Name: דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: למדו לבודד רקמות אשכים מזחלי דג הזברה בגיל 17 ימים לאחר ההפריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח תכונות מולקולריות ומחקר מנגנוני הבדלי המינים ב-Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים C ג&#39;אנג לטיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31171074, 31371099 ו 31571067 כדי GP) ועל ידי פרויקט Talent ופאג&#39;יאנג (09PJ1401900 כדי GP).

ניסויים הזברה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פודאן ושימוש. זברה הועלתה וגדלה על פי נהלים קבועים 20. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפחו 17 DPF ו 25 DPF דג הזברה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 2 זכרים ו 2 דג זברה מבוגר נקבה (בריאה, 3 עד 6 חודשים, זן מעבדת AB) ועד טנק המעבר בשעות אחר הצהריים המאוחרים לפני יום המעבר. להפריד בין זכרים לנקבות עם מחסום. למחרת בבוקר, לרענן את המים במיכל ולהסיר את המחסום כדי לאפשר להם להזדווג. אסוף ביצים 100 מ&quot;מ פטרי מנות 1 עד 2 שעות לאחר ההפריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על 40 העוברים בתוך צלחת 100 מ&quot;מ עם המדיום העובר 40 מ&quot;ל (EM) ב 28.5 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההתפתחות המוקדמת (4 ימים) ולרענן את EM פעמיים ביום. עבר זחלי 1 טנקי L (40 זחלים למי מערכה 300 מיליליטר) ולהאכיל עם rotifers החי (אספקה ​​מלאה, פעמים ביום) לאחר 5 DPF.Feed ארטמיה חיה במקום דיאטה rotifer לאחר 10 DPF. מעבירים את הדג לתוך מערכת המים במחזור מחדש ב 14 DPF 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים דג הזברה הזחל במערכת המים במחזור מחדש עד 17 DPF או 25 DPF. ודא מחזור אור / חושך הוא 14/10 h ו pH ערך של מים במערכת הוא על 7.2. מדדו את אורך הגוף של 17 DPF (5.5 כדי 6.8 מ&quot;מ) ו 25 DPF (8 עד 11 מ&quot;מ) זחלי 22. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2% צלחות אגרו לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת אגר 4 גרם ל 200 מ&quot;ל מים סטריליים. מחממים את התערובת במיקרוגל עד שהוא הופך שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצנן את הפתרון אגר במשך כ 15 דקות, ואז לשפוך אותו לתוך 60 מנות מ&quot;מ קוטר פטרי (כ 1/3 נפח של הצלחת). אחסן את הצלחות אגרו הקרושה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. פרוטוקול 1: לנתח את רקמת האשכים של 17 ו 25 DPF זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קרח כתוש לתוך הטנק כדי להרדים 17 זחלי DPF. העברתזחלים הרדימו עד 100 מ&quot;מימ מקוררים צלחת פטרי עם 30 הפתרון של המ&quot;ל הקר Ringer. שמור את הדגים וטופחו על ידי פתרון של מקורר Ringer עבור 15 דקות לפחות כדי להרדים את זחלי במלואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הזחלים לצלחת אגר precooled בכפית פלסטיק קטנה. לצלול הגוף דג שלם 10 מ&quot;ל מקורר בתמיסת רינגר בעדינות ולהניח אותה על צדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות את הפעולות הבאות מתחת לשדה הראייה של מיקרוסקופ סטריאו 25x. הצמד את תא המטען דגים עם פינצטה עבור ייצוב. תולשים את הבטן אורכית מפי הטבעת אל הלב עם זוג אחר של פינצטה. הסר בעדינות את העור והשרירים בצד אחד של הגוף על מנת לחשוף את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסת איברי גחון בשלפוחית ​​השחייה בזהירות. למנוע נזק שַׁחֲלָה המצורפת בשלפוחית ​​השחייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקשר בין בשלפוחית ​​השחייה והגוף קדמי. משוך החוצה בשלפוחית ​​השחייה כולו רקמות האשכים בעדינות. הערה: ברוב המקרהים, רקמת האשכים ב 17 DPF מכיל לרקמות אפיתל protonephridium. הם אינם מופרדים בקלות זה מזה, אבל 25 DPF זה ניתן להפריד בקלות. אֶשֶׁך מחובר גם אל פי הטבעת. צומת עם אשך שמאל וימין מחוברים זה לזה על פי הטבעת תהיה גלויה בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה כדי להפריד את רקמת האשכים בקפידה מתוך בשלפוחית ​​השחייה ולנקות את רקמות השומן שמסביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את רקמת האשכים מבודדת כדי צינור צנטריפוגות prechilled 1.5 מ&quot;ל המכיל 200 הפתרון של μL Ringer. שמור את הצינור על קרח עד שכל רקמות האשכים מופרדות מן הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את בלוטות המין של 25 DPF זחלי כמתואר בשלבים 2.1 - 2.7. </li></ol> 3. פרוטוקול 2: לנתח ביטוי גנים של רקמות האשכים המבודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ RNA הכולל רקמות אשכי הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות אשכים המבודדות עד 1 חדש RNase חינם.5 מ&quot;ל צינור ולהסיר בתמיסת רינגר. להוסיף 100 פתרון תמס μL. וורטקס עד הרקמות הם lysed לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הליך חילוץ RNA הכולל על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/10 נפח DNase 10x ואני חיץ 1 μL של DNase אני לפתרון RNA ומערבבים בעדינות. דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנט איון DNase 1/10 נפח לפתרון RNA. דגירה של 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. מדדו את הריכוז של RNA הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סינתזה cDNA הראשון גדיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אוליגו (DT) תחל -linker לבצע סינתזה cDNA הראשון גדיל בעקבות פרוטוקול של ייצור. להוסיף 1 עד 2 מיקרוגרם של RNA לנפח התגובה הכולל 20 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת פתרון התגובה עבור 90 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. לסיים את התגובה על ידי חימום על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 μL RNase H אל cDNA כךlution להסרת RNA שיורית. מערבבים בעדינות צנטריפוגות במשך 10 שניות על ~ 13,000 g x. דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 20 μl מים חינם nuclease. חנות ב -70 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פלורסנט PCR כמותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו qPCR על מערכת Cycler עם צבע פלואורסצנטי. השתמש תנאי אופני PCR הבאים: 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 s, C ° TM-5 עבור 15 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 30 s. השתמשו רצפים פריימר כדלקמן: AMH (FWD: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (FWD: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (FWD: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), ושה (FWD: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) ו β-אקטין (FWD: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

