הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T
4 בדצמבר 2007
טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.
אנו נמצאים כאן במכון למחקר אונקולוגיה מולקולרית במרכז הרפואי Tufts New England. שמי כריסטינה לסקו ואני עמיתת פוסט-דוקטורט במעבדה של ד"ר ריק ואן. המעבדה שלנו עוסקת בחקר לוקמיה מיאלואיד כרונית, CML ומחלות דומות ל-CML בבני אדם.
אנו ממדלים מחלה אנושית זו בעכברים, והדרך שבה אנו עושים זאת היא באמצעות הכנסת אונקוגן אנושי באמצעות וקטור רטרו-ויראלי. לכן, הדבר הראשון שיש לעשות כדי להחדיר אונקוגן אנושי זה לתאים של עכברים הוא לייצר את הווירוס עצמו. השלב הבא יהיה לבצע למעשה תהליך של תיתור (titration) לווירוס.
זוהי צלחת המלאי שלי של תאי 2 9 3 T. עלי לשטוף את המצע באמצעות PBS. תאי 2 9 3 T הם תאים נ adherent, עם זאת, הם אינם נ adherent בצורה חזקה במיוחד, לכן כל תנועה חייבת להיות עדינה מאוד. לאחר השטיפה, נחליף את ה-PBS ב-trypsin.
על מנת לשחרר את התאים מהפלטה, עלינו להחזיר את הפלטה לאנקובטור למשך כשלוש דקות. לאחר שתי עד שלוש דקות, התאים יהיו למעשה בתליה. כעת נוסיף מספר מיליליטרים נוספים של מצע רגיל.
פעולה זו תנטרל את ה-tripsin. בשלב זה, אנו מערבבים למעלה ולמטה כדי לוודא שכל התאים נמצאים בסuspended בצורה טובה, אנו מעבירים את התוךייה למבחנה של 50 ml וכדי לספור את התאים בנוכחות trypan blue נשתמש ב-hemocytometer לספירה ידנית. כעת אני מבצע את הדילול כפי שחושב, וכעת אזרע 3*10⁶ תאים לכל צלחת.
בארבעה מ"ל מצע, אנו מוודאים שהתאים הופרשו היטב ונעיד את הצלחות בחזרה לאנקובטור למשך 16 עד 18 שעות, בדרך כלל עד למחרת בבוקר. כעת חלפו 48 שעות לאחר זיהום בנגיף GFP. הכלורקווין משמש להגברת הספיגה של ה-DNA שנגדיף על התאים.
שאבנו בעדינות את המצע מהתאים, שכעת נצמדו בעדינות לדפנות הפלטה. בנקודה זו, נחזיר את הפלטות לאינקובטורים למשך כשעה. בינתיים, נכין את תערובת ה-DNA להחלה על התאים; שכבה אחת המבטאת גן העמיד לנאומיצין והשנייה המבטאת למעשה GFP. אני משתמש ב-XI DNA כדי לשמש כביקורת לכל תהליך הטרנספקציה.
לבסוף, אנו מוסיפים סידן כלוריד. השימוש בסידן כלוריד מגבירה משמעותית את יעילות הטרנספקציה. כעת, לאחר שחלפה שעה, לקחנו את הצלחות עם מצע הכלורקווין ואנו עומדים להוסיף את תמיסת הטרנספקציה שלנו.
השלב האחרון שעלינו לבצע הוא הוספה של 1 ml של HBS סטרילי בריכוז 2x. בעת הוספת תמיסת ה-2x HBS, עלינו לערבב את המבחנה ב-vortex בו-זמנית ולהוסיף את התמיסה לאט, טיפה אחר טיפה. זאת כדי למנוע שקיעות. מיד לאחר מכן, יש לחלק 1 ml מהתמיסה לצלחת הרלוונטית, וגם זאת בשיטה של טיפה אחר טיפה.
בשלב זה, תאי ה-2 9 3 T רגישים למדי, בשל מצע הכלורוקווין שבו הם נמצאים. עלינו לוודא שכל השטח מכוסה ולהזיז את הצלחות כמה שפחות; סמנו את הצלחת עם הקונסטרוקט שהעליתם וחזרו על הפעולה עבור הקונסטרוקט הבא.
