Name: קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: חקור מיפוי תזמון שכפול גנומי ביונקים בשיטת CNR-ToR. השיטה משתמשת ב-FACS לסינון תאי G1 ו-S וניתוח יחס S/G1 ליצירת מפות רזולוציה גבוהה של תזמון שכפול DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אוריה ורד לסיוע ביצירת דמויות. עבודה בקבוצה היא נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (567/10 מס מענק) ואת המועצה האירופית למחקר החל גרנט (# 281,306).

הערה: TOR יכול להימדד רק לגדול, תאים לא מסונכרנים. ההליך צריך להתחיל עם לפחות 1 - 2 x 10 6 מהירי תאים גדלים, אשר בדרך כלל יגרמו ~ 1 x 10 5 תאים בשלב S (צעד הגבלת השיעור). מומלץ לנהל כל ניסוי באמצעות שניים או שלושה משכפל. התהליך כולו של CNR-תור ניתן להשלים בתוך שבוע - ימים אמורים להיות מוקדשים לכל השלבים עד כנת ספרייה, יום או ימים נדרשים עבור סידור ויום נוסף הוא הכרחי עבור ניתוח נתונים הראשוני. 1. איסוף של תאים מן התרבות הערה: הפרוטוקול נכתב עבור התאים הגדלים בתרבית 10 צלחות ס&quot;מ (המכיל כ 2 - 5 x 10 6 תאים), אך ניתן להתאימו בקלות לפלטפורמות אחרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים שגודלו השעיה, המשך קיבעון (סעיף 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חסידים, לשאוב ולשטוף את plמ&quot;ל PBS אכל עם 3 ללא Ca 2 + ו Mg 2+. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS ו דגירה התאים למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 1-EDTA טריפסין מסחרי מ&quot;ל עד תאים לנתק. הערה: משך הטיפול טריפסין צריך להיות מותאם לכל סוג תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 התקשורת והתרבות מ&quot;ל לנטרל את טריפסין ולאסוף תאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל או צינור קלקר 5 מ&quot;ל. שמור על הקרח. </li></ol> קיבוע 2. הערה: עבור חלק זה, כל השלבים צריכים להיעשות על 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולשטוף תאים פעמיים עם 1 מ&quot;ל קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 250 μL (סה&quot;כ) PBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד vortexing את הצינור בעדינות, לאט להוסיף dropwise 800 μL של -20 ° C אתנול 100%. זה מוביל לריכוז אתנול סופי של 70 - 80%. הערה: אתנול טוהר גבוה מומלץ בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים על קרח FOr 30 דקות. הערה: בשעה תאים בשלב זה יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או במשך כמה חודשים ב -20 ° C. </li></ol> 3. PI מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant בזהירות לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ&quot;ל קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ו resuspend כל המדגם עם תערובת הבאים: 1 מ&quot;ל PBS, 5 μL 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNaseA, 50 μL 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​יודיד propidium (PI; לערבב הבקבוק לפני השימוש). התאם ריכוז עד ~ 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל). הערה: יש להרחיק מהישג אור - PI הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון דרך 35 מיקרומטר רשת לצינור קלקר 5 מ&quot;ל, וקרוב עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT בחושך, במשך 15 - 30 דקות. הערה: תאים מוכנים כעת לניתוח FACS. במידת הצורך, ניתן לאחסן את התאים מוכתם עבור 24 שעות לפחות ב 4 ° C בחושך. </li></ol> מיין 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מיין באמצעות מכונת FACS. לָנוּדואר הלייזר 561 ננומטר להבדיל תאים בהתבסס על עוצמת PI שלהם. לייזרים אחרים לקראת מקסימום עירור 535 ננומטר כמו 488 ננומטר או 532 ניתן להשתמש בהתאם לתצורת מכשיר FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש הזרבובית הקטנה מומלצת בגודל התאים הספציפי (לרוב תאי 85 מיקרומטר). תיעדוף מצבים טוהר מעל התשואה. השתמש זרימה איטית יציבה, בדרך כלל עד 300-500 אירועים / s, עם לחץ נדן של 45 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות gating, להפלות תאים מתים ופסולת subcellular (FCS נמוך וגבוה SSC) על ידי התוויית FCS vs SSC. מן התאים קיימא להפלות כפילויות על ידי התוויית SSC-רוחב (W) לעומת SSC-גובה (H) ואחריו FSC-W לעומת העלילה FSC-H ועל ידי נרדף למלק W vs PI-H (כפילויות יהיה אותו ערך H אבל W-ערך גדול). עבור תאים בודדים קיימא לצייר היסטוגרמה של עוצמת PI-שטח (א) המייצגת את תוכן ה- DNA של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מיין לשלבים G1 ו- S, כפי שמוצג באיור 1. Gating עבור S צריך להיות רחב להפריע לשלבים G1 ו G2, בעוד gating G1 צריך להיות צר וככל מ S ככל האפשר. