זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אירועי איתות המושרים ותאי תגובה ברי קיימא בעקבות האינטראקציה הפיזית שלהם עם תאים מתים סמוכים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של התא, הפתולוגיה והפיזיולוגיה כמו ההשפעה של תאים מתים או גוססים על שכניהם החיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה וזולה, ושניתן ליישם אותה לחקר השפעות ביולוגיות הנגרמות בתאים חיים בעקבות האינטראקציה שלהם עם תאים שכנים העוברים אפופטוזיס.

מי שידגים את הטכניקה יהיה לנפיי פנג, טכנאי במעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה לאחר העברת תאי BUNPT לצלחות תרבית רקמות שטופלו בפלזמת גז ואקום של 100 מילימטר, גדל אותם במדיום תרבית A למפגש ואטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את שכבת התא הדבוק שלוש פעמים עם מדיום תרבית B.לאחר מכן, גרמו לאפופטוזיס על ידי דגירה של התאים במדיום תרבית B, המכיל סטאורוספורין, מעכב חלבון קינאז לא סלקטיבי, למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 3 שעות, אוספים את המדיום המכיל תאים אפופטוטיים צפים שהתנתקו מהחד-שכבה. לאחר מכן, צנטריפוגה את המדיום הזה למשך עשר דקות ב-500 פעמים G.לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הכדור שלוש פעמים במדיום תרבית B, לפני הוספתו בחזרה לתאים הדבקים. לאחר שלב שטיפה זה, נתק את התאים הדבקים הנותרים על ידי הוספת 5 מילי-מולרי EDTA ב-1X DPBS ללא סידן ומגנזיום.

אסוף את המדיום המכיל תאים אפופטוטיים מנותקים והכניס את התאים המנותקים עם התאים האפופטוטיים הצפים בצינור צנטריפוגה פוליסטירן סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את התאים האפופטוטיים שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה למשך עשר דקות ב-500 x G.ולאחר מכן השעיה מחדש בעשרה מיליליטר של 1X סידן ו-DPBS ללא מגנזיום לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, השעו את התאים האפופטוטיים במדיום תרבית טרי B ב-5x10^6 תאים למיליליטר, לפני השימוש בהם כדי לעורר את תאי המגיבים.

לחלופין, יש לתקן את התאים האפופטוטיים השטופים ב-0.4 פרפורמלדהיד ב-1X DPBS למשך 30 דקות, ואז לשטוף אותם שלוש פעמים עם מדיום תרבית B, ולהשעות אותם בתוכו ב-5x10^6 תאים למיליליטר לפני השימוש בהם כדי לעורר את תאי המגיבים. לאחר העברת תאי BUNPT לכלי תרבית רקמות סטריליים בפלזמה של גז פוליסטירן סטרילי בקוטר 100 מילימטר, יש לגדל אותם למפגש ולאטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני בתנאים מתירניים. לאחר מכן שטפו את שכבת התא הדבק שלוש פעמים עם 10 מ"ל של מדיום תרבית B לשטיפה.

לאחר מכן, נתק את התאים על ידי הוספת 5 מ"מ EDTA ב-1X סידן ו-DPBS ללא מגנזיום. אסוף את התאים המנותקים מהמדיום המכיל EDTA והוסף את תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה פוליסטירן סטרילי של 15 מ"ל. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה למשך עשר דקות ב -500 פעמים G והשעיה מחדש ב -10 מ"ל DPBS ללא סידן ומגנזיום לכל שטיפה.

לאחר הכביסה האחרונה, השעו את התאים במדיום תרבית טרי B ב-5x10^6 תאים למיליליטר. לאחר מכן, לגרום לנמק על ידי חימום התאים ל-70 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות באמבט מים, תוך מערבולת עדינה של תרחיף התאים כל עשר דקות. לאחר השראת נמק, דגרו על התאים במשך שעתיים באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ומערבלו בעדינות את תרחיף התאים כל 15 דקות.