בשלב זה, החזירו את הפלטות לאינקובטור למשך שבע עד 11 שעות. לפחות שבע, אך לא יותר מ-11, מכיוון שהתאים רגישים מאוד בשל הכלורוקווין ונצטרך להחליף את המצע לאחר זמן זה. אנו נמצאים כעת כ-30 שעות לאחר הטרנספקציה.
זהו החלפת המצע האחרונה שלנו בנקודה זו, תאי 2 9 3 C3 T הגיעו למצב של התמזגות (confluence). עלינו להיות שוב עדינים מאוד בעת הוספת המצע החדש לצד הפלטה. אני משתמש במזרק של 10 ml עם מחט.
אני עומד להחליף את המחט במסנן, ולכן אני מערבב היטב את המצע; בשלב זה אספנו את הווירוס שלנו ואנו יכולים להניח אותו במינוס 80 מעלות עד לשימוש. הדבר הראשון שיש לעשות הוא למעשה לתיתור את הווירוס. ישנם מספר שלבים רגישים במהלך ייצור הווירוס, והראשון שבהם הוא הריכוז הנכון של תאי 2 9 3 T.
אנו זורעים אותם בריכוז של 10^6 תאים לצלחית, מכיוון שלאחר 18 שעות הם יגיעו לכ-80% התלכדות (confluency). הדבר משאיר להם זמן להמשיך לגדול, כך ש-24 שעות לאחר הטרנספקציה הם יגיעו ל-100% התלכדות. הוכח כי הדבר חשוב מאוד להשגת תרשוף נגיפי (virus titer) מצוין.
השלב הבא הוא שימוש בכלורוכין, ובמעשה השימוש בכלורוכין מרגיש את תאי ה-2 9 3; את כל החלפות המדיום יש לבצע בעדינות רבה כדי שכל השכבה של תאי ה-2 9 3 T לא תתנתק מהפלטה. לבסוף, ה-DNA המשמש ליצירת הווירוס חייב להיות נקי ביותר. אנו משתמשים ב-C banded DNA.
לאחר קבלת הווירוס, אנו שומרים אותו בטמפרטורה של 80- מעלות. בדרך כלל אנו עוקבים אחריו פעם אחת, שכן כל הפשרה תפחית את הטרה (titer) של הווירוס פי שניים. לפיכך, אנו מעדיפים להקפיא את הווירוס שהכנו מראש, לפני ביצוע מדידת הטרה בפועל של הווירוס.
בהתאם לנגיפים, עשויה להיות ביטוי של GFP יחד עם הנגיף כדי לעקוב אחר התאים המודבקים בפועל, או שניתן להשתמש בעמידות לנאומיצין. חשוב מאוד לקבוע את הטיטר של הנגיף לפני השימוש בו, כדי שניתן יהיה להשוות בין ניסויים או בין מוטציות שונות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקה זו מדגימה דרך יעילה להכנת מאגרי רטרו-וירוסים פגומים בשכפול המקודדים לאונקוגן אנושי, המשמשים לאחר מכן להשראת מחלה מיילו-פרוליפרטיבית במודל עכבר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אונקולוגיה מולקולרית
- תרפיה גנית
- מודלים עכבריים של מחלות
רקע
- מחלות לוקמיה ומחלות קשורות במערכת החיסון האנושית הן מורכבות ודורשות מידול יעיל.
- וקטורים רטרו-ויראליים משמשים בדרך כלל להחדרת אונקוגנים לתאי מאכסן.
- רטרו-וירוסים עם פגם בשכפול בטוחים יותר לשימוש במחקר.
- הבנת המנגנונים של מחלות מילופרוליפרטיביות עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת מלאי של רטרו-וירוסים פגומים בשכפול (replication-defective).
- מידול מחלות הנגרמות על ידי אונקוגנים אנושיים בעכברים.
- בדיקת ההשפעות של הכנסת אונקוגנים לתאי עכבר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מלאים רטרו-ויראליים פגומים בשכפול.
- החדרה של אונקוגנים אנושיים לתאי עכבר.
- השראה של מחלה מיאלופרוליפרטיבית במודלים של עכברים.
- ניתוח של התקדמות המחלה והשפעותיה על המארח.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של מלאי רטרו-ויראלי המקודד את האונקוגן האנושי.