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> נחישות באיור 1. שלב מחזור התא מבוסס על עוצמת PI. היסטוגרמה המציגה את התפלגות תוכן DNA התאי (נמדד על ידי PI-Area) של האוכלוסייה פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF). תוכן DNA משמש כדי למיין את האוכלוסייה לשתי תאי G1 תת אוכלוסיות i) (תוכן 2N DNA) ו- II) תאים בשלב S (2N - 4N תוכן DNA), באמצעות האזורים המסומנים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הערה: מטרת האוסף של תאי G1 היא לתת דין וחשבון על הטיות היעילות הרצף בין אזורים גנומית השונים. אפליקציה חלופיתמקק הוא להשתמש בתאי נעצר G1 מאותו סוג התא. גישה זו נותנת תוצאות נקיות (כי יקטין זיהום שלב S) אבל זה עשוי להציג הטיות נובעות הבדלים גנטיים בין התאים נעצרו התאים נמדדים. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין בתנאים קרים ולאסוף תאים ממוינים לתוך 1.5 / 2 צינורות מ&quot;ל. שמור צינורות על קרח בעקבות המין. הערה: כדי לשפר את התאוששות DNA, עדיף להשתמש צינורות מחייב נמוכים או להשתמש צינורות מצופים 4 - 5% BSA 1 - 3 שעות ב 4 ° C 18. </li></ol> 5. ה- DNA טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה (G1 ו- S) לטהר DNA באמצעות ערכת טיהור DNA. הערה: בעת שימוש בערכה המסחרית, elute עם 400 μL חיץ elution לתוך צינור 2 מיליליטר עבור תשואה גבוהה, כפי שהומלץ על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ריכוז ה- DNA באמצעות fluorometer. הערה: החל מ 100,000 בתאי יונקים שגבתה FACS, אחד צריך לקבל ~ 1 מיקרוגרם של ה- DNA. אt זה DNA בשלב יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 ° C לאחסון ארוך. </li></ol> 6. Sonication <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר DNA לתוך צינור 1.7 מיליליטר התואם את המעמד המגנטי המשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז DNA באמצעות חרוזים 2x SPRI פי הוראות היצרן, תוך שימוש לעמוד מגנטי, ו elute במאגר elution 50 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA Shear עם ultrasonicator ממוקד לגודל שיא היעד ממוצע של 250 נ&quot;ב. השתמש בהגדרות הבאות עבור דגימת DNA 50 μL: 50 W, גורם Duty 20%, 200 מחזורים פרץ, 20 ° C, 120 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הגודל של ה- DNA טעון על ידי אלקטרופורזה. התפלגות הגודל המומלצת היא 200 - 700 נ&quot;ב עם שיא ב ~ 250 נ&quot;ב. הערה: בשעה DNA בשלב זה יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 ° C לאחסון ארוך. </li></ol> כנת הספרייה 7., סידור הערה: הכנת ערכות ספרייה רבות ושונהפלטפורמות רצף ent אמורות לעבוד, זהה לאלו המשמשים אותנו ואת שהוזכרו בסעיף החומרים. בפועל בעבר, מפות TOR נוצרו בשיטה דומה מאוד עם פלטפורמות microarray 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ספריות באמצעות כל ערכת כנת הספרייה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הכנה הספרייה, בחר גודל באמצעות חרוזים מגנטיים עבור 300 - 800 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת ספריות, למדוד ריכוז ה- DNA באמצעות fluorometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את גודל ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רצף על כל פלטפורמה. הערה: רצף לפחות 10 M קוראים לדגימה מומלצת. עומק זה שווה לקרוא בערך כל 300 נ&quot;ב (עבור ~ 3 הגנום גודל Gb), והוא מספיק למדידות TOR ברזולוציה של 50 - 100 kb. הגדלת העומק יגרום לירידת גודל החלון ובכך תאפשר הגדלת רזולוציה בודאות גבוהה. רצף סוף לזווג אין צורך בבפרוטוקול זה משום שמידע כיסוי רק נאסף. זה, לעומת זאת, עשוי לעזור בפתרון המיקום של קורא המכילים רצפים חוזרים. </li></ol> ניתוח 8. הערה: ניתוח נתונים מבוסס על השיטה על ידי אל א קורן et. 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים רצפו מפת הגנום התואם באמצעות bowtie2 או כל aligner קריאה קצרה אמינה. הגדר בגודל משתנה, חלונות כרומוזומליות שווה-כיסוי כמגזרים מכוסה על ידי 200 קורא בשבריר G1 ולספור שלב S קורא באותה חלונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחס S / G1 לכל חלון. זה אמור ליצור מפה עם תנודות גדולות יחס S / G1 לאורך הגנום (איור 3). שליטה טובה על האמינות של מדידות TOR היא להשוות את המפה הזאת ליחס G1 / G1 (משתי מדידות נפרדות של G1) שאמורה להיות להחמיא הרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים ל -0 מתכוון 1 SD על ידי הפחתת כל נalue הערך הממוצע של כל החלונות (למעט כרומוזום X) ו בחלוקת תוצאות לפי סטיית התקן של ה- G1 S / של כל החלונות. הדבר נעשה על מנת להמיר ציוני z ולאפשר השוואה בין ניסויים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל אזורי הפער הרשומים על ידי דפדפן הגנום UCSC וכן כל שבר פער בין נותרים המכילים פחות מ -15 חלונות נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מה את השאריות עם שגם החלקה מעוקבת דרך csaps פונקצית Matlab עם פרמטר 10 - 16 ו לשרבב בנקודות סט כל 100 kb. הערה: פרמטרים של החלקה אינטרפולציה צריך להיות מותאם בהתאם לעומק של הנתונים. שיטות ופונקציות החלקה מתאימות אחרות קיימות וניתן להשתמש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חזותי המאשר את האמינות של כל לשכפל, למזג את כל הקורא ולחשב פרופיל ברזולוציה עמוק על ידי ביצוע אותו התהליך שתואר לעיל על נתונים אלה. </li></ol>

