Name: בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: למדו לבודד תאי סטרומה ממקור שומני עם פוטנציאל אוסטוגני מוגבר ולהשתמש בהם במודל ריפוי פגם calvarial. פרוטוקול זה מספק גישה מבטיחה לרפואה רגנרטיבית בחולים עם פגמי עצם גדולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.D.M. נתמך על ידי מלגת המחקר לתושבים של הקולג' האמריקאי למנתחים (ACS). MSH נתמך על ידי מענק ההכשרה של המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) TG2-01159. M.S.H., H.P.L. ו-M.T.L. נתמכו על ידי פרס מענק המחקר של האגודה האמריקאית למנתחי פה ולסתות (ASMS) / הקרן למנתחי פה ולסתות (MSF). H.P.L. נתמך על ידי מענק R01 GM087609 של NIH ומתנה מאינגריד לאי וביל שו לכבודו של אנתוני שו. H.P.L. ו-M.T.L. נתמכו על ידי מעבדת האגי לרפואה רגנרטיבית לילדים וקרן אוק. M.T.L. נתמך על ידי מענקי NIH U01 HL099776, R01 DE021683-01 ו-RC2 DE020771. D.C.W. נתמך על ידי מענק NIH 1K08DE024269, מעבדת האגי לרפואה רגנרטיבית בילדים, ופרס חוקר הפקולטה של המכון לחקר בריאות הילד באוניברסיטת סטנפורד.

<ol><li>Silber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+site+morbidity+after+anterior+iliac+crest+bone+harvest+for+single-level+anterior+cervical+discectomy+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: an update.</a> Injury. 36, S20-S27 (2005).</li>
<li>Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+graft+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Bone graft substitutes.</a> Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in bone tissue engineering.</a> Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).</li>
<li>Chapekar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: challenges and opportunities.</a> J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects.</a> PLoS One. 5 (6), e11177(2010).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29-positive+selection+enhances+osteogenic+capacity+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).</li>
<li>Wozney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+bone+formation%3A+molecular+clones+and+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.</a> Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).</li>
<li>Wan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+adipose-derived+adult+stromal+cells+requires+retinoic+acid+and+bone+morphogenetic+protein+receptor+type+IB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).</li>
<li>McArdle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+for+bone+morphogenetic+protein+receptor+type-IB+promotes+differentiation+and+specification+of+human+adipose-derived+stromal+cells+toward+an+osteogenic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage.</a> Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (71), e4425(2013).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Lester, S. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLester%2C+SC+%22Manual+of+surgical+pathology%22">Manual of surgical pathology</a>. , Saunders/Elsevier. (2010).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין גילוי נאות.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול בזמן הקציר של ASCs, השלב הקריטי הוא אכול נאות של שומן עם collagenase. עיכול לקוי יגרום בתשואה נמוכה של ASCs. במהלך FACS מיון של תאי BMPR-IB +, חשוב להגדיר את השער בזהירות חיובית. הגדרת שערים מדי רופפת עלולה לגרום אוכלוסיות מיון שאינם טהורים. במהלך היצירה של פגם calvarial, זה קריטי כדי לתחקר את הפגם דרך העצם של הגולגולת אלא לא להתקדם לתוך דורה מאטר. זה יגרום לדימום וחשיפה פזרני של המוח, א...

