הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T
December 4th, 2007
טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.
אנחנו כאן במכון המחקר לאונקולוגיה מולקולרית במרכז הרפואי טאפטס ניו אינגלנד. שמי כריסטינה לסקו ואני פוסט-דוקטורנטית במעבדה של ד"ר ריק ואן. המעבדה שלנו עובדת על חקר לוקמיה אימונוגן אנושית, CML ומחלות דמויות CML.
אנחנו מדגמים את המחלה האנושית הזו לעכברים והדרך שבה אנחנו עושים את זה היא על ידי החדרת האונקוגן האנושי דרך וקטור רטרו-ויראלי. אז הדבר הראשון שצריך לעשות כדי להכניס את זה, את האונקוגן האנושי הזה לתאי עכברים הוא לייצר את הווירוס עצמו. הדבר הבא שצריך לעשות יהיה להדק את הנגיף.
אז זו צלחת המלאי שלי, 2 9 3 תאי T. אני אצטרך לשטוף את המדיום עם PBS 2 9 3 תאי T הם תאי הדבקה, עם זאת, הם לא סופר דבקים, כך שכל תנועה צריכה להיות עדינה למדי. ברגע שהוא נשטף, אנחנו הולכים להחליף את ה-PBS בטריפסין.
על מנת להוציא את התאים מהצלחת, עלינו להחזיר את הצלחת לחממה למשך כשלוש דקות. אז אחרי שתיים ושלוש דקות, התאים למעשה בתרחיף. אנו הולכים להוסיף עוד כמה מ"ל של מדיום רגיל.
זה הולך לנטרל את הטריפסינים. בשלב זה, אנו מאכלסים למעלה ולמטה על מנת להיות בטוחים שכל התאים נמצאים יפה בתרחיף, אנו מעבירים את התרחיף לשפופרת של 50 מ"ל וסופרים את התאים בנוכחות כחול משולש ומשתמשים בציטומטר המו כדי לספור אותו ידנית. אז אני עושה את הדילול שלי עכשיו כפי שמחושב ועכשיו אני הולך לפלוט שלושה 10 עד שישה תאים לכל צלחת.
במדיום של ארבעה מ"ל, אנו מוודאים שהתאים מצופים היטב ואנחנו הולכים להחזיר את הצלחות לחממה למשך 16 עד 18 שעות, שזה בדרך כלל למחרת בבוקר. אז אנחנו עכשיו 48 שעות לאחר הדבקה בנגיף GFP. הכלורוקווין משמש כדי להגביר את ספיגת הדנ"א שאנו הולכים לשים על התאים.
שאבנו בעדינות את המדיה הרחק מהתאים, שכעת נדבקו לצלחות בעדינות בצד הצלחת. בשלב זה, אנו הולכים להחליף את הצלחות בחזרה באינקובטורים למשך כשעה. בינתיים, אנו הולכים להכין את תערובת הדנ"א שלנו כך שתחול על התאים, השכבה הראשונה שמבטאת גן עמיד לניאו-מיצין והשנייה שמבטאת בפועל את GFPI משתמשת ב-XI DNA על מנת לשלוט על כל הטרנספקציה.
לבסוף, אנו מוסיפים סידן כלורי. השימוש בסידן כלורי מגביר מאוד את יעילות הטרנספקציה. אנחנו עכשיו שעה מאוחר יותר, לקחנו בערך את הצלחות עם מדיום כלורוקווין ואנחנו הולכים להוסיף את תמיסת הטרנספקציה שלנו.
השלב האחרון שעלינו לעשות הוא למעשה להוסיף מ"ל אחד של שני HBS סטריליים תוך הוספת פתרון H two XHBS. אנחנו צריכים לסובב את הצינור באותו זמן וללכת לאט טיפה אחר טיפה. זאת כדי למנוע משקעים, לחלק מיד מ"ל אחד של תמיסה לצלחת המעניינת ואנחנו עושים זאת שוב טיפה אחר טיפה.
בשלב זה, תאי 2 9 3 T רגישים למדי. בגלל מדיום הכלורוקווין שיש לנו. אנחנו צריכים לכסות את כל השטח ולהזיז את הלוחות כמה שפחות, לתייג את הצלחת עם המבנה שאתה לובש ולחזור על המבנה הבא.
בשלב זה, החלף את הצלחות בחממה למשך שבע עד 11 שעות. לפחות שבעה, אבל לא יותר מ-11 מכיוון שהתאים רגישים מאוד בגלל הכלורוקווין ונצטרך להחליף מדיום לאחר זמן זה. אנו נמצאים כעת כ-30 שעות לאחר העסקה.
זהו השינוי האחרון שלנו במדיום בשלב זה, 2 9 3 תאי C3 T הגיעו למפגש. עלינו, שוב, להיות עדינים מאוד בעת מריחת המדיום החדש בצד הצלחת. אני משתמש במזרק 10 מ"ל עם מחט.
אני הולך להחליף את המחט במסנן, אז אני מערבב היטב את המדיום בשלב זה אספנו את הנגיף שלנו ונוכל למקם אותו במינוס 80 מעלות עד לשימוש לפני השימוש בו. הדבר הראשון שצריך לעשות הוא למעשה להדק את הנגיף. ישנם מספר שלבים רגישים בזמן יצירת הנגיף, והראשון שבהם הוא הריכוז הנכון של 2 9 3 תאי T.