<ol><li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li>
<li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011(2010).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Farkash-Amar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+organization+of+replication+time+zones+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Global organization of replication time zones of the mouse genome.</a> Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).</li>
<li>Koren, A., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+replication+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Random replication of the inactive X chromosome.</a> Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+genome-wide+profiling+in+human+primary+erythroblasts+reveal+replication+program+organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization.</a> PLoS Genet. 10 (5), e1004319(2014).</li>
<li>McNairn, A. J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+replication%3A+linking+epigenetics+to+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication.</a> Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Kenigsberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutation+spectrum+in+genomic+late+replication+domains+shapes+mammalian+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content.</a> Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).</li>
<li>Woo, Y. H., Li, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+and+selection+shape+the+landscape+of+nucleotide+variation+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes.</a> Nat Commun. 3, 1004(2012).</li>
<li>Liu, L., De, S., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+and+higher-order+nuclear+organization+determine+single-nucleotide+substitution+patterns+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes.</a> Nat Commun. 4, 1502(2013).</li>
<li>Goren, A., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicating+by+the+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicating by the clock.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+DNA+replication+time+zones+by+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.</a> EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).</li>
<li>Smith, L., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replicating+timing+combined+with+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (70), e4400(2012).</li>
<li>Simon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+replication+of+imprinted+genes+is+established+in+the+gametes+and+maintained+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development.</a> Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).</li>
<li>Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. <a target="_blank" href="https://www.google.com/patents/US5232828">Coating agents for cell recovery.</a> Google Patents. , (1993).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