פגמי עצם סרן כתוצאה מפגיעה, זיהום, או סרטן פולשני להיות השפעה משמעותית על ההתאוששות ואיכות החיים של מטופל. טכניקות קיימות למלא פגמים אלה עם עצם בריא ממקום אחר בגוף החולה עצמו, אך העברה זו נושאת תחלואה סיכון משלה לסיבוכי 1, 2, 3. יתר על כן, פגמים מסוימים הם כל כך גדולים או מורכבים כי עצם מתורם מספיק גדול אינו זמין כדי למלא את הפגם. פרוטזות הן אפשרות פוטנציאל למילוי פגמים גרמיים אבל אלה קשורים עם מספר חסרונות כולל זיהומים, כשל חומרה, ותגובת גוף זר 4. מסיבות אלה יש עניין רב באפשרות של הנדסת תחליפי עצם ביולוגי באמצעות תאים של החולה עצמו 5. שומן שמקורם בתאי סטרומה (ASCs)יש פוטנציאל יישום זה כי הם בשפע זמינים ברקמת השומן של החולה עצמו והם הדגימו את היכולת לרפא פגמי עצם על ידי יצירת רקמת עצם חדשה 6, 7. ASCs הוא אוכלוסייה מגוונת של תאים וכמה מחקרים הראתה כי בחירה עבור סמנים פני תא מסוימים יכולה לייצר אוכלוסיות תאים עם פעילות osteogenic משופרת 8, 9. בחירת ASCs עם פוטנציאל osteogenic הגבוה ביותר תגדיל את הסבירות כי פיגום זורע עם תאים אלה יכול להתחדש פגם עצם גדול. חלבון עצם המוךפו&quot;גנטי שהולך (BMP) איתות היא קריטית להסדרת עצם בידול היווצרות 10 ואת סוג קולטן BMP IB (BMPR-IB) ידוע להיות חשוב עבור osteogenesis ב ASCs 11. לאחרונה, הראינו ביטוי של BMPR-IB יכול בדואר המשמש כדי לבחור עבור ASCs עם פעילות osteogenic משופרת 12. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לבידוד של BMPR-IB להביע ASCs משומן אדם ואחריו assay פעילות osteogenic שלהם באמצעות מודל פגם in vivo calvarial.

<table><tbody><tr><td>מסננת תאים 100 מיקרון</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>אזמל 15 להב</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 באר</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 40 מיקרון</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon ניילון תפר ניילון, 18 אינץ', מחט P-3, &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BMPR-IB נוגדנים ראשוניים</td><td>R& מערכות D</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות BioGel PI</td><td>M&ouml; lnlycke בריאות</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסטרו-וייחו נהג מחט</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 עכבר עירום</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II אבקה</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה: סכין עגולה 4.0 מ"מ</td><td>Xemax כירורגי</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה: Z500 מיקרומוטור ללא מברשות</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>רפידות תחתונות סופגות של פישרברנד, 20 אינץ' x 24 אינץ'</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד כרית גזה כותנה סטרילית, 4 אינץ' x 4 אינץ'</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS בינוני</td><td>GE&nbsp; מדעי החיים</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>איזותזיה איזופלורן</td><td>הנרי שיין&nbsp;</td><td></td><td></td>050033</tr><tr><td>מיקרו מלקחיים עם שיניים</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מלקחיים עם שיניים</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>סרט פרפין (פרפילם)</td> <td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פיגומי PLGA</td><td>ניסוח קנייני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פולוקסמר 188, 10%</td> <td>סיגמא</td><td>P5556-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>שדה סטרילי פולילינד, 18 אינץ' x 24 אינץ'</td> <td>חד פעמי לבית חולים</td><td>696</td><td>חותכים חור מלבני בגודל המתאים</td></tr><tr><td>תמיסת פוליסוכרוז: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine Prep Solution</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים Puralube petrolatum, צינור 1/8 אונקיות</td><td>Dechra מוצרים</td><td></td><td></td>וטרינריים</tr><tr><td>מאגר ליזה RBC</td><td>סיגמא</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Webcol הכנה לאלכוהול</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד מהיר של bmpr-ib + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

סרטן פולשני, פציעות חמורות וזיהום עלולים לגרום למומים בעצם גדולים מכדי לשחזר אותם עם עצם קיימת מגופו של המטופל עצמו. היכולת לגדל עצם דה נובו באמצעות תאים של המטופל עצמו תאפשר למלא פגמים גרמיים ברקמה מספקת ללא התחלואה של קצירת עצם מקומית. יש עניין בשימוש בתאי סטרומה שמקורם בשומן (ASCs) כמקור להנדסת רקמות מכיוון שאלה מתקבלים ממקור שופע: רקמת השומן של המטופל עצמו. עם זאת, ASCs הם אוכלוסייה הטרוגנית ותת-אוכלוסיות מסוימות עשויות להיות יעילות יותר ביישום זה מאחרות. בידוד של האוכלוסייה האוסטיאוגנית ביותר של ASCs יכול לשפר את היעילות והאפקטיביות של תהליך הנדסת עצם. בפרוטוקול זה, ASCs מתקבלים מרקמת שומן תת עורית מתורם אנושי. תת-האוכלוסייה של ASCs המבטאת את הסמן BMPR-IB מבודדת באמצעות FACS. תאים אלה מיושמים לאחר מכן על בדיקת ריפוי פגמים קלוריאליים in vivo ונמצא שיש להם פוטנציאל התחדשות אוסטאוגני משופר בהשוואה לתאים לא ממוינים.

