בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות של תאי סטרומה ממקור אדיפוציטי, ולבחון את הפעילות האוסטאוגנית שלהם באמצעות בדיקה in vivo. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרגנרטיבית של הפנים והגולגולת, כגון כיצד ניתן להשתמש בתאי גזע ממקור אדיפוציטי כדי ליצור רקמת עצם פונקציונלית מלאה בפגמי עצם פגועים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים מבודדים במהירות מרקמה אנושית טרייה, ובדרך זו התאים נמנעים משהייה בתרבית תאים, דבר הידוע כמשנה את ביטוי הגנים ומסמני השירות התאי.

ההשלכות של טכניקה זו חולות על מטופלים עם פגמי עצם גדולים, כגון אלו הנגרמים על ידי סרטן, טראומה או זיהום. בעתיד ייתכן שיהיה ניתן לבודד אוכלוסיות תאים של ASCs ולהשתמש בהן באופן רגנרטיבי. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, מכיוון שיצירת הפגם בגולגולת (calvarial defect) היא קשה ללמידה, בעיקר משום שהפגם נוצר על גבי גולגולת בעלת מבנה כיפה, ומכיוון שהוא קרוב מאוד לקרום העקבי (dura mater).

עבור פרוטוקול זה, יש לאסוף רק תת-עורי מבטן, ממרפס או מירך מתורם אנושי בריא, ולאחסן אותו במיכל שאיבה מפלסטיק. לשומן, הוסיפו נפח שווה של PBS סטרילי, וערבבו בעזרת ניעור עדין למשך 30 שניות. המתינו לשקיעת השכבה המימית, ולאחר מכן הסירו אותה באמצעות פיפטת פלסטיק של 10 מיליליטר.

לאחר מכן, העבירו את השומן למכל פלסטיק גדול והוסיפו נפח שווה של תערובת עיכול. נקו את מכל השומן האטום בעזרת 70% ethanol, ואטמו אותו באמצעות פאראפין. לאחר מכן, נערו את המכל במהירות של 180 סיבובים לדקה, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות.

בשלב הבא, נטרלו את העיכול על ידי הכפלת נפח התגובה באמצעות מצע סטנדרטי. סובבו את התאים במערך צנטריפוגה, הסירו בזהירות את הנוזל העליון, והשעיקו מחדש כל משקע ב-5 milliliters של מצע סטנדרטי. לאחר מכן, העבירו את כל התליות דרך מסנן של 100 micron אל תוך מבחנה קונוית של 50 milliliter.

סנטריפוג את התסנין בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-300 G. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את המשקע (pellet) בחמישה מיליליטר של באפר לליזת RBC בטמפרטורת החדר. לאחר יצירת הסספנסיה, המתן חמש דקות לליזה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סנטריפוג את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, והשלם את שלבי ההפרדה בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

מיון תאים תקין הוא קריטי לפרוטוקול זה. ראשית, השהו מחדש את התאים בבופר FACS בריכוז של מיליון תאים ל-100 µL, ושמרו אותם על קרח. לאחר מכן, העבירו לפחות 10 מיליון תאים למבחנה פלסטית לצנטריפוגה על קרח המסומנת כ-BMPR-1B.

העבירו מיליון תאים למבחנה על קרח המסומנת כ-"unstained" (לא צבוע), והוסיפו להם 1 mL של FACS buffer. סמנו את שאר התאים כ-"unsorted" (לא ממוינים). לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן למבחנה של BMPR-1B וערבבו באמצעות טריטורציה עדינה.

הדרימו את התערובת זו למשך פרק הזמן המומלץ על ידי היצרן. לאחר מכן, סובבו את התאים במערך צנטריפוגה לצורך מיון FACS, והשאיבו אותם בזהירות במיליליטר אחד של FACS buffer. לאחר מכן, חזרו על הפעולה והשאיבו את התאים בריכוז של מיליון תאים למילליליטר.

כעת, העבירו את שלוש אוכלוסיות התאים דרך מסנני תאים של 40 מיקרון אל תוך מבחנות FACS מזכוכית. השתמשו ב-500 microliters של FACS buffer כדי לשטוף את התאים האחרונים מהמסננים. כעת, הכינו שני מבחנות איסוף, עבור האוכלוסיות החיוביות והשליליות לנוגדנים.