CNR-תור יכול להתבצע באופן עקרוני על כל אוכלוסיית תאים מתרבים האיקריוטים כי ניתן לחלק ידי FACS ל S ושלבי G1 (נבדק על ידי Rhind נ וגילברט DM 20). השיטה המתוארת כאן הותאמה בתאי יונקים עם גודל הגנום של ~ 3 Gb כגון אדם ועכבר. שינויים קטנים בפרוטוקול CNR-התור (בהכנת תא ועומק רצף) יש צורך, על מנת להתאים אותו אאוקריוטים אחרים. יש לשים לב על גביית סכומים המספיקים של תאים בשלב S שכן הוא צעד שער הגבלה. לפיכך, FACS ראשוני עבור מחזור התא צריך להתבצע כדי לאשר את הניסוי נ...

שכפול הדנ&quot;א יונקים קיים רגולציה הדוקה כדי להבטיח את השכפול המדויק של כל כרומוזום בדיוק פעם אחת במהלך מחזור התא. שכפול מתרחש על פי צו פיקוח הדוק - מספר אזורים גנומית גדולים (~ Mb) לשכפל בתחילת שלב S (מוקדם משכפלי תחומים) ואילו אזורים גנומית אחרים לשכפל מאוחר יותר באמצע או בשלב מאוחר (באמצע המשכפלים מאוחר תחומים) 1. רוב הגנום משכפל בעת ובעונה אחת בכל הרקמות (דומיינים TOR מכוננים), ואילו 30% - 50% של הגנום, משנה TOR שלה בין רקמות 2, במהלך התמיינות 3, 4, ובמידה פחותה גם במהלך הטרנספורמציה סרטן 5 . יתר על כן, אזורים הגנומי מסוימים לשכפל אסינכרוני 6, 7, 8, כלומר יש הבדלב TOR בין שני אללים. TOR בקורלציה עם תכונות רבות גנומי epigenomic כולל רמות שעתוק, תוכן GC, המדינה הכרומטין, צפיפות הגן, וכו &#39;1, 9. TOR קשורה גם קצב מוטציות וסוגים 10, 11 ולכן לא מפתיע, הפרעות של התכנית שהכפולה קשורות לסרטן 12, 13. הקשר הסיבתי בין TOR ומבנה הכרומטין אינו מובן עדיין. יתכן כי הכרומטין פתוח הופך לפשוט שכפול מוקדם. עם זאת, מודל אלטרנטיבי עולה כי הכרומטין הוא כינס במהלך שכפול ואת הרגולטורים הכרומטין שונים שנכחו את ההתחלה ואת הסוף של עופרת S שלב דיפרנציאלי אריזה של אזורים מעתיק מוקדמים ומאוחרים 1, 14 </sup&gt;. הראינו לאחרונה כי TOR מעצבת את התוכן GC על ידי המשפיע על סוג של מוטציות המתרחשות באזורים גנומי שונים 11. קרינת הכלאה באתרו (FISH) היא השיטה העיקרית למדידת TOR ב לוקוסי פרט. הדבר מתבצע פשוט על ידי ספירת אחוז התאים בשלב S כי תערוכת אותות דג בודדים לעומת אחוז הכפילויות עבור נתון אלל 15, 16. שיטה חלופית, מורכב הדופק תיוג DNA עם BrdU, מיון תאים על פי תוכן DNA שלהם לנקודות זמן מרובים לאורך S, immunoprecipitating DNA המכיל BrdU, ובדיקת שפע של DNA זירז עם qPCR 17. ניתן להשיג מיפוי הגנום TOR על ידי שתי שיטות. השיטה הראשונה היא גרסה הגנומי של שיטה המבוססת BrdU-IP שתואר לעיל, שבו כימות של סכוםDNA של זירז בכל שבריר נעשה בו זמנית עבור הגנום כולו באמצעות הכלאה כדי microarrays או רצף עמוק. השיטה השנייה, CNR-תור, מבוססת על מדידת מספר עותק של כל אזור גנומי של תאים בשלב S ו נרמול ידי תוכן DNA בתאים G1. בשיטה זו, תאים מסודרים על ידי FACS אל הלא מעתיק (שלב G1) משכפלים (שלב S) קבוצות (איור 1). תאים ב- G1 יש את אותו מספר עותק בכל האזורים הגנומי ובכך תוכן DNA שלהם צריך להיות זהה. מצד השני, מספר עותק דנ&quot;א S תלוי TOR, מאז אזורים מעתיקים מוקדם עברו שכפולים ברוב התאים ולכן תוכן DNA שלהם מוכפל, ואילו האזורים מעתיקים מאוחר לא משוכפלים עדיין ברוב התאים ולכן תוכן DNA שלהם יהיה להיות דומה לזה של תאי G1. מכאן S יחס G1 של תוכן DNA מעיד על TOR. כמות ה- DNA לכל איזור גנומי נמדדה באמצעות הכלאהmicroarrays או רצף עמוק 2, 8. יתרונותיה של שיטת CNR-התור יידונו גם. מאמר זה מתאר את שיטת CNR-תור למיפוי הגנום TOR כמתואר באיור 2. הנייר דן את הפרטים הקטנים של התהליך כולו מגביית תאים עד הניתוח הבסיסי של התוצאות ויצירת מפות גנומי TOR. הפרוטוקול המתואר במאמר זה שבוצע בהצלחה על סוגי תאים שונים הגדלים בתרבית. שיפורים עתידיים של פרוטוקול זה יכול להוביל את המיפוי של TOR in vivo ו סוגי תאים נדירים.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>BI (תעשיות ביולוגיות)</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>BI (תעשיות ביולוגיות)</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן עגול צינור תחתון עם מכסה מסננת תאים&nbsp;</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>גדות</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-A 10 מ"ג/מ"ל</td><td>סיגמא</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד 1 מ"ג/מ"ל</td><td>סיגמא</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>פרפילם</td><td>פרפילם</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל DNA LoBind שפופרות אפנדורף&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת MaxyClear 1.7 מ"ל&nbsp;</td>חרוזים מגנטיים <td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>- Agencourt AMPure XP&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-סאונד</td><td>Covaris</td><td>סדרת M&nbsp; -530092</td><td></td></tr><tr><td>50 ומיקרו; L microTUBE AFA סיבים בורג-פקק 6 x 16 מ"מ</td><td>Covaris</td><td>520096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA רגישות גבוהה (HS) ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורזה 2200 מערכת תחנת קלטת</td><td>Agilent</td><td>D1000 ScreenTape</td><td></td></tr><tr><td>Seqeuncing - Illumina NextSeq מערכת</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Dneasy לטיהור DNA</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PureProteom מעמד מגנטי</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU/FITC</td><td>DAKO</td><td>F7210</td><td></td></tr><tr><td>FACS סדרן</td><td>BD</td><td>FACSARIA III</td><td></td></tr><tr><td>FACS תוכנה</td><td>BD</td><td>FACSDiva v 8.0.1</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן dna