דג הזברה הפכה מודל עוצמה והוא משמש באופן נרחב בפיתוח ומחקר הקשורות למחלה. השיטות לבידוד איברי דג זברה מבוגרת כגון מוח, לב, בלוטת מין, ו בכליות, תועדו היטב 23, 24, 25. בשל גודלו הקטן שיפוץ דינמי של הרקמות האשכים של דג הזברה הזחל, הבידוד של רקמת האשכים היא משימה מאתגרת. מחקרים קודמים השתמשו ברקמות גזע גזור כולו או ושה מהונדס: תא המבוססת EGFP מיון microdissection לייזר לבחון את בלוטות המין ה...

קובע המין הנשי המרכזי כרומוזום דג זברה פרא 4 אבד או שונה של דג הזברה המבויתת (זני מעבדה הנפוצים כלומר) 1. במקום זאת, יש להם מערכת קביעת הזוויג polygenic בליווי גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, היפוקסיה, זמינות המזון וצפיפות האוכלוסייה. המנגנונים המפורטים של התפתחות מין דג זברה אינם מובנים במלואם. שאלות יסוד כגון כאשר קביעת הזוויג דג זברה מתרחשת, מה אות קביעת המין העיקרית (ים) היא / הם, ואשר גנים להסדיר את הצעד הראשון של טרנספורמציה שַׁחֲלָה להישאר ייענה 2, 3. בתהליך פיתוח מין דג זברה, בכמה שלבים חשובים הוכרו. בשלב מוקדם של הפיתוח, החל 4 hpf (הפריה פוסט שעות)-תאי נבט בראשיתי (PGCs) עוברים המפרט, הגירה אל הרכס גניטלישִׂגשׂוּג. מספרים PGC ואינטראקציות גומלין בין תאי הנבט תאים סומטיים חשובים בידול שַׁחֲלָה 4. בשעה 13 DPF (הפריה פוסט ימים), בלוטות המין נמצאים בשלב מובחן. עד 17 DPF, בלוטות המין להתפתח דו-פוטנציאל שחלות הן נקבות וזכרים בעתיד. המעבר תלוי-אפופטוזיס מן השחלה אל האשכים מתחילים בגיל 21 כדי 25 DPF ועשוי להימשך מספר שבועות. עד 35 DPF, המין של בלוטת המין נקבע וייצור תא מין ספציפי מין מתנהל בשני השחלות ואשכים 5, 6, 7. נכון להיום, גנים ומנגנוני מועמד מגוונים של קביעת הזוויג הוצעו. פרוטאומיקה וניתוח transcriptomic הצליחו לבודד גנים רבים עם הביטוי דימורפית מינית גנים אלה נוצלו כדי ללמוד בידול מין דג הזברה 8, </sup&gt; 9, 10. לדוגמה, ב דג הזברה הזחל, הגן cyp19a1a מתבטא במיוחד בשחלה אך לא את האשך 11, 12. בנוסף, גן AMH מתבטא בחולשה בתאי granulosa הזקיק בשחלה, אבל מאוד בתאי testis Sertoli 13. לעומת זאת, הגן ושה מתבטא באופן רציף בתאי הרבייה של שני דג הזברה הנשית והגברית, מה שהופך אותו סמן שַׁחֲלָה מתאים 14, 15. חקירת רמות ביטוי הגנים האשכים הוא קריטי כדי להבין את המנגנון המולקולרי של קביעת הזוויג והבחנה במיוחד בשלב הדו-פוטנציאל השחלה 3, 9. עם זאת, גודלו הקטן של דג הזברה הזחל והאשכים קטנים בהתאמה לסבך את הבידוד של gonadal רקמות לניתוח מולקולרי נוסף. מחקרים קודמים השתמשו גזורים באזור תא מטען כולו בין opercula ואת הנקבוביות אנאליות 16. הכנה זו, למרות בלוטות מין המכיל, מורכבת של רקמות ואיברים מרובים. לחלופין, חיות טרנסגניות עם הביטוי GFP שַׁחֲלָה ספציפיים כגון ושה: EGFP שימשו לבידוד רקמת האשכים באמצעות תא מופעל הקרינה מיון (FACS) ו ללכוד לייזר דיסקציה מיקרו 17, 18. אבל היישום הנרחב שלהם מוגבל. כאן, אנו מתארים תהליך פשוט לבודד רקמת האשכים מן דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. אנחנו מדגימים את