CT מיקרו סריקה נעשה ביום הניתוח יציג את פגם הגולגולת בבירור. בשלב זה לא יהיה ingrowth לתוך פגם 4 מ&quot;מ. סריקות אחריו מתקבלות לאורך הזמן לכמת את גודל הפגם לאורך זמן בהשוואה לקו הבסיס. פגמים זורעים עם BMPR-IB + תאים צריכים להפגין סגר מהיר יותר של הפגם בהשוואת BMPR-IB- ותאי לא ממוין (איור 5). בנוסף, החלק של הגולגולת המכילה את הפגם ניתן decalcified ומעובד היסטולוגיה באמצעות שיטות סטנדרטיות 12. סעיפים מוכתם בכתם pentachrom...

תאי סטרומה שמקורם בשומן עשויים להיות שימושיים להנדסת רקמה חדשה מתאי המטופל עצמו. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של תת-אוכלוסייה של תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי (ASCs) עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, ואחריו יישום התאים בבדיקת ריפוי קלוריאלי in vivo.

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות של תאי סטרומה ממקור אדיפוציטי, ולבחון את הפעילות האוסטאוגנית שלהם באמצעות בדיקה in vivo. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרגנרטיבית של הפנים והגולגולת, כגון כיצד ניתן להשתמש בתאי גזע ממקור אדיפוציטי כדי ליצור רקמת עצם פונקציונלית מלאה בפגמי עצם פגועים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים מבודדים במהירות מרקמה אנושית טרייה, ובדרך זו התאים נמנעים משהייה בתרבית תאים, דבר הידוע כמשנה את ביטוי הגנים ומסמני השירות התאי.ההשלכות של טכניקה זו חולות על מטופלים עם פגמי עצם גדולים, כגון אלו הנגרמים על ידי סרטן, טראומה או זיהום. בעתיד ייתכן שיהיה ניתן לבודד אוכלוסיות תאים של ASCs ולהשתמש בהן באופן רגנרטיבי. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, מכיוון שיצירת הפגם בגולגולת (calvarial defect) היא קשה ללמידה, בעיקר משום שהפגם נוצר על גבי גולגולת בעלת מבנה כיפה, ומכיוון שהוא קרוב מאוד לקרום העקבי (dura mater).עבור פרוטוקול זה, יש לאסוף רק תת-עורי מבטן, ממרפס או מירך מתורם אנושי בריא, ולאחסן אותו במיכל שאיבה מפלסטיק. לשומן, הוסיפו נפח שווה של PBS סטרילי, וערבבו בעזרת ניעור עדין למשך 30 שניות. המתינו לשקיעת השכבה המימית, ולאחר מכן הסירו אותה באמצעות פיפטת פלסטיק של 10 מיליליטר.לאחר מכן, העבירו את השומן למכל פלסטיק גדול והוסיפו נפח שווה של תערובת עיכול. נקו את מכל השומן האטום בעזרת 70% ethanol, ואטמו אותו באמצעות פאראפין. לאחר מכן, נערו את המכל במהירות של 180 סיבובים לדקה, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות.בשלב הבא, נטרלו את העיכול על ידי הכפלת נפח התגובה באמצעות מצע סטנדרטי. סובבו את התאים במערך צנטריפוגה, הסירו בזהירות את הנוזל העליון, והשעיקו מחדש כל משקע ב-5 milliliters של מצע סטנדרטי. לאחר מכן, העבירו את כל התליות דרך מסנן של 100 micron אל תוך מבחנה קונוית של 50 milliliter.סנטריפוג את התסנין בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-300 G. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את המשקע (pellet) בחמישה מיליליטר של באפר לליזת RBC בטמפרטורת החדר. לאחר יצירת הסספנסיה, המתן חמש דקות לליזה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סנטריפוג את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, והשלם את שלבי ההפרדה בהתאם לפרוטוקול הכתוב.מיון תאים תקין הוא קריטי לפרוטוקול זה. ראשית, השהו מחדש את התאים בבופר FACS בריכוז של מיליון תאים ל-100 µL, ושמרו אותם על קרח. לאחר מכן, העבירו לפחות 10 מיליון תאים למבחנה פלסטית לצנטריפוגה על קרח המסומנת כ-BMPR-1B.