Name: הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למד כיצד להכין מלאי רטרווירוס שכפול פגומים המקודדים אונקוגן אנושי לחקר מחלות מיאלופרוליפרטיביות במודל עכבר. שיטה זו מאפשרת מחקר מולקולרי של אונקולוגיה ופיתוח טיפולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערב קודם, השינוי התאים צלחת 293T ב 3-5x10 6 תאים / 6 cultureplate רקמות ס&quot;מ. הערה: אנו משתמשים 293T תאים על מנת להקל שלהם transfection ותאי efficacyas וירוס לייצר. תאים אלו חסרים האריזה וירוס אלא עוזר פלסמיד הוא הציג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר הראשון, בעדינות להסיר ולהחליף בינוני עם 4 מ&quot;ל 293T תא התרופה המכילה 25 chloroquine מ&quot;מ. מכניסים חממה שעות 1. הערה: הצלחת צריך להיות בערך 80% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין וירוס קבלת תערובת עבור 2 צלחות בכל פעם, ב 5 צינורות מ&quot;ל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 x 10 מ&quot;ג לבנות פלסמיד retroviral </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 x 5 מ&quot;ג האריזה לבנות (EcoPak), </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 x 62 מ&quot;ל CaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים עם 1 מ&quot;ל סטרילי DDH 2 O הערה: בעוד retroviral פלסמיד המקודד את oncogene עניין סמן, EcoPak מקודד איסור הפרסום-pol-env. יחד עם תאים 293T, הם יוכלו לייצר רטרווירוס ecotropic (RV) ספציפית בתאי עכבר, אך לא זיהומיות עבור תאים אנושיים. שני chloroquine, CaCl 2 הוכחו להגביר את היעילות transfection. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של sterileHBS 2x ירידה מבחינת לתערובת, תוך vortexing בעדינות את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להוסיף את פתרון 2 צלחות, 1 מ&quot;ל כל אחת, בעדינות, טיפה אחר טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים באינקובטור במשך 7 עד 11 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעות הערב (7-11 שעות. מאוחר יותר), להסיר בעדינות בינוני מאוד בעדינות להחליף עם בינוני 5 מ&quot;ל 293T טריים. מכניסים החממה עד הצהריים, למחרת. הערה: שלב זה הוא חשוב, אתה צריך לקחת את chloroquine מן התאים. אם כל הזמן לפרקי זמן, chloroquine רעיל. הפתרון של הצלחות נראה מטושטש, בשל משקעים מצוין כמו אבק, של התערובת transfection. הערה: חשוב לעשות את כל השינויים התקשורת בעדינות קיצוניים, כמו התאים להיות רגיש על ידי chloroquine, והוא יכול בקלות לנתק מן הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, 18-24 שעות. לפני שלקח את וירוס (בצהריים), להסיר בעדינות בינוני מאוד בעדינות להחליף עם המדיום מ&quot;ל 3 293T טריים. החלף באינקובטור O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר השלישי (18-24 שעות. מאוחר יותר), בעדינות למצוץ את הטופס המדיום צלחות עם מזרק 10 מ&quot;ל מצויד במחט G 18. Supernatant זה מכיל את רטרווירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את המחט לסנן מזרק 45 מ&quot;מ, להפוך מזרק מספר פעמים כדי לערבב את פתרון טוב, לעבור דרך supernatant סינון aliquot ב cryotubes הערה: לחילופין, אם אתה עושה 3 + צלחות של הנגיף, בריכת כל supernatants של הנגיף אותו לתוך צינור 5 מ&quot;ל 0 חרוטי. מערבבים היטב, אז supernatants aliquot המכיל את הרטרווירוס cryotubes ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות המכילים את הנגיף מלא supernatants נשמרים -80 ° C עד בשימוש. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

ארבע נקודות קריטיות יבטיח את ההצלחה של מניות ויראלי טוב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים לייצר 293T צריך להיות מאוד בריא, כלומר הם היו מפוצלים לפי לוח זמנים קבוע מאוד, מעולם לא היו מגודלים, והם מצופה בצפיפות של 3.5-5000000 מותאם לכל צלחת 6 ס&quot;מ תרבות רקמות, כדי שיוכלו להגיע צפיפות של 80% הצלחת בבוקרו של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת chloroquine משפרת את היעילות ואת transfection ti...