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

שכפול של הגנום מתרחש בשלב S של מחזור התא בתהליך פיקוח הדוק שיבטיח את הנאמנות של שכפול ה- DNA. אזור גנומי כל משוכפל בכל פעם ברורה בשלב S דרך ההפעלה בו הזמנית של מקורות מרובים של שכפול. זמן של שכפול (TOR) עולה בקנה אחד עם תכונות רבות גנומי אפיגנטיים והיא צמודה קצב מוטציות וסרטן. להבין את לעיני הגנומי של התכנית שכפול, בבריאות ובחולי הוא מטרה בעתיד גדולה ואתגר. מאמר זה מתאר בפרוטרוט את &quot;יחס מספר עותק של S / G1 למיפוי זמן הגנומי של שכפול&quot; השיטה (להלן בשם: CNR-תור), גישה פשוטה כדי למפות את הגנום רחב טור של בתאי יונקים. השיטה מבוססת על ההבדלים מספר עותק בין תאים בשלב S ותאי בשלב G1. שיטת CNR-התור מתבצעת 6 שלבים: 1. הכנת תאים מכתים עם יודיד propidium (PI); 2. סורG1 טינג ו- S תאי שלב באמצעות תא מופעל קרינת מיון (FACS); טיהור DNA 3.; 4. Sonication; 5. הכנת הספרייה וסדר; ו 6. ניתוח bioinformatic. שיטת CNR-התור היא גישה מהירה וקלה כי תוצאות מפות שכפולות מפורטות.

