הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)
12 בדצמבר 2016
כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה בשלבי התפתחות שונים וביצוע הדמיה אופטית אורכית של פעימות הלב של דרוזופילה באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קוהרנטית אופטית מותאמת אישית (OCM). ניתן לאפיין את השינויים המורפולוגיים והדינמיים הלבביים באופן כמותי על ידי ניתוח הפרמטרים המבניים והתפקודיים של הלב מתמונות OCM.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות את תפקוד הלב של דרוזופילה לאורך in vivo באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה קוהרנטית אופטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות המבנית והתפקודית של דרוזופילה על ידי מתן מדדים, כגון שינויים בקוטר הלב, קצב הלב ותקופת הפעילות הלבבית במהלך המטמורפוזה של דרוזופילה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמיקרוסקופ הקוהרנטיות האופטי מסוגל לדמות לבבות של בעלי חיים קטנים באופן לא פולשני ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.
טכניקה זו עשויה לסייע בחשיפת המנגנונים של מחלות לב אנושיות והקשר להתפתחות הלב בשל הדמיון הגנטי הקיים בין דרוזופילה לחולייתנים. ניתן ליישם שיטה זו גם על מערכות אחרות, כגון קוצב אופטוגנטי ללימוד או טיפול בתפקוד קוצב לב מוחלש במודלים של בעלי חיים. בעת ייצור הזבובים לניסוי זה, אפשרו לזבובי ההורים הרבייה להזדווג ולהטיל ביצים בבקבוקון טרי למשך שמונה שעות.
לפיכך, מצמד הביצים שהוטלו יתפתח לזבובים בגיל דומה. כדי להרכיב זחל להדמיית OCM, הכינו תחילה צד נקי עם חתיכת סרט דו צדדי. דחוף החוצה את כל בועות האוויר הכלואות מתחת לסרט.
לאחר מכן, השתמש במברשת רכה כדי להסיר זחל בגודל הנכון מהבקבוקון. הניחו את הזחל על רקמה נקייה. הסר כל מזון שנדבק אליו באמצעות מברשת לחה ולאחר מכן תן לו להתייבש.
כעת, תחת מיקרוסקופ שדה רחב, אשר את שלב ההתפתחות של הזחל. לאחר מכן, מקם את הזחל כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה להרכבה. לאחר מכן, הורד את השקופית הדביקה על הזחל והשתמש בלחץ מתון כדי להדק אותה לסרט.
הנח את הזחל המותקן על ה-tagהמתכוונן של מערכת ה-OCM בכיוון רוחבי y כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה. חור קטן בבמה שומר על הזחל מחוץ למגע עם מישור הבמה. לומן רחב של צינור הלב נמצא ממקטעים A5 עד A8. באמצעות תמונות בזמן אמת במחשב, מצא את האזור האחורי של צינור הלב והזיז את הבמה קדימה עד שקטע A7 נראה לעין.
כעת, הגדר את הפרמטרים של רכישת התמונה. השתמש ב-100 סריקות A לכל סריקת B והשתמש ב-100 סריקות B. לאחר מכן, הגדר את מתח הסורק כך שיכסה כ-0.28 מילימטרים בכיוון רוחבי x והגדר אותו ל-0 וולט בכיוון רוחבי y.
לאחר מכן, חסום את נתיב קרן הדגימה עם מטלית כהה ולחץ על כפתור ההתחלה בתוכנה כדי לרכוש נתוני רעשי רקע להפחתת רקע. כדי לאסוף תמונות רוחביות במצב M, התאם את הפרמטרים ל-128 סריקות A לכל סריקת B והשתמש ב-4,096 סריקות B. לאחר מכן, כוונן מחדש את המתח כך שיכסה 0.28 מילימטרים בכיוון x ו-0 וולט בכיוון y כמו קודם.
לאחר מכן, רכוש תמונות במצב M רוחבי של מקטע A7 של צינור לב הזבוב. במהלך תהליך שמירת הנתונים, חסום את אלומת ההדמיה עם מטלית כהה כדי למזער את החשיפה לאור לדגימת הדגימה. דמיינו את הלב חמש פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של תפקוד הלב.
כדי לאסוף תמונות תלת מימדיות, השתמש ב-400 סריקות A לכל סריקת B, 800 סריקות B, והשתמש במתח עבור 1.7 מילימטרים ברוחבי x וכ-4 מילימטרים ברוחבי y. לאחר מכן, הזיזו את שלב המיקרוסקופ כדי להתבונן בזבוב כולו והתאימו את המיקוד כדי לראות תמונות ברורות. כדי להסיר את הזחל, השתמש במברשת רטובה ורכה כדי להעביר אותו לבקבוקון חדש עם מזון טרי להמשך התפתחות ומחקר אורך.
הלומן הרחב של צינור הלב נשאר במקטעים A5 עד A8 בשלב הגולם PD1. ב-PD1, השתדל לדמות את מקטע A7, כפי שנעשה עם זחלי שלב L2 ו-L3. שלב הגולם PD1 מזוהה על ידי הגולם הלבן.