העבירו מיליון תאים למבחנה על קרח המסומנת כ-"unstained" (לא צבוע), והוסיפו להם 1 mL של FACS buffer. סמנו את שאר התאים כ-"unsorted" (לא ממוינים). לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן למבחנה של BMPR-1B וערבבו באמצעות טריטורציה עדינה.הדרימו את התערובת זו למשך פרק הזמן המומלץ על ידי היצרן. לאחר מכן, סובבו את התאים במערך צנטריפוגה לצורך מיון FACS, והשאיבו אותם בזהירות במיליליטר אחד של FACS buffer. לאחר מכן, חזרו על הפעולה והשאיבו את התאים בריכוז של מיליון תאים למילליליטר.כעת, העבירו את שלוש אוכלוסיות התאים דרך מסנני תאים של 40 מיקרון אל תוך מבחנות FACS מזכוכית. השתמשו ב-500 microliters של FACS buffer כדי לשטוף את התאים האחרונים מהמסננים. כעת, הכינו שני מבחנות איסוף, עבור האוכלוסיות החיוביות והשליליות לנוגדנים.מלאו כל אחד משלושה מיליליטר של מצע תרבית תאים סטנדרטי, ובמכשיר ה-FACS, הרצו תחילה את התאים שאינם צבועים והשתמשו בתוצאות כדי להגדיר שער שלילי (negative gate) עבור הסמן הפלואורסצנטי. לאחר מכן, באמצעות נחיר (nozzle) של 100 מיקרון, מיינו את התאים הצבועים לתוך הפפוקות המתאימות המכילות מצע סטנדרטי. במידת האפשר, שמרו על פפוקות אלו בקירור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהלך המיון.המשיכו בטעינת התאים אל תוך הפיגום (scaffold) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הרדמת בעל החיים, גזרו כל שיער מאזור הניתוח וקרצפו את העור החשוף עם תמיסת פובידון יוד (povidone iodine), ולאחריה אתנול 70%, שלוש פעמים. לאחר מכן, כסו את בעל החיים בסדין סטרילי, והשאירו את אזור הניתוח חשוף.כעת, באמצעות סכין מנתחים עם להב מספר 15, בצעו חתך סגיטלי בקו האמצע המשתרע על פני רוב הגולגולת הגבית. לאחר מכן, בעזרת פינצטה בעלת שיניים עדינות, הגבירו את העור בצד ימין של החתך כדי לחשוף את עצם הפריאטלית הימנית. הכינו את המקדח עם מקדח טרפין בעל ציפוי יהלומים בקוטר 4 מילימטר שעבר עיקור באוטוקלב.לאחר מכן, קדחו פגם בעצם הפריאטלית, אך אל תרחיבו את הפגם מעבר לעצם, והשאירו את שכבת הקשיה (dura mater) ללא פגע. כעת, הכניסו אל תוך הפגם פיגום (scaffold) המכיל תאים או תמיסת ביקורת, וסגרו את החתך בעור באמצעות תפר ניילון רץ. לאחר מכן, המשיכו בפרוטוקולי הטיפול בעכברים לאחר הניתוח כפי שמודרך בפרוטוקול הכתוב.סריקות Micro CT של פגם הגולגולת שבוצעו ביום הניתוח מראות בבירור את הפגם החדש. סריקות חוזרות בנקודות זמן מאוחרות יותר מראות כי פגמים שמושתלים תאים חיוביים ל-BMPR-1B נסגרים במהירות רבה יותר מאשר פגמים עם תאים שליליים ל-BMPR-1B או תאים שאינם ממוינים. כאשר הריפוי נמדד כאחוז מהסגירה המלאה של הפצע, ניתן להבחין בהבדל בקלות.בשלב הבא, חלקים מהגולגולות שהכילו את הפגמים עברו דקלציפיקציה וצביעה כדי לזהות עצם רגנרטיבית חדשה ובקרת, באמצעות צביעת Movat's pentachrome, המבדילה בין סחוס לעצם ובין כל שלבי הבשלה שביניהם. בהשוואה לתאים שלא עברו מיון, לתאים חיוביים ל-BMPR-1B הייתה השפעה חזקה על תהליך הרגנרציה, ובמיוחד לאורך גבולות הפגם. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של הפוטנציאל הקליני הגלום בניסוי זה, בבידוד ASCs ספציפיים למטופל ובשימוש בהם לריפוי פגמי עצם.ניתן להוביל מהתהליך זה ניסויים המשך רבים במטרה להשיב על שאלות נוספות בנושא ריפוי עצם, כגון FACS לבידוד של ASCs עם מחויבויות שושתיות שונות, micro CT לניתוח אופן הריפוי של סוגי תאים ורקמות שונים לאורך זמן, ושימוש במודל פגם הגולגולת בניסוי זה כבסיס לתכנון ניסויי ריפוי עצם נוספים. אין לשכוח כי עבודה עם רקמה אנושית עלולה להיות מסוכנת ביותר. הקפידו לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כולל חבישת כפפות, שימוש במגיני עיניים וסילוק תקין של כל הפסולת המסוכנת.

