ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את צריכת החמצן המיטוכונדריאלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתסמונות ובמחלות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה כגון; אלח דם, מחלות נוירולוגיות מגוונות והפרעות הקשורות לגיל. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שיש לה רגישות גבוהה יותר ויכולת לבצע סובסטרט על טיטרציות מעכבות מצומדות, ניסויים עם מספר קטן של דגימות ביולוגיות, כגון תאים שלמים או חדירים.

מי שתדגים את ההליך תהיה סנדרה ננסוז, טכנאית מהמעבדה שלי. לפני תחילת ההליך, כייל האוויר את חיישני החמצן הפולרוגרפיים ואז השהה מחדש את התאים במאגר הנשימה לריכוז אחד כפול עשרה עד שישי תאים למיליליטר והחלף את אמצעי הנשימה בתא אחד של האוקסיגרף ב-2.1 מיליליטר של תרחיף התאים. סגור את החדר עם הפקק והגדר את מוט הערבוב המגנטי בתא ל-700 סיבובים לדקה.

לאחר מכן הקלט את הנשימה התאית למשך 5 עד 10 דקות עד להשגת אות שטף חמצן יציב. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי להזריק שני מיקרוליטרים של רוטנון דרך פתח הזרקת הטיטניום לתוך תא האוקסיגרף והקלט את הנשימה התאית למשך 5 עד 10 דקות נוספות. כאשר מושג אות שטף חמצן יציב, הזרקו 20 מיקרוליטר של סוקסינט מולארי אחד ואחריו 10 מיקרוליטר של 0.5 ADP מולארי.

לאחר מכן הזרקו שני נפחים של שני מיקרוליטרים של שני דיגיטונין מילי-מולרי ורשמו את הנשימה התאית במשך שתיים עד חמש דקות לאחר כל הזרקה ואחריה הזרקה הדרגתית של שניים עד ארבעה מיקרוליטרים של שני דיגיטונין מילי-מולרי עד שאות שטף החמצן מגיע לרמה המקסימלית וזריקות דיגיטונין נוספות אינן מגבירות את קצב הנשימה. להערכת שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית הכינו תא אוקסיגרף כפי שהודגם זה עתה והזריקו שני מיקרוליטרים של שמונה דיגיטונין מילי-מולרי כדי לחלחל לתאים. לאחר חמש דקות, הזרקו 20 מיקרוליטר של סוקסינט טוחנת אחת והקליטו את הנשימה התאית למשך 5 עד 10 דקות עד להשגת אות שטף חמצן יציב.

לאחר מכן יש להזריק 10 מיקרוליטר של 0.5 ADP מולארי כדי לעורר קומפלקס שניים, ולגרום לעלייה בצריכת החמצן. כאשר מושג אות שטף יציב, הזרקו חמישה מיקרוליטר של ארבעה ציטוכרום c מילי-מולרי ואחריהם מיקרוליטר אחד של ארבעה מיליגרם למיליליטר ליגמיצין. כדי למדוד את הנשימה המעוררת ADP של תאי קרצינומה הפטו-תאית בכבד, הכינו תא אויגרף כפי שהודגם זה עתה, והזריקו שני מיקרוליטרים של שמונה מילי-מולרי דיגטונין לתוך תא החמצן כדי לחלחל לתאים למשך חמש דקות, ולאחר מכן הזרקה של 12.5 מיקרוליטר של 0.8 מולדה מולרית ו-10 מיקרוליטר של שני גלוטמט מולארי.

כאשר מושג שטף חמצן יציב, הזרקו 10 מיקרוליטר של 0.5 ADP מולרי כדי להגדיל את צריכת החמצן, ואחריהם שני מיקרוליטר של 0.2 מילי-מולרי רוטנון ו-20 מיקרוליטר של סוקסינט טוחנת אחת. לאחר מכן, הזריק שני מיקרוליטרים של חמישה מילי-מולרי אנטימיצין ורשום את הנשימה התאית. כאשר האות יורד ומתייצב, יש להזריק 2.5 מיקרוליטר של 0.8 מילי-מולרי אסקורבט ואחריו הזרקה מיידית של 2.5 מיקרוליטר של 0.2 מילי-מולרי TMPD, תוך רישום הנשימה התאית עד שאות שטף החמצן גדל ומתייצב.

