T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבנות אופרונים סינתטיים רב-גנים תחת בקרה של T7 RNA polymerase הניתן להשראה, לצורך ביטוי של מספר חלבונים בו-זמנית. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים בביולוגיה סינתטית ובביוכימיה, ולאפשר להם לבנות מסלולים רב-חלבונים או לחקור קומפלקסים של חלבונים התלויים בביטוי משותף בגישות מרובות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ביטוי בו-זמנית של מספר גנים ב-Escherichia coli מתוך פלסמיד בודד.

את הפרוצדורה מהמעבדה שלי ידגימו מוחמד חסן, סטודנט לדוקטורט, ואנג'לה תומפסון, סטודנטית למסלול Co-op. לאחר השגה והגברה של הגנים הרלוונטיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו תגובות עיכול עבור הגן הרלוונטי הראשון ועבור וקטור ה-pMGX. השתמשו בתגובה של 40 µL המכילה 0.5 עד 1.5 µg של DNA בתוך אנזים ה-indel.

דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו EcoRI והניחו לעיכול להימשך שעה נוספת. NdeI מתווסף לפני EcoRI כדי להבטיח שהוא יעכל ביעילות.

NdeI רגיש לאורך ה-DNA דו-גדילי משני צדי אתר ההגבלה. הוספתו תחילה מבטיחה כי הוא יחתוך את הפלסמיד המעגלי באורכו המלא. טענו את תגובות העיכול על ג'ל אגרוזה 0.7% ובצעו אלקטרופורזה לדגימות במתח של 100 וולט למשך 55 דקות.

לאחר מכן, בעזרת סקלפל נקי או להב תער, גזרו את פסי ה-insert והווקטור והעבירו את מקטעי הג'ל הגזור לתוך מבחנות של 1.5 milliliter. השתמשו בערכה למיצוי ג'ל בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי לטהר את ה-DNA. הכינו תגובת ליגציה בנפח של 20 microliter המכילה 0.15 עד 0.5 micrograms של DNA ווקטורי וכמות מתאימה של insert בהתאם לגודל הגן ו-one microliter של T4 DNA ligase.

תחת תנאים סטריליים, הפשיר על קרח מנות של 100 µL של תאי E.coli מסוג XL1-Blue בעלי כשירות כימית למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף לתאים חמישה µL מתגובות הליגציה המכילות את הגן המבוקש. הדגר את התרמיליזציה על קרח למשך 30 דקות.

בשלב הבא, בצעו הלם תרמי לתאים למשך 45 שניות באמבט מים של 42 °C. לאחר מכן, הניחו את התרמימיות על קרח והוסיפו 200 µL של מצע LB קר. השאירו את התאים לדגירה למשך שתי דקות.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C במהירות של 220 rpm למשך שעה אחת, והפיצו 100 µL על צלחות LB agar המכילות סמן ברירה מתאים. כדי לסנן מושבות עבור טרנספורמנטים פוטנציאליים, השוו את מספר המושבות בביקורת השלילית לעומת צלחות הליגציה. יחס ספירת מושבות של אחת לשתיים הוא הרצוי.

בחר ארבע עד שמונה מושבות בודדות מכל תגובת ליגציה כדי להחדירן ל-4 milliliters של LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגור את התרביות בטמפרטורה של 37 degree Celsius ובמהירות של 220 rotations per minute למשך לילה. בעזרת ערכה לבידוד plasmid DNA, טהר את ה-plasmid DNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב והכן תגובות עיכור של 20 microliter עם 150 עד 500 nanograms של DNA, תוך שימוש ב-one microliter של NdeI ו-one microliter של EcoRI.

דגרו את תגובות העיכול בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. כדי להחדיר את גן 2 אל תוך וקטור pMGX המכיל את גן 1, הכינו תגובת עיכול בנפח של 40 µL המכילה 0.5 עד 1.5 µg של DNA וקטורי המכיל את הגן הראשון המבוקש ו-1 µL של AVR2. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 1.5 שעות לפני הוספת 1.5 µL של Calf-intestinal phosphatase.

דגרו למשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, הכינו תגובת עיכול בנפח של 40 µL המכילה 0.5 עד 1.5 µg של וקטור pMGX המכיל את הגן השני רצוי. השתמשו ב-1 µL של AVR2 ו-xpol.

