קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למפות את תוכנית תזמון השכפול של הגנום כולו בתא נבחר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השכפול, כגון האופן שבו תוכנית השכפול הגנומית משתנה במצב בריאותי ובמצב מחלתי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה דרך מהירה ופשוטה למיפוי עיתוי השכפול בתאים ובתנאים שונים. הכותב של פרוטוקול ה-fax הוא Dan Lehmann, מומחה fax בפקולטה לרפואה. פרוטוקול זה מתחיל בדרך כלל עם לפחות one to two times ten to the sixth תאים לא מסונכרנים בעלי קצב צמיחה מהיר.

עבור תאים נצמדים, יש לשאוב ולשטוף כל צלחת עם שלושה מיליליטר של PBS ללא סידן או מגנזיום. יש להסיר את ה-PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של Trypsin-EDTA מסחרי לכל צלחת. יש לדגור את התאים למשך חמש דקות, בטמפרטורה של 37 °C, עד להפרדתם.

הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע גידול כדי לנטרל את ה-Trypsin ואספו את התאים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר או לשפופרת פוליסטירן של חמישה מיליליטר. שמרו את התאים על קרח. כדי להתחיל בהליך זה, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 x G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

שאבו ושטפו את התאים ב-1 ml של PBS קר. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים. לאחר השטיפה השנייה, הסירו את ה-PBS והשאיבו מחדש את התאים ב-250 µL של PBS קר.

תוך כדי ערבוב עדין של המבחנה בוורטקס, הוסיפו באיטיות ובטפטוף 800 µL של אתנול בטוהר גבוה, 100%, בטמפרטורה של -20 °C. פעולה זו תוביל לריכוז אתנול סופי של 70% עד 80%. הדגירו את התאים על קרח למשך 30 דקות.

התחל את הפרוצדורה על ידי צנטריפוגציה של התאים המקובעים ב-500 x G למשך עשר דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. שאב את העלייה בזהירות ושטוף את התאים פעמיים עם 1 milliliter של PBS קר. בצע צנטריפוגציה לאחר כל שטיפה.

לאחר השטיפה השנייה, שאבו את הנוזל העליון ותלה את כל תא באמצעות תערובת ה-PI הבאה: מיליליטר אחד של PBS המכיל 5 µL של RNAase בריכוז 10 mg/mL, ו-50 µL של propidium iodide בריכוז 1 mg/mL. סננו את הדגימה דרך רשת של 35 µm אל תוך מבחנה מפוליסטירן של 5 mL.

אטמו את המבחנה בעזרת parafilm. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. שמרו את הדגימות בחושך, מכיוון ש-propidium iodide רגיש לאור.

התאים ימוינו באמצעות מכשיר FACS. השתמש בלייזר בנצנחות 561 כדי להבדיל בין תאים על בסיס עוצמת ה-propidium iodide שלהם. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש בדיזה הקטנה ביותר המומלצת עבור גודל התא הספציפי.

עבור רוב התאים, הגודל הוא 85 micrometers. השתמשו בזרימה איטית ויציבה. בדרך כלל עד 300 עד 500 אירועים לשנייה.

באמצעות Gating, יש להבדיל בין תאים מתים לבין פסולת תת-תאית על ידי שרטוט FCS מול SSC. מתוך התאים החיוניים, יש להבדיל דובלטים על ידי שרטוט SSC width מול SSC height, ולאחריו שרטוט FFC width מול FFC height, ושרטוט propidium iodide width מול propidium iodide height. עבור התאים החיוניים המאותתים, יש להפיק היסטוגרמה של עוצמת שטח ה-propidium iodide, המייצגת את תכולת ה-DNA של התאים.

מיינו את התאים בתנאים קרים לשלבי G1 ו-S. הגדרת השער (Gating) עבור שלב S צריכה להיות רחבה ולחפוף לשלבי G1 ו-G2, בעוד שהגדרת השער עבור G1 צריכה להיות צרה וככל שניתן רחוק משלב S.

עבור סוגי תאים מסוימים, עשוי להיות קשה להשיג התפלגות תקינה של מחזור התא. הדבר הקריטי ביותר הוא לבודד את שלב G1 ללא תאי שלב S. הוצא את המבחנות עם התאים הממוינים ממכשיר ה-fax.

יש לשמור את המבחנות על קרח לאחר המיון. בעקבות מיון התאים, ה-DNA של כל דגימה מופק באמצעות ערכה מסחרית לטיהור DNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, יש לבצע שבירה (shearing) של ה-DNA באמצעות ultrasonicator ממוקד עד להשגת גודל שיא ממוצע של 250 base pairs.

יש לאמת את גודל ה-DNA הגזום באמצעות אלקטרופורזה. התפלגות הגודל המומלצת היא 200 עד 700 זוגות בסיסים עם שיא של כ-250 זוגות בסיסים. לאחר מכן, הספרייה מוכנה, מעובדת בריצוף ומנותחת כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

מוצגת מפת זמני רפליקציה עבור כרומוזום 1 כולו מתאי פיברובלסטים עובריים של עכבר. במבט מקרוב יותר על אזור של כ-50 megabases. הנקודות מייצגות את יחס ה-S ל-G1 הנורמלי עבור חלונות בודדים, והקו הרציף מייצג את התוצאות מאינטרפולציה חלקה מעוקבת (cubic smoothly interpolation).

ערכי S to G1 גבוהים תואמים לשכפול מוקדם, בעוד שערכים נמוכים תואמים לשכפול מאוחר. החיצים האדומים מצביעים על דוגמאות של אזורים בעלי זמן שכפול קבוע, והחיצים הירוקים מצביעים על אזורי מעבר זמניים. איור זה מראה את השחזוריות של מפות זמן השכפול בין שלושה חזרות (triplicates) של פיברובלסטים עובריים של עכבר, בהשוואה לשלושה חזרות של תאי pre-B של עכבר באותו אזור של 18 megabase בכרומוזום 1 של העכבר.

החצים הכתומים מצביעים על דוגמאות לאזורים דיפרנציאליים בין קווי התאים. מפת חום של מתאמי Spearman בין ששת הדגימות מאשרת עוד יותר את התוצאות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו, החל מאיסוף התאים ועד להפקת המפות, בתוך שבוע אחד אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק מפות גנומיות של זמני רפליקציה עבור תאים בצמיחה.