המיקום של בלוטות המין ביחס לאיברים אחרים ולבודד את בלוטות המין ללא פגע מורפולוגית הרקמות הסובבות. אנחנו מראים עוד את הגנים ספציפיים שַׁחֲלָה כגון ושה cyp19a1a מבוטאים מאוד בלוטות המין המבודדות לעומת רקמת תא המטען באמצעות PCR כמוני (ניתוח qPCR). הפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי, בידוד, טיהור RNA והגברה של גנים ספציפיים אשכים מן דג זברת זחל, ובכך מאפשר ניתוח מולקולרי הבא של רקמת אשכי 19.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית תאים 100 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td>לדגירת עוברים</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>עבור 1 ליטר נדרש: הוסף 17.5 גרם NaCl, 0.75 גרם KCl ו-2.9 גרם CaCl&#183; 2H2O; לאחר מכן הוסף 0.41 גרם KH2PO4, 0.412 גרם Na2HPO4 נטול מים ו-4.9 גרם MgSO4&#183; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>דילול 20x EM במים מזוקקים</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>להכנת צלחות אגר 2%</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>לבידוד RNA</td></tr><tr><td>מד זכוכית</td><td>שן בו</td><td>250 מ"ל</td><td>להכנת צלחות אגר 2%</td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td></td><td>Midea M1-211A</td><td>לחימום האגר</td></tr><tr><td>פינצטה DUMONT#5INOX</td><td>מכשיר דיוק עולמי</td><td>500341</td><td>לדיסקציה</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>מוטיק</td><td>SMZ168</td><td>לדיסקציה</td></tr><tr><td>ציוד מים טהורים</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' תמיסה</td><td></td><td></td><td>ל-1 ליטר נדרש: יש להוסיף 6.78 גרם NaCl, 0.22 גרם KCl, 0.26 גרם CaCl2 ו-1.19 גרם Hepes; ואז למלא ל-1 ליטר; התאם את ה-pH ל-7.2. יש לעקר על ידי סינון ולשמור במיכל פוליקרבונט שקוף שעבר חיטוי.</td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מתכת</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>דגם GL-150</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td> לצנטריפוגה <td>פוטומיקרוגרף</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA בקנה מידה מיקרו</td><td>אמביון</td><td>AM1931</td><td>לבידוד RNA מרקמות בלוטת המין</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>לעיכול DNA בתמיסת RNA</td></tr><tr><td>RevertAid ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>לסינתזת cDNA גדיל ראשון</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>לעיכול שאריות ה-RNA בתמיסת ה-cDNA.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>מוצר זה הוא תערובת מאסטר 2x מבוססת Taq DNA פולימראז עבור PCR בזמן אמת ו&nbsp; ישים לבדיקת אינטרקלציה עם SYBR Green I.</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000 +</td> <td>מדידת הריכוז של פרופיל ביטוי הגנים הכולל של RNA</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td></td></tr></tbody></table>