rapid-isolation-bmpr-ib-adipose-derived-stromal-cells-for-use

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות...

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של שומן הנגזר מתאי סטרומה lipoaspirate ויצירת 4 calvarial פגם קריטי בגודל מ"מ להעריך התחדשות שלד.

תיקון של דגם פגם Calvarial הקריטי בגודל תאי שומן באמצעות נגזרת סטרומה נקטפו מן Lipoaspirate

כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

ניתן להגדיר את הטרוגניות השעתוק בתוך תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי ברמת התא הבודד באמצעות סמני פני התא וגנים אוסטאוגניים.  אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בזרימה ציטומטרית לבידוד תת-אוכלוסיות תאים עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, אשר עשוי לשמש לשיפור שחזור השלד הגולגולתי.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות.

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

אנו מציעים הרחבה תא פרוטוקול על macroporous microcarriers ואת השימוש בהם כמערכת משלוח ב זלוף מגיב ביולוגי כדי להפיץ מטריצה רקמות decellularized. אנו גם כוללים טכניקות שונות כדי לקבוע התפשטות תאים ואת הכדאיות של תאים תרבותי על microcarriers. יתר על כן, נדגים את הפונקציונליות של התאים לאחר ביוריאקטור תרבויות.

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

המספר של הרומן biomaterials מתוכנן עבור תיקון גדול עצמות נגעים מתרחבת באופן רציף, במטרה לשפר את עצם ריפוי ולהתגבר על הסיבוכים עם השתלת עצם. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה רב תחומיים לניסויים קליניים הביו של biomaterials לתיקון העצם.

פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם

מאמר זה מציג שיטה המשלבת דבקות של מח עצם שלם ומיון ציטומטריה זרימה לבידוד, טיפוח, מיון וזיהוי תאי גזע מזנכימליים של מח עצם מלסת חולדה.

בידוד וטיפוח של תאי גזע מסנכימליים במח עצם מנדיבול בחולדות

לתאי גזע מזנכימליים ממח עצם הלסת תפקידים משמעותיים בהתמיינות מגוונת, התחדשות עצמית ומודולציה חיסונית. הם התגלו כמאגר חיוני של תאים מקדימים בריפוי גנטי, הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. כאן אנו מציגים שיטה ייחודית לבידוד תאי גזע מזנכימליים של מח עצם הלסת בחולדות.

טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה

הבידודשל MSCs גבוהיםMFGE8 של BAMBI, אחת משלוש תת-הקבוצות העיקריות המרכיבות UC-MSCs אנושיים הטרוגניים, מסייע להבנה מלאה של המאפיינים והפונקציות של תת-סוג זה ליישום עתידי שלו לשיפור היעילות הקלינית במחלות ספציפיות. כאן, אנו מציגים שיטה למיון BAMBIגבוהMFGE8 UC-MSCs.

בידוד של תאי סטרומה מזנכימלייםשמקורםבחבל הטבור גבוה BAMBI גבוה MFGE8

למדו לבודד תאי סטרומה ממקור שומני עם פוטנציאל אוסטוגני מוגבר ולהשתמש בהם במודל ריפוי פגם calvarial. פרוטוקול זה מספק גישה מבטיחה לרפואה רגנרטיבית בחולים עם פגמי עצם גדולים.

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

גלה סרטונים נוספים