- השראה של מחלה מיאלופרוליפרטיבית שנצפתה במודל העכבר.
- הוכחת היעילות של מערכת הווקטור הרטרו-ויראלי.
- השגת תובנות לגבי מנגנוני המחלה באמצעות מודל זה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לחקר השפעותיהם של אונקוגנים אנושיים in vivo.
- ניתן להשתמש במודל זה למחקרים עתידיים של מחלות מיאלופרוליפרטיביות.
- מחקרים עתידיים עשויים להוביל לשיפור בהתערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ייצור רטרו-וירוסים פגמי-שכפול באמצעות טרנספקציה זמנית מאפשר הובלה אמינה של אונקוגנים לצורך מידול של מחלות המהדם ממאירות בבני אדם במערכות פרה-קליניות. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות על ידי ביסוס קשרים סיבתיים בין מניעים גנטיים לבין פנוטיפים של מחלה in vivo. השיטה מגבירה את רמת הביטחון החזויה בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי אספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה להפחתת סיכונים מנגנוניים של מסלולים אונקוגניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תפקוד אונקוגנים באמצעות ביטוי מבוקר בהקשרים תאיים רלוונטיים.
- ערך תפעולי: תומך ביצירת מודלים איזוגניים להבנת מסלולים ביולוגיים והפחתת סיכונים עבור מטרות טיפוליות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בתיקוף מטרות מונחה-השערה עם תוצרים פנוטיפיים מדידים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מלאי ויראלי סטנדרטי ליעילות טרנסדוקציה עקבית במסעות סריקה.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה שמימה, בעלת titer גבוה, של ספריות ויראליות המסומנות במרסמי דוחה (reporter) או בעמידות.
- ערך אסטרטגי: תומך במוכנות של בדיקות למדידת מעורבות מטרה (target engagement) ובדיקות קריאה תפקודית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל פתוגנזה מונעת על ידי אונקוגנים אנושיים במערכות עכברים בעלות כושר חיסוני או עכברים הומניזים.
- ערך תפעולי: מספק מאגרי וירוס ניתנים לחידוש עבור מחקרים ארוכי טווח וניסויי תגובה למינון.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הערכה פרה-קלינית של התערבויות טיפוליות המכוונות למניעים אונקוגניים מתוקתקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובכך היא מאפשרת מחזורי תכנון-ביצוע-בדיקה (design-make-test) איטרטיביים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בתיקוף פונקציונלי של מטרות גנטיות על ידי מתן אפשרות לביטוי מבוקר של אונקוגנים in vitro ו-in vivo.
- סריקה: מייצרת ריאגנטים סטנדרטיים להערכת השפעות של תרכובות על תאים המבטאים אונקוגנים.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות של יעילות התעתוק וביטוי הגן המועבר כסממנים פרמקודינמיים מרכזיים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro למידול מחלות in vivo, ותומכת בהחלטות go/no-go.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר ליצירת מודלים רלוונטיים למחלה עבור מספר מטרות אונקוגניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות התאמה פנוטיפית בין מודלים in vitro למודלים in vivo.
- ערך תפעולי: מספק טרנספקציה בעלת יעילות גבוהה וניתנת לשחזור, עם ייצור ויראלי הניתן להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מפחית תוצאות חיוביות שגויות ביולוגיות על ידי אישור מנגנון המטרה במערכות רלוונטיות למחלה.
- השפעה על פורטפוליו: מסייע בתעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על עוצמה אונקוגנית מאומתת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי יונקים, טכניקות טרנספקציה ונהלי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2).
- תלוי בגישה לתאי 293T, ריאגנטים לטרנספקציה (calcium phosphate, chloroquine) ופלסמידי אריזה.
- מחייב סטנדרטיזציה של טוהר ה-DNA, התכנסות התאים (confluence) ותזמון הקצירה לצורך עקביות בין סדרות.
- דורש התאמה עבור פסאודו-טיפים (pseudotypes) שונים של המעטפת כדי לשנות את הטרופיזם כלפי סוגי תאים ספציפיים.
- מוגבל על ידי קיבולת מטען הגן המועבר (transgene) וסיכון להשתקה (silencing) בתרביות ארוכות טווח או in vivo.