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

למרות דג זברה פרא להחזיק מערכת ZZ / ZW מין להגדרה, דג זברה מבוית אבדה את כרומוזום המין. הם מנצלים מערכת קביעת הזוויג polygenic, שבו מספר גנים מופצים ברחבי הגנום קולקטיבי לקבוע את זהותם המין של דגים בודדים. נכון לעכשיו, את הגנים מעורבים בויסות התפתחות בלוטת מין וכיצד הם פועלים להישאר חמקמקים. בדרך כלל, לבודד רקמת אשכים הוא הצעד הראשון כדי לבחון את התהליכים ההתפתחותיים מין. כאן, אנו מציגים הליך לבודד רקמת אשכים מן 17 DPF (הפריה פוסט ימים) ו 25 DPF זחלי דג זברה. רקמת האשכים המבודדת עשויה להיבחן לאחר מכן על ידי פרופיל ביטוי מורפולוגיה גן.

והניתוחים של בלוטות המין בוצעו על דג הזברה הזחל זן AB. איור 1 מציג רקמת האשכים טיפוסית של דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. ראשית, העור והשרירים של צד אחד של הבטן הוא חתכו לחשוף את האיברים הפנימיים. לאחר הסרת המסה של איברים פנימיים, בשלפוחית ​​השחייה יחד עם האשך להישאר בתא המטען. שַׁחֲלָה צורף בצד הגחון של שלפוחית השחייה (החץ באיור 1B &#39;). בשעה 17 DPF, את בלוטת המין היה ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד רקמה גונאדית מדגיות של דגי זברה (zebrafish) ולנתח את התכונות המולקולריות של הרקמה המבודדת. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התפתחות המין של דג הזברה, כגון שימור של גנים בוויסות התפתחות הגונדות והבסיס המולקולרי להתפתחות המין של דג הזברה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע דיסקציה של רקמות גונאדיות מדגיות זברה החל מהיום ה-17 לאחר ההפריה, לצורך בחינת המצב התאי והביולוגי-מולקולרי.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בהגייתה בשל גודלן הקטן והעיצוב מחדש הדינמי של רקמות הגונד בקרביו של דג הזברה (zebrafish) בשלב הלרבה. כדי להיערך לדיסקציה של הגונד, העבירו שני זכרים ושתי נקבות בוגרות של דג זברה לכל צד של מיכל רבייה מחולק. למחרת בבוקר רעננו את מי המיכל והסירו את המחיצה כדי להתחיל את תהליך ההזדווגות.שעה עד שעתיים לאחר ההפריה, אספו והעבירו כארבעים ביצים לפיתח של 100 מילימטר עם 40 מיליליטר של תווך עוברים (embryo medium), או EM. דגרו את העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים, תוך רענון ה-EM פעמיים ביום. לאחר הדגירה, העבירו את הלרוות למכלי דגים של ליטר אחד. חמישה ימים לאחר ההפריה (DPF), האילו את הדגים ברוטיפרים חיים.כאשר הזחלים מגיעים ל-10 DPF, האכילו את הדגים בארטמיה חיה. לאחר מכן, ב-14 DPF, העבירו את הדגים למערכת מים במחזור. גדלו את זחלי דגי הזברה עד ל-17 או 25 DPF.לאחר מכן, מדדו את אורך גופן של הזחלים ב-17 ו-25 DPF. הכינו פלטות אגר בריכוז שני אחוזים לצורך נתיחה על ידי הוספת ארבעה גרמים של אגר ל-200 milliliters של מים סטריליים. חממו את התערובת במיקרוגל עד שהיא הופכת לשקופה.קררו את האגר למשך 15 דקות, ולאחר מכן צקו אותו לתוך צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר. אחסנו את פלטות האגר המוצקות בטמפרטורה של 4 °C. כדי להרדימ את הזחלים בגיל 17 DPF, הוסיפו קרח גרוס למיכל.העבירו את הזחלים המורדמים לצחנת פטרי מקוררת בקוטר 100 millimeter עם 30 milliliters של תמיסת Ringer's קרה. הדגירו את הדגים בתמיסת ה-Ringer's המקוררת למשך 15 דקות לפחות כדי להרדימם לחלוטין. העבירו את הזחלים לכרית אגר מקוררת מראש באמצעות כף פלסטיק.טבל את גוף הדג כולו ב-10 mL של תמיסת רינגר (Ringer's Solution) מקוררת והנח אותו בעדינות על צדו. תחת מיקרוסקופ סטריאו, בהגדלה של 25x, השתמש בפינצטה כדי לקבע את גונו של הדג לצורך ייצוב. לאחר מכן, באמצעות זוג פינצטות נוסף, קרע את הבטן לאורכה מהפישפש אל הלב.בשלב הבא, הסירו בעדינות את העור והשרירים מצד אחד של הגוף כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. לאחר מכן, הסירו בזהירות את האיברים הגדולים הנמצאים ונטרלית לשלפוחית השחייה. הימנעו מפגיעה בגונד (בלוטה מינית) המחוברת לשלפוחית השחייה.נתקו את החיבור בין שלפוחית השחייה לבין פנים הגוף. לאחר מכן, שלפו בזהירות את כל שלפוחית השחייה ואת רקמת הגונדס. בעזרת פינצטה, הפרידו בזהירות את רקמת הגונדס משלפוחית השחייה.