פיתוח מודל ישיר מכסת-זול עבור הערכת pulpal ריפוי פצע גיבוש מתקנת הדנטין של עכברים
January 12th, 2017
אנו מתארים שיטת צעד אחרת צעד ביצוע עיסה ישירה מכסה על שיני עכברים להערכת ריפוי פצע pulpal והיווצרות הדנטין מתקן in vivo.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג את הליך מכסת מוך השן הישיר בעכברים. שיטה זו יכולה לעזור לכם לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של מוך השן, כגון, כיצד מוך השן מתרפא, או כיצד נוצר דנטין מתקן, כאשר אתם מניחים חומרים לכודים על מוך השן החשוף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהליך כיסוי מוך השן הישיר המבוצע בבני אדם יכול להיעשות גם בעכברים, בדיוק באותו אופן.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על שיפור תכונות החומר להצלת שיניים שאחרת נידונו להיות טיפולים פולשניים יותר, כגון טיפול שורש. לאחר הרדמה נכונה של העכבר לצורך ההליך, מקם את מחזיק הפה בפיו ואבטח את הקצה השני לשולחן כך שהראש פונה כלפי מעלה. בעזרת תאורה טובה וסטריאוסקופ, התבונן בשן המקסילרית הראשונה.
לאחר מכן, באמצעות הבור הרבע עגול בידית במהירות גבוהה ב-200,000 סל"ד, הסר את האזור המרכזי של אמייל השן עד שהמוך נראה דרך הדנטין השקוף. היזהר לא לחדור לעיסה. לאחר מכן, באמצעות לא.
15 קובץ K אנדודונטי, מחורר דרך הדנטין וחושף את המוך. אל תדחף פסולת לתוך העיסה; ניתן להימנע מכך על ידי סיבוב קובץ ה-k מדי רבעון, ולאחר מכן משיכת קובץ ה-k החוצה. כעת, הכן את ה-MTA, ובאמצעות הסייר, העביר את ה-MTA, ולאחר מכן ארוז אותו באזור החשוף באמצעות הצד האחורי של נקודת הנייר והקשה עדינה.
לאחר מכן, השתמשו במזרק עמוס בתחריט חומצה זרחתית 35%, כסו את השן בתחריט, הימנעו מרקמות החניכיים, ותנו לחריטה לעבוד למשך 15 שניות. לאחר 15 שניות, מצצו את התחריט מהשן והשתמשו באפליקטור כותנה רטוב במים כדי לנגב את כל התחריט שנותר. למצוץ ולנגב עד להסרת כל התחריט.
לאחר מכן יש למרוח את הדבקים הדנטליים באמצעות הצד האחורי של חוד הנייר. הפוך את שכבת הדבק לדקה על ידי ניפוחה באוויר דחוס למשך מספר שניות. לאחר מכן רפאו את הדבק למשך 30 שניות עם האור המתאים.
כעת, הניחו כמויות קטנות של קומפוזיט על השן באמצעות קצה החוקר כדי להזרים את הקומפוזיט לתוך חריצי השן. לאחר המריחה, יש לרפא את הקומפוזיט למשך 30 שניות. לאחר המתת חסד של העכבר והסרת כל הלסת העליונה, הנח את הלסת לתוך 4% פרפורמלדהיד ב-PBS ב-pH 7.4.
שמור את הרקמה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולמחרת בבוקר העבירו אותה ל-70% אתנול לאחסון עד שניתן יהיה לעבד אותה. כדי לבצע סריקת מיקרו CT של הלסת העליונה, אבטח אותה תחילה בגזה ספוגה באתנול 70%, ולאחר מכן ארז אותה בצינור תרבית תאים של 15 מיליליטר. לאחר מכן הרכיב את הצינור על שלב סריקת המיקרו CT.
לאחר מכן, הגדר את מקור קרני הרנטגן לספק זרם של 145 מיקרו-אמפר עם 55 קילו-וולט שיא למשך 200 אלפיות השנייה. בעזרת פילטר אלומיניום 0.5 מילימטר, רכשו תמונות ברזולוציה של 20 מיקרון. לאחר השלמת הסריקות, התחל להסיר את הלסת העליונה עם 5% EDTA ו-4% סוכרוז ב-PBS, ב-pH של 7.4.
הניחו לתגובה הזו להימשך שבועיים ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר הטמעת הלסת העליונה, צרו פרוסות בעובי של חמישה מיקרון. אזורי מכסי העיסה חופפים בדרך כלל לשורש החך הדיסטלי, שיכול לשמש כציון דרך.
קביעת תחום העניין המדויק על ידי בחינת ההיסטולוגיה תחת מיקרוסקופ האור, והשוואת התוצאות לסריקות המיקרו CT. לצביעת H&E, הסר את הפרפין, והרטיב את השקופיות עם שתי אמבטיות בקסילן למשך מספר דקות כל אחת. לאחר מכן העבירו אותם דרך סדרה של אתנול מדולל סדרתי.
יש למרוח כל אמבטיה למשך דקה אחת בלבד. יש לעקוב אחר ההתייבשות עם שטיפה. ואז למרוח את תמיסת ההמוטוקסילין למשך שתי דקות וחצי.
הסר את הצבע בשטיפה, ולאחר מכן הכניס את השקופיות לאתנול 95% למשך דקה אחת. לאחר מכן, הכתים את השקופיות בתמיסת אאוזין למשך דקה אחת ואז שטוף אותן. הפוך את שלבי ההידרציה כדי לייבש את הרקמות המוכתמות, החל מאתנול.