מפת TOR טיפוסית מוצגת באיור 3 עבור פיברובלסטים עובריים בעכבר (MEFs). נתון זה ממחיש את תהליך הניתוח שכן הוא מראה גם את הנקודות, אשר יחס S / G1 המנורמל עבור חלונות בודדים (שלב 8.3), כמו גם את הקו נובע החלקה מהעוקבת אינטרפולציה (שלב 8.5). מפות כאלה ללכוד את וארגון התכנית שכפול, שהנו טלאים של שני סוגים של תחומי TOR: i) אזורים גדולים (ל...

אנו מתארים כאן גישה מהירה ופשוטה יחסית למיפוי תזמון שכפול יונקים ברחבי הגנום, מבידוד תאים ועד לניתוח בסיסי של תוצאות הריצוף. מפה גנומית של תוכנית שכפול מייצגת תסופק בהתאם לפרוטוקול.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למפות את תוכנית תזמון השכפול של הגנום כולו בתא נבחר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השכפול, כגון האופן שבו תוכנית השכפול הגנומית משתנה במצב בריאותי ובמצב מחלתי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה דרך מהירה ופשוטה למיפוי עיתוי השכפול בתאים ובתנאים שונים. הכותב של פרוטוקול ה-fax הוא Dan Lehmann, מומחה fax בפקולטה לרפואה. פרוטוקול זה מתחיל בדרך כלל עם לפחות one to two times ten to the sixth תאים לא מסונכרנים בעלי קצב צמיחה מהיר.עבור תאים נצמדים, יש לשאוב ולשטוף כל צלחת עם שלושה מיליליטר של PBS ללא סידן או מגנזיום. יש להסיר את ה-PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של Trypsin-EDTA מסחרי לכל צלחת. יש לדגור את התאים למשך חמש דקות, בטמפרטורה של 37 °C, עד להפרדתם.הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע גידול כדי לנטרל את ה-Trypsin ואספו את התאים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר או לשפופרת פוליסטירן של חמישה מיליליטר. שמרו את התאים על קרח. כדי להתחיל בהליך זה, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 x G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שאבו ושטפו את התאים ב-1 ml של PBS קר. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים. לאחר השטיפה השנייה, הסירו את ה-PBS והשאיבו מחדש את התאים ב-250 µL של PBS קר.תוך כדי ערבוב עדין של המבחנה בוורטקס, הוסיפו באיטיות ובטפטוף 800 µL של אתנול בטוהר גבוה, 100%, בטמפרטורה של -20 °C. פעולה זו תוביל לריכוז אתנול סופי של 70% עד 80%. הדגירו את התאים על קרח למשך 30 דקות.התחל את הפרוצדורה על ידי צנטריפוגציה של התאים המקובעים ב-500 x G למשך עשר דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. שאב את העלייה בזהירות ושטוף את התאים פעמיים עם 1 milliliter של PBS קר. בצע צנטריפוגציה לאחר כל שטיפה.לאחר השטיפה השנייה, שאבו את הנוזל העליון ותלה את כל תא באמצעות תערובת ה-PI הבאה: מיליליטר אחד של PBS המכיל 5 µL של RNAase בריכוז 10 mg/mL, ו-50 µL של propidium iodide בריכוז 1 mg/mL. סננו את הדגימה דרך רשת של 35 µm אל תוך מבחנה מפוליסטירן של 5 mL.אטמו את המבחנה בעזרת parafilm. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. שמרו את הדגימות בחושך, מכיוון ש-propidium iodide רגיש לאור.התאים ימוינו באמצעות מכשיר FACS. השתמש בלייזר בנצנחות 561 כדי להבדיל בין תאים על בסיס עוצמת ה-propidium iodide שלהם. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש בדיזה הקטנה ביותר המומלצת עבור גודל התא הספציפי.עבור רוב התאים, הגודל הוא 85 micrometers. השתמשו בזרימה איטית ויציבה. בדרך כלל עד 300 עד 500 אירועים לשנייה.