ונקו את רקמת השומן שמסביב. העבירו מיד את רקמת הגונד שלהה למבחנה צנטריפוגית של 1.5 milliliters שקוללה מראש, המכילה 200 microliters של Ringer's Solution. השאירו את המבחנה על קרח עד שכל רקמות הגונד יופרדו מהזחלים.כדי להפיק RNA כולל מרקמת הגונד של זחלים, העבירו את הגונד המבודד לשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר נטולת RNase והסירו את תמיסת רינגר. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת ליזיס. ערבבו את השפופרת ב-vortex עד לפירוק מלא של הרקמה.לאחר ביצוע מיצוי RNA כולל, בהתאם להוראות היצרן, יש להוסיף לתמיסת ה-RNA נפח של עשירית מכמות תמיסת באפר DNase I, ומיקרוליטר אחד של DNase I, ולערבב בעדינות את תוכן המבחנה. יש להדגיר את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, יש להוסיף לתמיסת ה-RNA נפח של עשירית מכמות ריאגנט לביטול פעילות DNase.דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 70 °C למשך עשר דקות. לאחר מכן, השתמשו בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז ה-RNA הכולל. לביצוע סינתזת cDNA של הגדיל הראשון, השתמשו בפריימר oligo-dT linker וב-1 עד 2 µg של RNA, בהתאם לפרוטוקול היצרן.דגרו את התגובה בטמפרטורה של 45 °C למשך 90 דקות. לאחר מכן, הפסיקו את התגובה על ידי חימום הדגימה בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות. הוסיפו 1 µL של RNase H לתמיסת ה-cDNA כדי להסיר את ה-RNA השארי.ערבבו בעדינות את תוכן המבחנה וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של כ-13,000 ×g למשך עשר שניות. דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה 20 µL של מים נקיים מנוקליאז (nuclease-free water).יש לאחסן את ה-cDNA בטמפרטורה של 70°C- . לבסוף, השתמשו בצבע פלואורסצנטי לביצוע qPCR בהתאם לתנאים ולפריימרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. איור זה מציג רקמת גונד typical של זבקיות Zebrafish בשלב הלרווה ביום ה-17 לאחר ההדגמה (17 DPF).הגונדה מחוברת לצד הגבוני של שלפוחית השחייה, כפי שניתן לראות כאן. ביום ה-17 לאחר ההבייה (17 DPF), הזחלים מכילים את הגונדה השמאלית והימנית, שהן שקופות. ברוב המקרים הגונדות מוקפות ברקמה אפיתליאלית ובפרוטונפרידיום.ב-25 DPF, הגונדה עטופה לעיתים קרובות ברקמת שומן, וניתן להבחין בגונדות גדולות או קטנות. לבסוף, כדי לנתח את התכונות המולקולריות של רקמת הגונדה שבודדה, נבחנו רמות הביטוי של סמני הגונדה amh, cyp19a1a, nanos3, ו-vasa באמצעות QPCR. התוצאות מראות עליות משמעותיות בגנים המסמנים ברקמת הגונדה בהשוואה לרקמה ביקורת.ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך שעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לספק תנאי גידול עקביים לזחלי zebrafish, שכן הדבר קריטי להשגת התוצאות המצופות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך למחקרים בתחום התפתחות המין לחקור את מנגנוני קביעת המין של zebrafish.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן בידוד רקמות גונדליות מזריקי דגי זברה.

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את הליך זיהוי ביתור איברים דג הזברה הבוגרת.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

אנו מציגים שיטה חדשנית למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דגי זברה תוך שימוש בציוד סטנדרטי להזרקה של עוברים ובמיקרוסקופ סטריאו. אנו מדגימים כי מיקרו-גבג' היא טכניקה בטוחה ויעילה, המועילה להחדרה של כמויות מבוקרות של חומרים מגוונים באופן ספציפי אל תוך חלל המעי של זחלי דגי זברה.

Microgavage של זחלי דג זברה

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.

ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

למדו לבודד רקמות אשכים מזחלי דג הזברה בגיל 17 ימים לאחר ההפריה. שיטה זו מאפשרת ניתוח תכונות מולקולריות ומחקר מנגנוני הבדלי המינים ב-Danio rerio.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

גלה סרטונים נוספים