כל ריאגנטים בשימוש transfection חייב להיות סטרילי, מסוננים (CaCl 2, 2x בהרוורד, miliQ H 2 O) והמשיך סטרילית.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

מחקרים במעבדה שלנו מחלות myeloproliferative האדם הנגרמת על ידי אונקוגנים כגון Bcr-Abl או גורם הגדילה לקולטן הנגזרות אונקוגנים (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα וכו &#39;). אנו מסוגלים מודל מחקר מחלות אנושיות, כמו במודל העכבר שלנו, על ידי השתלת תאים במח העצם נגוע בעבר עם רטרווירוס ביטוי oncogene של עניין. שכפול-פגום רטרווירוס קידוד oncogene האדם סמן (GFP, RFP, גן עמידות לאנטיביוטיקה, וכו &#39;) מופק על ידי פרוטוקול transfection חולף באמצעות תאים 293T, קו אנושי כליות תא אפיתל ממיר את המוצר adenovirus גן E1A. 293 תאים יש את המאפיין יוצא דופן להיות transfectable מאוד על ידי סידן זרחתי (Capo 4), עם יעילות של עד 50-80% transfection להשגה בקלות. כאן, אנו שיתוף transfect 293 תאים עם וקטור retroviral ביטוי oncogene עניין פלסמיד המבטא את איסור הפרסום-pol-env פונקציות אריזה, כגון הגנום יחיד אריזה בונה קאט או PCL, במקרה זה EcoPak פלסמיד. Transfection הראשונית היא שיפור נוסף על ידי שימוש chloroquine. מניות של הנגיף ecotropic, שנאספו supernatant תרבות 48 שעות. פוסט transfection, ניתן לאחסן -80 ° C ו המשמש זיהום של קווי תאים לאור השינוי במבחנה, או תאים ראשוניים כגון עצם לתאי מוח העכבר, כי לאחר מכן ניתן להשתמש להשתלה במודל העכבר שלנו .

טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

המעבדה שלנו חוקרת מחלות מיאלופרוליפרטיביות בבני אדם המושרות על ידי אונקוגנים כגון Bcr-Abl או אונקוגנים המגזרים מקולטני גורמי גדילה (ZNF198-FGFR1, ...

אנו נמצאים כאן במכון למחקר אונקולוגיה מולקולרית במרכז הרפואי Tufts New England. שמי כריסטינה לסקו ואני עמיתת פוסט-דוקטורט במעבדה של ד"ר ריק ואן. המעבדה שלנו עוסקת בחקר לוקמיה מיאלואיד כרונית, CML ומחלות דומות ל-CML בבני אדם.אנו ממדלים מחלה אנושית זו בעכברים, והדרך שבה אנו עושים זאת היא באמצעות הכנסת אונקוגן אנושי באמצעות וקטור רטרו-ויראלי. לכן, הדבר הראשון שיש לעשות כדי להחדיר אונקוגן אנושי זה לתאים של עכברים הוא לייצר את הווירוס עצמו. השלב הבא יהיה לבצע למעשה תהליך של תיתור (titration) לווירוס.זוהי צלחת המלאי שלי של תאי 2 9 3 T. עלי לשטוף את המצע באמצעות PBS. תאי 2 9 3 T הם תאים נ adherent, עם זאת, הם אינם נ adherent בצורה חזקה במיוחד, לכן כל תנועה חייבת להיות עדינה מאוד. לאחר השטיפה, נחליף את ה-PBS ב-trypsin.על מנת לשחרר את התאים מהפלטה, עלינו להחזיר את הפלטה לאנקובטור למשך כשלוש דקות. לאחר שתי עד שלוש דקות, התאים יהיו למעשה בתליה. כעת נוסיף מספר מיליליטרים נוספים של מצע רגיל.פעולה זו תנטרל את ה-tripsin. בשלב זה, אנו מערבבים למעלה ולמטה כדי לוודא שכל התאים נמצאים בסuspended בצורה טובה, אנו מעבירים את התוךייה למבחנה של 50 ml וכדי לספור את התאים בנוכחות trypan blue נשתמש ב-hemocytometer לספירה ידנית. כעת אני מבצע את הדילול כפי שחושב, וכעת אזרע 3*10⁶ תאים לכל צלחת.בארבעה מ"ל מצע, אנ

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.

Lentivirus הפקה

Lentiviruses הם כלי מחקר חשוב לחקר תפקוד הגנים, אולם החוקרים מומלץ להימנע הייצור של קידוד lentivirus pantropic ידוע או אונקוגנים חשד. כחלופה, אנו מציגים פרוטוקול בטוחה יותר לשימוש lentivirus ecotropic על תאים אנושיים שונה לבטא את mSlc7a1 קולטן ecotropic.

התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים...

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת...

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

אנו מתארים פרוטוקול של 9 ימים עבור התמרה והתרחבות של דם היקפי רזוס מקוק תאים מונמוננקה שתשואות תאים עם ביטוי מעולה של הגנים של העניין במספר מספיק עבור מחקרי אינפוזיה של יעילות התא.

התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

למד כיצד להכין מלאי רטרווירוס שכפול פגומים המקודדים אונקוגן אנושי לחקר מחלות מיאלופרוליפרטיביות במודל עכבר. שיטה זו מאפשרת מחקר מולקולרי של אונקולוגיה ופיתוח טיפולים.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

גלה סרטונים נוספים