דגרו את התגובה ב-37 degree Celsius למשך שעתיים. בצעו אלקטרופורזה של תוצרי עיכול הרסטריקציה על ג'ל אגרוז בריכוז 0.7%. השתמשו בסכין מנתח נקייה כדי לגזור את פסיי ה-insert והווקטור, כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר הפקת ה-plasmid DNA וכמימות הדגימה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו תגובת ליגציה תוך שימוש ביחס של 3:1 בין ה-insert ל-vector של gene 2 ו-pMGX-yfg1. כללו ביקורת שלילית המשתמשת ב-pMGX-yfg1 בלבד. בצעו טרנספורמציה של חמישה µL מכל תגובה לתאי XL1-Blue כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר מכן, השוו את מספר המושבות בצלחת הביקורת השלילית ובצלחות הליגציה. אם מופיע מספר רב של מושבות בצלחת הביקורת השלילית, יש לבחון מחדש את טיפול ה-CIP. בחרו ארבע עד שמונה מושבות בודדות מתגובת הליגציה, והשתמשו בכל מושבה כדי להנחית אותה לתוך 4 µL של LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה.

גדלו בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 220 rpm למשך לילה. לאחר בידוד וכמות של ה-plasmid DNA כפי שבוצע קודם לכן, בדקו את יעילות ההכנסה של הגן השני על ידי ביצוע תגובת עיכול המכילה 150 עד 500 ng של DNA ו-1 µL של EcoRI. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים.

EcoRI מומלץ למטרות סריקה, אך במקרים מסוימים, EcoRI עלול להפיק שני מקטעים מוכנסים או יותר שגודלם דומה, ואשר קשה להבדיל ביניהם על ג'ל. כדי להבטיח הצלחה, יש להשתמש באנזים הגבלה חלופי כגון NdeI. הפר את תגובות העיכול על ג'ל אגרוז, וחפש פס שגודלו תואם לגודל של הגן המוכנס 2.

שבט גנים נוספים לתוך הפלסמיד בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כדי ליצור את הפלסמיד הפוליציסטרוני, חמשת הגנים שובטו תחילה לתוך פלסמיד מתאים, pMGX A. איור זה מציג את pCR-Blunt-yfg1 ו-pCR-Blunt-yfg2 בתוך הפלסמיד pMGX A, וכן את pMGX A שעבר עיכול עם indel ו-EcoRI. כדי לשבט את שני הגנים הראשונים לתוך pMGX A, הפלסמיד עובד עיכול עם indel ו-EcoRI.

לאחר השבט, ביצעו עיכול של pMGX-yfg1 ו-pMGX-yfg2 באמצעות AVR2 ו-xpol כדי לאשר כי התקבלו שבטים מוצלחים. איור זה מציג את וקטור pMGXyfg1 שעוכלה על ידי AVR2 ואת וקטור pMGX-yfg2 שעוכלה על ידי AVR2 ו-xpol כדי לבודד את הגן המבוקש השני. המקטע שנוצר השובט לתוך pMGX-yfg1 ליצירת וקטור pMGX-yfg1 two.

כפי שניתן לראות כאן, עיכול של pMGX-yfg1 באמצעות EcoRI אישר את השכפול המוצלח של הגן המבוקש מספר שתיים לתוך pMGX-yfg1. תמונת הג'ל הזו מדגימה את ההבדל בין פלסמידים שעברו עיכול ובהם האינסרט נמצא באוריינטציה הנכונה או באוריינטציה הפוכה. אינסרט באוריינטציה הפוכה יצור שני אתרי EcoRI בקרבה רבה, מה שיהפוך את מקטעי ה-50 base pair שיתקבלו לאחר העיכול לבלתי ניתנים לזיהוי בג'ל ויגדיל את גודל השלדה (backbone).

לבסוף, לאחר יצירת וקטור ביטוי פוליציסטרוני של חמישה גנים, בדיקת western blot של החלבונים המבטאים מאשרת כי כל חמשת החלבונים בוטאו מוקטור יחיד. שימו לב כי החלבון המיוצר על ידי yfg5 הוא באותו גודל של yfg1 ואינו מופרד על הג'ל. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשלושה או ארבעה ימים עבור כל גן המוכנס לשלד pMGX, במידה והיא מבוצעת נכון.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל בווקטור וללינאריזציה שלו באמצעות פוספטאז, כגון Calf-intestinal phosphatase, כדי לבצע דה-פוספורילציה לווקטור. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע ניסויים נוספים, כגון ביטוי מולטי-ג'ני in vivo, במטרה לאפיין ולנצל מסלולים ביוסינתטיים להפקה של תוצרי טבע או כדי לחקור קומפלקסים של חלבון-חלבון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הסינתטית להפיק פחמימות מורכבות ו-E.Coli מהונדסים גנטית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין היטב כיצד ליישם את מערכת הביטוי של מספר גנים ב-E.coli.