לאחר מכן הזרקו 10 מיקרוליטר של נתרן אזיט מולרי אחד לתא החמצן, והקליטו את השאיפה התאית עד שאות שטף החמצן יורד ומתייצב. כדי למדוד את צריכת החמצן בתא השלם, הכינו תא אוקסיגרף כפי שהודגם זה עתה והזריקו 1 מיקרוליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר אליגימיצין ואחריו זריקות מיקרוליטר אחת ושלוש של 0.2 מילי-מולרי FCCP. לאחר מכן, טיטר את ה-FCCP בצעדים של 0.1 עד 0.3 מיקרו-מולרי על ידי הזרקת 1 עד 3 מיקרוליטר של 0.2 עד 1 מילי-מולרי FCCP עד שאות שטף החמצן מגיע לרמתו המקסימלית ללא עליות נוספות, ואז מתחיל לרדת.

לאחר מכן, הזרקו שני מיקרוליטרים של 0.2 מילי-מולרי רוטנון ושני מיקרוליטרים של חמישה מילי-מולרי אנטימיצין A ורשמו את הנשימה עד שאות שטף החמצן יורד ומתייצב. בהיעדר דיגיטונין, הנשימה התאית נמוכה מאוד, והנשימה של תאים שלמים ולא חדירים אינה מגורה בנוכחות מצע מיטוכונדריאלי ו-ADP. עם זאת, עם הוספה הדרגתית של דיגיטונין, קרום הפלזמה התאית הופך לחדור והנשימה המיטוכונדריאלית גדלה עד לחדירות מלאה, ואז הסוקסינט וה-ADP נכנסים לתאים.

עם זאת, שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה עלולה להיפגע, אם משתמשים בכמויות מוגזמות של דיגיטונין, מה שגורם להפחתה בנשימה של קומפלקס למצב תלות שלוש. ציטוכרום c אינו משפר את הנשימה המורכבת למצב שלוש בתאים שטופלו בדיגיטונין, מה שמצביע על כך שאין אובדן של ציטוכרום c מהממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, וכי שלמות המיטוכונדריה נשמרת, למרות שציטוכרום c יכול לשפר את הנשימה של תאים שטופלו במינונים גבוהים מאוד של דיגיטונין. תוספת של מצעים אקסוגניים של פעילות מורכבת מיטוכונדריאלית לאחר חדירה דיגיטלית גורמת לעלייה במתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית 1, 2 ו-4 קצבי נשימה מקסימליים.

יצירת רמות נשימה מופחתות עשויה לנבוע מזיהום של תאי האוקסיגרף במעכבי מיטוכונדריה מהניסוי הקודם. בנוכחות אליג'ימיצין והתוספת הרציפה של FCCP, נצפה קצב הנשימה המקסימלי הבלתי צמוד של התאים. לאחר שליטה, כל אחת מהטכניקות הללו יכולה להיעשות תוך פחות משעה אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור לשטוף תאי אוקסיגרף ופקקים בהרחבה לאחר כל ניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידות של תכולת ATP תאית, כל אחת מציגה בפעילות צימטית, רמות מצע מיטוכונדריאלי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם שינויים בקצב הנשימה נובעים ממחסור בסובסטרטים מיטוכונדריאלים או פעילות מופחתת של צינטטים של ATP. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביונגטיקה לחקור את תפקוד המיטוכונדריה בתחומים כמו מחלות מיטוכונדריאליות נרכשות וגנטיות, מתח חמצוני, פגיעה בזלוף העור והזדקנות בתאים או סיבים שלמים או חדירים ומיטוכונדריה מבודדת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסייע לתפקוד המיטוכונדריה בתאים חדירים ושלמים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. אל תשכח שעבודה עם אנטימיצין a, רוטנון, סודיום יוזיד, FCCP ואריקומיצין יכולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוקי מעבדה בעת ביצוע הליך זה.