אנו מצפים אותם בשלושה צלחת של 10 עד שישה תאים מכיוון שלאחר 18 שעות הם יהיו בערך 80% מתלכדים. זה עדיין משאיר להם את הזמן לגדול יותר, ולכן 24 שעות לאחר הטרנספקציה הם יהיו 100% קונפלואנטים. הוכח שזה די חשוב עבור טיטר וירוס מצוין.
השלב הבא הוא השימוש בכלורוקווין והשימוש בכלורוקווין למעשה מרגיש את התאים 2 9 3 וכל השינויים במדיום צריכים להיעשות בעדינות רבה על מנת שכל היריעה של 2 9 3 תאי T לא תתרומם מהצלחת. לבסוף, הדנ"א שבו אתה משתמש כדי ליצור וירוס צריך להיות נקי ביותר. אנחנו משתמשים ב-C banded, DNA.
ברגע שיש לנו את הווירוס שלנו, אנחנו שומרים אותו במינוס 80 מעלות. אנחנו בדרך כלל עוקבים אחריו רק פעם אחת על ידי כל fo יפחית את ההידוק של הנגיף פעמיים. לכן, אנחנו אוהבים להקפיא את הנגיף שעשינו ולכן קדימה לפני שאנחנו עושים את הטיטר האמיתי של הנגיף.
בהתאם לנגיפים, ייתכן שיש לנו ביטוי GFP עם הנגיף כדי לעקוב אחר התאים הנגועים בפועל, או שנוכל להיות עמידים לניאו-מיצין. וחשוב מאוד שיהיה למעשה טיטר של הנגיף לפני השימוש בו כדי להיות מסוגל להתאים בין ניסויים או בין מוטציות שונות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
הטכניקה הזו מדגימה דרך יעילה להכין מלאי רטרווירוסים ליקוי-שכפול המקודדים אונוגן אנושי, אשר משמשים לאחר מכן להשראת מחלת מיאלופרוליפרטיבית במודל עכבר.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- אונקולוגיה מולקולרית
- טיפול גנטי
- מודלי עכבר של מחלות
רקע
- לוקמיה אימונוגנית אנושית ומחלות קשורות הן מורכבות ודורשות מודלים יעילים.
- ווקטורים רטרווירוסיים משמשים בדרך כלל להכנסת אונוגנים לתאי מארח.
- רטרווירוסים ליקוי-שכפול הם בטוחים יותר לשימוש במחקר.
- הבנת מנגנוני מחלות מיאלופרוליפרטיביות יכולה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה ליצירת מלאי רטרווירוסים ליקוי-שכפול.
- למודל מחלות הנגרמות על ידי אונוגן אנושי בעכברים.
- לחקור את ההשפעות של הכנסת אונוגנים על תאי עכבר.
שיטות ששימשו
- הכנת מלאי רטרווירוסים ליקוי-שכפול.
- הכנסת אונוגנים אנושיים לתאי עכבר.
- השראת מחלת מיאלופרוליפרטיבית במודלי עכבר.
- ניתוח התקדמות המחלה והשפעותיה על המארח.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של מלאי רטרווירוסים המקודדים את האונוגן האנושי.
- השראת מחלת מיאלופרוליפרטיבית שנצפתה במודל העכבר.
- הוכחת יעילות מערכת הווקטור הרטרוויראלי.
- השגת תובנות לגבי מנגנוני המחלה דרך המודל הזה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה אמינה לחקר השפעות האונוגן האנושי in vivo.
- ניתן להשתמש במודל זה למחקר נוסף של מחלות מיאלופרוליפרטיביות.
- מחקרים עתידיים עשויים להוביל להתערבויות טיפוליות משופרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Replication-defective retrovirus production via transient transfection enables reliable delivery of oncogenes for modeling human hematologic malignancies in preclinical systems. This approach supports target validation by establishing causal links between genetic drivers and disease phenotypes in vivo. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a scalable, standardized platform for mechanistic de-risking of oncogenic pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oncogene function through controlled expression in relevant cellular contexts.
- Operational Value: Supports generation of isogenic models for pathway elucidation and target de-risking.
- Strategic Value: Facilitates hypothesis-driven target validation with measurable phenotypic outputs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized viral stocks for consistent transduction efficiency in screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-titer, reproducible preparation of reporter- or resistance-tagged viral libraries.
- Strategic Value: Supports assay readiness for target engagement and functional readout assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human oncogene-driven pathogenesis in immunocompetent or humanized mouse systems.
- Operational Value: Provides renewable virus stocks for longitudinal studies and dose-response experiments.
- Strategic Value: Enables preclinical evaluation of therapeutic interventions targeting validated oncogenic drivers.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling iterative design-make-test cycles.
- Discovery Biology: Supports functional validation of genetic targets by enabling controlled oncogene expression in vitro and in vivo.
- Screening: Generates standardized reagents for assessing compound effects on oncogene-expressing cells.
- Analytics: Permits quantification of transduction efficiency and transgene expression as key pharmacodynamic markers.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo disease modeling, supporting go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating disease-relevant models across multiple oncogenic targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through phenotypic concordance between in vitro and in vivo models.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-efficiency transfection with scalable virus production.
- Strategic Value: Reduces biological false positives by confirming target mechanism in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on validated oncogenic potency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection techniques, and biosafety level 2 practices.
- Dependent on access to 293T cells, transfection reagents (calcium phosphate, chloroquine), and packaging plasmids.
- Necessitates standardization of DNA purity, cell confluence, and harvest timing for batch-to-batch consistency.
- Requires adaptation for different envelope pseudotypes to alter tropism toward specific cell types.
- Limited by transgene cargo capacity and potential silencing in long-term culture or in vivo.
