקים עם אנטי-GFP כדי לזהות את חלבון הטאו המתויג ב-LAP. שימו לב ש-LAP-Tau מתבטא רק כאשר התאים מושרים עם Dox.תאים מיטוטיים המבטאים LAP-Tau קובעו ונצבעו במשותף עבור DNA וטובולין עם נוגדנים נגד טובולין, והלוקליזציה התת-תאית של LAP-Tau נותחה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שימו לב ש-LAP-Tau מתמקם בציר המיטוטי ובמוטות הציר במהלך המיטוזה. מוצג כאן ג'ל מוכתם כסף מייצג של טיהור LAP-Tau.הנתיבים מייצגים את המשקל המולקולרי, הליזטים המנוקים והפליטות הסופיות. הדגימות הופעלו על ג'ל 4-20% SDS-PAGE והג'ל היה צבוע בכסף כדי להמחיש את החלבונים המטוהרים. שימו לב שרצועה המתאימה ל-LAP-Tau מסומנת בכוכבית, וניתן לראות מספר רצועות אחרות המתאימות לחלבונים לטיהור משותף.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור קווי תאים יציבים הניתנים להשראה עם תיוג LAP, וכיצד לבצע טיהורים ביוכימיים של חלבונים מתויגים ב-LAP לניתוח פרוטאומי וזיהוי רשתות אינטראקציה עם חלבונים.

inducible-lap-tagged-stable-cell-lines-for-investigating-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

צמתים בין-תאיים הם דרישות עבור פונקציות ספציפיות של בלוטת החלב והתפתחותן. כתב היד מספק פרוטוקול מפורט לחקר האינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) לבין שיתוף לוקליזציה באמצעות בלוטות החלב Murine. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את הדינמיקה של הקשר הפיזי בין צמתים בין-תאיים בשלבי התפתחות שונים.

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור פיצול-BioID, שיטת שברי-קומפלמנטציה מבוסס על טכניקת קרבה-תיוג BioID. מופעל על האינטראקציה של שני חלבונים נתונה, היא מאפשרת ניתוח פרוטאומיקס של חלבונים תלויי-ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית. השיטה היא פשוטה, חסכונית ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים.

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

חקור תפקוד חלבונים ורשתות אינטראקציה באמצעות יצירת שורות תאים יציבות עם תג LAP ב-HEK293. שיטה זו מאפשרת ניתוח רב-עוצמה של חלבונים ומסלולים ביולוגיים בצורה מבוקרת.

LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

גלה סרטונים נוספים