באמצעות Gating, יש להבדיל בין תאים מתים לבין פסולת תת-תאית על ידי שרטוט FCS מול SSC. מתוך התאים החיוניים, יש להבדיל דובלטים על ידי שרטוט SSC width מול SSC height, ולאחריו שרטוט FFC width מול FFC height, ושרטוט propidium iodide width מול propidium iodide height. עבור התאים החיוניים המאותתים, יש להפיק היסטוגרמה של עוצמת שטח ה-propidium iodide, המייצגת את תכולת ה-DNA של התאים.מיינו את התאים בתנאים קרים לשלבי G1 ו-S. הגדרת השער (Gating) עבור שלב S צריכה להיות רחבה ולחפוף לשלבי G1 ו-G2, בעוד שהגדרת השער עבור G1 צריכה להיות צרה וככל שניתן רחוק משלב S.עבור סוגי תאים מסוימים, עשוי להיות קשה להשיג התפלגות תקינה של מחזור התא. הדבר הקריטי ביותר הוא לבודד את שלב G1 ללא תאי שלב S. הוצא את המבחנות עם התאים הממוינים ממכשיר ה-fax.יש לשמור את המבחנות על קרח לאחר המיון. בעקבות מיון התאים, ה-DNA של כל דגימה מופק באמצעות ערכה מסחרית לטיהור DNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, יש לבצע שבירה (shearing) של ה-DNA באמצעות ultrasonicator ממוקד עד להשגת גודל שיא ממוצע של 250 base pairs.יש לאמת את גודל ה-DNA הגזום באמצעות אלקטרופורזה. התפלגות הגודל המומלצת היא 200 עד 700 זוגות בסיסים עם שיא של כ-250 זוגות בסיסים. לאחר מכן, הספרייה מוכנה, מעובדת בריצוף ומנותחת כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.מוצגת מפת זמני רפליקציה עבור כרומוזום 1 כולו מתאי פיברובלסטים עובריים של עכבר. במבט מקרוב יותר על אזור של כ-50 megabases. הנקודות מייצגות את יחס ה-S ל-G1 הנורמלי עבור חלונות בודדים, והקו הרציף מייצג את התוצאות מאינטרפולציה חלקה מעוקבת (cubic smoothly interpolation).ערכי S to G1 גבוהים תואמים לשכפול מוקדם, בעוד שערכים נמוכים תואמים לשכפול מאוחר. החיצים האדומים מצביעים על דוגמאות של אזורים בעלי זמן שכפול קבוע, והחיצים הירוקים מצביעים על אזורי מעבר זמניים. איור זה מראה את השחזוריות של מפות זמן השכפול בין שלושה חזרות (triplicates) של פיברובלסטים עובריים של עכבר, בהשוואה לשלושה חזרות של תאי pre-B של עכבר באותו אזור של 18 megabase בכרומוזום 1 של העכבר.החצים הכתומים מצביעים על דוגמאות לאזורים דיפרנציאליים בין קווי התאים. מפת חום של מתאמי Spearman בין ששת הדגימות מאשרת עוד יותר את התוצאות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו, החל מאיסוף התאים ועד להפקת המפות, בתוך שבוע אחד אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק מפות גנומיות של זמני רפליקציה עבור תאים בצמיחה.

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה חדשה של BrdU-ChIP-Slot-Western לבחינת חלבונים ושינויים בהיסטונים הקשורים ל-DNA חדש או מתהווה.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

המתודולוגיה מסייעת בניתוח השונות בדינמיקה של שכפול DNA בנוכחות ננו-חלקיקים. ניתן לאמץ מתודולוגיות שונות המבוססות על רמת ציטוטוקסיות של החומר המעניין. בנוסף, תיאור של ניתוח התמונה מסופק כדי לסייע בניתוח סיבי DNA.

הדגמה של בדיקת סיבי DNA לחקר נזק לדנ"א ודינמיקת תיקון הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

כאן, אנו מתארים את ההליך לניתוח התקדמות השכפול באמצעות חזרות פתוגניות, נוטות למבנה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

חקור מיפוי תזמון שכפול גנומי ביונקים בשיטת CNR-ToR. השיטה משתמשת ב-FACS לסינון תאי G1 ו-S וניתוח יחס S/G1 ליצירת מפות רזולוציה גבוהה של תזמון שכפול DNA.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

גלה סרטונים נוספים