לאחר מכן, טפל בהם בקסילן. לאחר מכן ניתן להרכיב ולצלם את השקופיות. באמצעות ההליכים המתוארים, בוצעה מכסת מוך השן בעכברים בני 8 שבועות.
שישה שבועות לאחר מכן, הלסת העליונה שלהם נקצרה ונבדקה. באופן מוזר, צביעת H&E חשפה היווצרות דנטין בכל תא מוך השן ותעלות השורש. באופן יחסי, הטוחנת הלא מכוסה לא הראתה את אותה היווצרות דנטין.
בשן הטוחנת המכוסה היו מאפיינים של היווצרות דמוית דנטין ודמוית עצם, שכן גם צינורות דנטין וגם אוסטאוציטים נמצאו בדנטין המשקם, מה שמרמז על כך שעיסה פצועה עשויה להיות מינרלית הן על ידי אודונטובלסטים שוכנים והן על ידי אוסטאובלסטים מהגרים. השימוש בצביעה אימונוהיסטוכימית DMP1 אישר עוד יותר את הפעילות המוגברת של תאים היוצרים דנטין מתקן. בדיוק כמו פרקטיקות קליניות אמיתיות של שיניים, עוזר מועיל מאוד.
לדוגמה, עם עוזר, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך עשר דקות בלבד, לאחר שליטה. חשוב לציין, כאשר אתה חושף את מוך השן, זכור להשתמש באנדופיל, לא בבור. וכשאתה מוסר את ה-MTA, היזהר.
אל תשכח שעבודה עם מקבעים כמו פרפורמלדהיד יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לביצוע כיסוי עיסה ישיר על שיני עכבר, שמטרתו לחקור את ריפוי הפצע של העיסה והיווצרות דנטין תיקון in vivo. השיטה מאפשרת לחוקרים לחקור היבטים מרכזיים של ביולוגיה של העיסה, כולל תהליכי ריפוי ואינטראקציות של חומרים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- רפואת שיניים
- מדעי המוח
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- כיסוי עיסה ישיר הוא הליך שיניים שמטרתו לשמר את חיוניות העיסה.
- טכניקה זו יכולה להיות מיושמת הן במודלים אנושיים והן בעכברים.
- הבנת ריפוי העיסה יכולה להוביל לשיפורים בטיפולים דנטליים.
- המחקר מתמקד בתגובת העיסה לחומרי הכיסוי.
מטרת המחקר
- להעריך את תהליך הריפוי של העיסה לאחר כיסוי ישיר.
- להעריך את היווצרות הדנטין התיקון בתגובה לחומרי הכיסוי.
- לספק שיטה אמינה לחקר ביולוגיה של העיסה in vivo.
שיטות בשימוש
- הרדמה מיקום עכבר לצורך ההליך.
- שימוש במחזיק לחי כדי לייצב את העכבר במהלך ההליך.
- יישום חומרי כיסוי עיסה על עיסה חשופה.
- תצפית על הטוחנה העליונה הראשונה באמצעות סטריאוסקופ.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר יישום עקבי של כיסוי עיסה בעכברים.
- הוא מספק תובנות לגבי יכולות הריפוי של רקמת העיסה.
- ניתן לנטר ביעילות את היווצרות הדנטין התיקון.
- לטכניקה יש השלכות לשיפור חומרים דנטליים.
מסקנות
- שיטה זו היא כלי חשוב לחקר ביולוגיה של העיסה.
- היא מגשרת על הפער בין הליכים דנטליים אנושיים ובעלי חיים.
- מחקרים עתידיים יכולים לשפר את תכונות החומרים לתוצאות דנטליות טובות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic investigation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in a murine model, supporting target validation in regenerative dentistry. By allowing use of transgenic and knockout mice, it facilitates preclinical screening of biocompatible materials and de-risks translational pathways for pulp-protective therapeutics. The model addresses a key gap in dental R&D by providing an in vivo system to evaluate molecular mechanisms underlying dentin regeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular and molecular pathways involved in pulp healing and dentinogenesis.
- Operational Value: Supports functional validation of targets using genetic models to assess causal roles in reparative dentin formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized in vivo assay to evaluate biocompatibility and inductive potential of pulp-capping materials.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of dentin formation via micro-CT and histology for material screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges ex vivo findings to physiological relevance by modeling human pulp-capping outcomes in mice.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of lead materials for pulp vitality preservation and dentin repair.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in regenerative dentistry.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on signaling pathways regulating odontoblast and osteoblast recruitment during pulp repair.
- Screening: Enables standardized evaluation of material-induced reparative dentin formation as a functional readout.
- Analytics: Generates quantitative micro-CT and histological outputs to compare material efficacy and healing kinetics.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation of pulp-capping agents prior to IND-enabling studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative material optimization and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in material performance by capturing complex tissue-level healing responses.
- Operational Value: Delivers a reproducible, standardized procedure for cross-laboratory material comparison.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in pulp-regenerative approaches.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of pulp therapeutics based on in vivo dentin regeneration evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dental procedures, anesthesia, and microsurgical techniques.
- Dependent on access to high-speed handpieces, stereoscopes, micro-CT, and histological processing equipment.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent pulp exposure and material placement.
- Adaptation considerations include variations in mouse strain, age, and pulp-capping material viscosity.
- Practical limitations include technical difficulty due to small murine tooth size and potential variability in healing responses.