חלון זמן זה אידיאלי לביצוע הדמיה אופטית של הגולם המוקדם מכיוון שהשקיפות הגבוהה מובילה לחדירת אור גבוהה יותר להדמיית OCM. נקו את הגולם בעזרת המברשת אם יש מזון שנדבק לגוף. בעזרת מברשת רטובה, הרכיבו את הגולם על מגלשת זכוכית קטנה והשאירו את הצד הגבי כלפי מעלה.
המגלשה צריכה להתאים לצינור זבוב כדי לשמר את התפתחות החיה בתא משלה. יבשו את עודפי המים מהגולם ולאחר מכן הניחו אותם על הבמה כשהגולם פונה כלפי מעלה והמשיכו לדמות את קטע A7 כפי שנעשה עם הזחל. לאחר ההדמיה, העבירו את מגלשת הזכוכית עם הגולם לתוך הצינור לתרבית רציפה.
לאחר שלב ה-PD1, החל מה-PD2, מתחיל להתפתח תא חרוטי בין מקטעי A1 ו-A4. מכיוון שהגולם הופך אטום יותר בהדרגה, עומק החדירה של מערכת ההדמיה מצטמצם. ב-PD2, קליפת הגולם הופכת צהבהבה והגוף פחות שקוף מ-PD1.
ב-PD3, צבע הגולם עדיין מעט כהה יותר מזה של שלב PD2. בשלב PD4 ניתן להבחין בפסים שחורים בתוך המעטפת. חלק מה-PD4 יתפתח למבוגרים ואחרים ייכנסו לשלב PD5.
בשלב ה-PD5, הפסים השחורים בולטים עוד יותר. הרם גולם PD2 באמצעות פינצטה והרכיב אותו על מגלשה. במערכת OCM, מצא את הקצה הקדמי של צינור הלב ולאחר מכן זז כ-50 מיקרון לכיוון האחורי כדי למצוא את מקטע A1 של צינור הלב.
שימו לב שבשלב PD2, החדר החרוטי של הלב קטן מאוד וייתכן שעדיין אינו פועם. המשך בהדמיה כפי שתואר קודם לכן. חזור על אותו הליך להדמיית דרוזופילה בשלבי PD3, PD4 ו-PD5.
כדי להתחיל, העבירו את הזבוב הבוגר לבקבוקון ריק בנפח של כ-45 מיליליטר. לאחר מכן, טבלו מוליך כותנה בתמיסת ההרדמה והכניסו את השרביט לבקבוקון עם קצה הכותנה ממש מתחת לפקק הכותנה. המתן שלוש דקות.
הזבוב הבוגר יורדם במשך שתיים וחצי עד שלוש וחצי דקות, תלוי בגודלו. כעת הכינו שקופית זכוכית עם חתיכת סרט דו צדדי. לאחר מכן, בעזרת מברשת רכה, הזיזו את הזבוב המורדם על מגלשת הזכוכית כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה.
תחת מיקרוסקופ שדה רחב, מפרידים את הכנפיים באמצעות פינצטה ומדביקים אותן לסרט, ובכך חושפים את אזור הלב להדמיה. כעת, השתמשו בטכניקת ההדמיה שתוארה קודם לכן כדי לדמות את מקטע ה-A1 של הלב ולהקריב את הזבוב בסוף הניסוי. הדמיית לב אורכית בוצעה באמצעות זבובי מתח עם עותק אחד של מנהל ההתקן 24B-GAL4.
בשלבי הזחל, צינור הלב מתחיל באזור הבטן האחורי A8 עם לומן רחב יותר ומסתיים במקטע הגבי הקדמי A1 בקוטר צר יותר. מאוחר ב-PD2, תא חרוטי החל להתפתח בקטע A1 עד A4. קצב הלב של הזבוב כומת מתמונות OCM רוחביות במצב M.
באופן מוזר, במהלך שלבי הגולם, הלב הפסיק לפעום מדי פעם. בסך הכל, פעימות הלב האטו באופן משמעותי משלב הזחל לשלב הגולם ולאחר מכן גדלו באופן משמעותי מגולם לבוגר. מאז פיתוח זה, טכניקה זו העניקה לחוקרים בתחום הקרדיולוגיה ההתפתחותית כלי חדש לחקור את ההשפעות של גנים שונים על התפתחות הלב במודלים של דרוזופילה.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב בקפידה אחר התפתחות דרוזופילה על מנת ליצור תמונות בכל שלב התפתחותי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקולים להכנת זבובי Drosophila בשלבי התפתחות שונים וביצוע דימות אופטי לאורכי של פעימות לב באמצעות מערכת מותאמת אישית של מיקרוסקופיה בקוהרנטיות אופטית (OCM). המחקר מאפיין כמותית שינויים מורפולוגיים ודינמיים של הלב באמצעות ניתוח פרמטרים מבניים ותפקודיים של הלב מתוך תמונות OCM.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- דימות לבבי
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל לחקר התפתחות הלב.
- מיקרוסקופיה של קוהרנטיות אופטית מאפשרת דימות לא פולשני של לבבות של בעלי חיים קטנים.
- הטכניקה מספקת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.