בהליך זה יש לגדל את תאי ה-BUNPT בכלי תרבית רקמה סטריליים של 100 מילימטר בתנאים מתירניים, עד שהם מגיעים לכ-85% מפגש. לאחר מכן, שאפו תרבית A ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 10 מ"ל של תרבית B לכל שטיפה. לאחר מכן, הסרום מרעיב את התאים בתרבית B למשך 18 עד 24 שעות באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני בתנאים לא מתירניים, על מנת לגרום לשקט.

סמן צלחת תרבית רקמה נפרדת של תאי BUNPT קונפלואנטים עבור ששת תנאי הניסוי להליך הבא. כעת, שאפו תרבית B מהכלים המסומנים מראש של תאי BUNPT מגיבים שקטים. כדי להכין את הכלים של 100 מילימטר בתנאים שונים, הוסף שני מ"ל של כל מדיום תרבית B ללא תאים, תרחיף התאים האפופטוטי ב-5X10^6 תאים למיליליטר במדיום תרבית B, או תרחיף התאים הנמקיים ב-5X10^6 תאים למ"ל במדיום תרבית B. השג יחס תאים מתים למגיב של אחד לאחד על ידי הוספה למ"ל של תאים מתים ב-5X10^6 תאים למיליליטר ל-a צלחת 100 מילימטר קונפלונטית, המכילה 10X10^6 תאים.

מערבבים בעדינות את הכלים. לאחר מכן דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני. לאחר 30 דקות, יש לעורר את תאי המגיבים עם רכב או 15 nMOL EGF, בהתאם לתיוג מראש של צלחת התרבית.

דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, שטפו את התאים המתים על ידי הוספת חמישה מילימטרים של DPBS קרים כקרח. סובבו את המנה ושאבו את נוזל הכביסה.

חזור על הכביסה שלוש פעמים. לאחר מכן הניחו מיד את כלי תא המגיב על קרח להמשך עיבוד. איור זה מראה כי חשיפה של מגיבי BUNPT שקטים לתאים אפופטוטיים במשך 30 דקות עיכבה מאוד זרחון בסיסי של GSK3 אלפא בטא.

כדי למנוע אינטראקציה פיזית בין מגיבי BUNPT לתאים אפופטוטיים, מגיבי BUNPT גודלו במערכת תמיכה חדירה, והופרדו ממטרות אפופטוטיות על ידי קרום פוליקרבונט של 0.4 מיקרון. מניעת אינטראקציה פיזית בין מגיבי BUNPT לתאים אפופטוטיים ביטלה את יכולתם של מטרות אפופטוטיות לעכב זרחון של GSK3 אלפא בטא. כדי להעריך את תפקיד הפגוציטוזיס, נעשה שימוש במעכב השלד הציטוציטי ציטוכלאסין D למניעת ספיגה פגוציטית של תאים מתים.

עיכוב זרחון של GSK3 אלפא בטא בתגובה לתאים אפופטוטיים התרחש בהיעדר פגוציטוזיס. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 4-6 שעות אם היא מבוצעת כראוי, למעט הזמן הנדרש לאלקטרופורזה של ג'ל ואימונובלטינג. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ששימוש בתרחיף תאי בניגוד לליגנד מסיס כגירוי מציב מספר מכשולים ניסיוניים מובנים ובלתי נמנעים במידה רבה.

באמצעות אותו נוהל, ניתן לחקור תפקודים אחרים של תאים, כגון הישרדות או התפשטות או גדילת תאים על מנת לקבוע את ההשלכות התפקודיות של אירועי האיתות המושרים בתאים חיים המגיבים בעקבות האינטראקציה שלהם עם תאים מתים סמוכים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות אירועי איתות ספציפיים המושרים בתאי תגובה ברי קיימא בעקבות האינטראקציה הפיזית שלהם עם תאים מתים סמוכים.