מלאו כל אחד משלושה מיליליטר של מצע תרבית תאים סטנדרטי, ובמכשיר ה-FACS, הרצו תחילה את התאים שאינם צבועים והשתמשו בתוצאות כדי להגדיר שער שלילי (negative gate) עבור הסמן הפלואורסצנטי. לאחר מכן, באמצעות נחיר (nozzle) של 100 מיקרון, מיינו את התאים הצבועים לתוך הפפוקות המתאימות המכילות מצע סטנדרטי. במידת האפשר, שמרו על פפוקות אלו בקירור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהלך המיון.

המשיכו בטעינת התאים אל תוך הפיגום (scaffold) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הרדמת בעל החיים, גזרו כל שיער מאזור הניתוח וקרצפו את העור החשוף עם תמיסת פובידון יוד (povidone iodine), ולאחריה אתנול 70%, שלוש פעמים. לאחר מכן, כסו את בעל החיים בסדין סטרילי, והשאירו את אזור הניתוח חשוף.

כעת, באמצעות סכין מנתחים עם להב מספר 15, בצעו חתך סגיטלי בקו האמצע המשתרע על פני רוב הגולגולת הגבית. לאחר מכן, בעזרת פינצטה בעלת שיניים עדינות, הגבירו את העור בצד ימין של החתך כדי לחשוף את עצם הפריאטלית הימנית. הכינו את המקדח עם מקדח טרפין בעל ציפוי יהלומים בקוטר 4 מילימטר שעבר עיקור באוטוקלב.

לאחר מכן, קדחו פגם בעצם הפריאטלית, אך אל תרחיבו את הפגם מעבר לעצם, והשאירו את שכבת הקשיה (dura mater) ללא פגע. כעת, הכניסו אל תוך הפגם פיגום (scaffold) המכיל תאים או תמיסת ביקורת, וסגרו את החתך בעור באמצעות תפר ניילון רץ. לאחר מכן, המשיכו בפרוטוקולי הטיפול בעכברים לאחר הניתוח כפי שמודרך בפרוטוקול הכתוב.

סריקות Micro CT של פגם הגולגולת שבוצעו ביום הניתוח מראות בבירור את הפגם החדש. סריקות חוזרות בנקודות זמן מאוחרות יותר מראות כי פגמים שמושתלים תאים חיוביים ל-BMPR-1B נסגרים במהירות רבה יותר מאשר פגמים עם תאים שליליים ל-BMPR-1B או תאים שאינם ממוינים. כאשר הריפוי נמדד כאחוז מהסגירה המלאה של הפצע, ניתן להבחין בהבדל בקלות.

בשלב הבא, חלקים מהגולגולות שהכילו את הפגמים עברו דקלציפיקציה וצביעה כדי לזהות עצם רגנרטיבית חדשה ובקרת, באמצעות צביעת Movat's pentachrome, המבדילה בין סחוס לעצם ובין כל שלבי הבשלה שביניהם. בהשוואה לתאים שלא עברו מיון, לתאים חיוביים ל-BMPR-1B הייתה השפעה חזקה על תהליך הרגנרציה, ובמיוחד לאורך גבולות הפגם. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של הפוטנציאל הקליני הגלום בניסוי זה, בבידוד ASCs ספציפיים למטופל ובשימוש בהם לריפוי פגמי עצם.

ניתן להוביל מהתהליך זה ניסויים המשך רבים במטרה להשיב על שאלות נוספות בנושא ריפוי עצם, כגון FACS לבידוד של ASCs עם מחויבויות שושתיות שונות, micro CT לניתוח אופן הריפוי של סוגי תאים ורקמות שונים לאורך זמן, ושימוש במודל פגם הגולגולת בניסוי זה כבסיס לתכנון ניסויי ריפוי עצם נוספים. אין לשכוח כי עבודה עם רקמה אנושית עלולה להיות מסוכנת ביותר. הקפידו לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כולל חבישת כפפות, שימוש במגיני עיניים וסילוק תקין של כל הפסולת המסוכנת.