- הבנת תפקוד הלב של Drosophila עשויה לחשוף תובנות לגבי מחלות לב בבני אדם.
מטרת המחקר
- להדמיה אורכית של תפקוד הלב ב-Drosophila in vivo.
- לספק מדדים של קוטר הלב, קצב הלב ופעילותו במהלך המטמורפוזה.
- לבחון דמיון גנטי בין Drosophila לבין חולייתנים בהתפתחות הלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של Drosophila בשלבי התפתחות שונים.
- דימות אורך (Longitudinal imaging) באמצעות מערכת מותאמת אישית של מיקרוסקופיית קוהרנטיות אופטית (OCM).
- ניתוח פרמטרים מבניים ותפקודיים של הלב מתמונות OCM.
- יישום הטכניקה על מערכות אחרים, כגון קוצבי לב אופטוגנטיים.
תוצאות עיקריות
- אפיון כמותי של שינויים מורפולוגיים בלב.
- הערכת קצב הלב ותקופת הפעילות במהלך המטמורפוזה.
- חשיפת מנגנונים של התפתחות הלב ומחלות לב.
- יישומים פוטנציאליים בחקר תפקוד פגום של קוצב הלב.
מסקנות
- טכניקת ה-OCM יעילה להדמיה לא פולשנית של לבבות Drosophila.
- הממצאים עשויים לתרום להבנת מחלות לב בבני אדם.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון מערכים ניסיוניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי longitudinal in vivo של תפקוד הלב ב-Drosophila באמצעות מיקרוסקופיית קוהרנטיות אופטית מאפשר הערכה כמותית של הדינמיקה המבנית והתפקודית של הלב לאורך שלבי הפיתוח. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים, על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים הניתנים לשחזור ובעלי רזולוציה גבוהה, הרלוונטיים למנגנוני מחלות לב בבני אדם. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים באמצעות ניטור סטנדרטי ולא פולשני של קצב הלב, תקופת הפעילות הלבבית ושינויים מורפולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות שינויים בקצב הלב ובמחזור הפעילות הלבבית במהלך המטמורפוזה.
- ערך תפעולי: מספק דימוי לא פולשני וניתן לשחזור של תפקוד הלב ללא צורך בניתוח רקמות או בצביעה.
- ערך ניבוי: תומך בסריקה פנוטיפית של מודיפיקטורים גנטיים המשפיעים על התפתחות ותפקוד הלב.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כולל קצב לב, תקופת פעילות לבבית וקוטר הלב, מתוך תמונות OCM במצב M וב-3D.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרמטרי דימוי עקביים וסגמנטציה של מקטעי צינור הלב A5 עד A8.
- יכולת הרחבה: תומך בתכנון מחקר אורך עם מפגשי דימוי חוזרים בשלבי הזחליל, הגולם והבוגר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור הדינמיקה הלבבית של Drosophila למסלולים גנטיים שמורים בבעלי חוליות.
- המשכיות תרגומית: מאפשר אקסטרפולציה של ממצאים בין מינים בשל אורתולוגיה גבוהה בגנים של מחלות לב.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות go/no-go באמצעות זיהוי שלבי התפתחות שבהם התפקוד הלבבי פגום.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של ביולוגיה של גילוי (discovery biology) על ידי אספקת תוצאות פונקציונליות כמותיות, המנחות את שלבי תיקוף המטרה (target validation) וזיהוי המולקולות המובילות (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות מעקב אורך של מדדי תפקוד הלב במהלך המטמורפוזה.
- סריקה: מספק מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם פרוטוקולי קיבוע והדמיה סטנדרטיים לרכישת נתונים עקבית.
- אנליטיקה: מפיק היסטוגרמות של קצב הלב ותקופות פעילות לבבית, סרטוני M-mode, ותמונות בחתך ציר/en face לצורך ניתוח השוואתי של מצבים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים לבביים של Drosophila למנגנוני מחלות באדם באמצעות מסלולים מולקולריים משותפים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת הדמיה לשימוש חוזר, הישימה על פני שלבי התפתחות ומודלים גנטיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות לב באמצעות דימות תפקודי ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הכנה סטנדרטית של זחלים ובובות, קיבוע ופרמטרי דימות ספציפיים לשלב ההתפתחותי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של פנוטיפים לבביים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם-סיכון של מטרות גנטיות בהתבסס על מסלולים תפקודיים לבביים כמותיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ב-Drosophila, קביעת שלבי התפתחות ותפעול מיקרוסקופ קואורנציה אופטית (OCM).
- תלוי במערכת OCM מותאמת אישית עם קצבי A-scan/B-scan ניתנים להגדרה ובקרת מתח של הסורק.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי נהלי הקיבוע וזיהוי שלבי התפתחות (L2/L3, PD1–PD5).
- כולל שיקולי התאמה לצילום לאורך שלבי התפתחות אטומים עקב הגברת המלניזציה של הגולם.
- מוגבל על ידי ירידה בעומק החדירה בשלבי הגולם המאוחרים, מה שדורש אסטרטגיות דימוג מותאמות לשלב ההתפתחותי.
