ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את המסלולים הביוכימיים המופעלים בתגובה למתח באמצעות מיקרו-חרוזים מגנטיים מצופים ליגנד ויישום מאולץ על קולטני הדבקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום העסקאות המכאניות כגון כיצד מתח מכני מההלומטריה המפורשת מכוון אותם מהתמיינות או כיצד תאימות רקמות מניעה את הטרנספורמציה שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעורר תאים רבים לניתוח כימי על ידי שימוש בחרוזים להפעלת מתח על תת-קבוצה ספציפית של קולטני הידבקות.

כדי להתחיל, השעו ביסודיות את החרוזים הסופר-פרמגנטיים המופעלים בבקבוקון המקורי על ידי מערבולת למשך 30 שניות לפחות. Aliquot 40 מיקרוליטר של החרוזים הסופר-פרמגנטיים התלויים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד 0.1 נתרן פוספט מולארי pH 7.4. לאחר מכן, הנח את הצינור על מעמד הפרדה מגנטי כדי להפריד את החרוזים המגנטיים מהתמיסה.

השלך את ה-supernatant והסר את הצינור ממעמד ההפרדה המגנטי. השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד 0.1 נתרן פוספט מולרי pH 7.4. לאחר שטיפת החרוזים פעמיים, השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד מאותו מאגר.

לאחר מכן, שלב 100 מיקרוגרם של פיברונקטין בקר או כל ליגנד קולטן הידבקות תאים אחר לחרוזים ולמערבולת. חזור על שלב זה על ידי החלפת הליגנד ב-BSA, פולי-D-ליזין או אפוטנספרין עבור בקרות שליליות. דגרו את החרוזים בתמיסה המכילה ליגנד למשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על רוטור.

אם מופיעים אגרגטים של חרוזים לאחר התרחשות התגובה, סוניקט לא יותר מ -10 עד 20 שניות. לאחר מכן, בודדו את החרוזים באמצעות מעמד הפרדה מגנטי ושאבו את התמיסה שנותרה. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת PBS בתוספת חלבון סרום בקר של 0.2%.

דגירה למשך שעה על רוטור בחום של 37 מעלות צלזיוס. בעזרת מגנט יש לשטוף את החרוזים במיליליטר אחד של תמיסת PBS בתוספת אלבומין סרום בקר 0.2% פעמיים. לפני השעיית אותם במיליליטר אחד של אותו מאגר.

סוניקציה של החרוזים אם מופיעים אגרגטים לא יותר מ -20 עד 30 שניות. המשך לבדיקות התא, או אחסן את החרוזים בארבע מעלות צלזיוס עד חודש. תרבית תאים דבקים על צלחת תרבית רקמה של 60 מיליליטר במדיום גידול מתאים עד הגעה למפגש של 80%.

לאחר הטלת החרוזים המצופים ליגנד, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת PBS בתוספת חלבון סרום בקר של 0.2%. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים המצופה ליגנד לחמישה מיליליטר של מדיום תרבית חם ומערבולת. לאחר מכן, שאפו את המדיום בכלי תרבית של 60 מיליליטר והוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום גידול חם בתוספת חרוזים.

דגרו את התרחיף למשך 20 דקות בתנאי תרבית תאים כדי לאפשר לחרוזים לשקוע ולהיצמד לתאים. חשוב לא לחרוג מ -20 דקות, מכיוון שחרוזים עשויים להיות מופנמים על ידי פגוציטוזיס. לאחר מכן, התבונן בחרוזים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מטרה של 10X או 20X.

בדוק אם יש הידבקות חרוזים על ידי ניעור קל של המנה כדי להבחין בין חרוזים מחוברים לצפים. הנח מגנט ניאודימיום עגול 38 מילימטר על הפנים העליונות של מכסה צלחת תרבית רגיל של 60 מילימטר והשאר אותו מוחזק במקומו באמצעות שני מגנטים ניאודימיום קטנים יותר של 13 מילימטר הממוקמים על הפנים התחתונות של המכסה. דגרו את התאים הנתונים למתח לנקודות הזמן הרצויות ולתנאי תרבית התאים.

החלף את מכסה הכלים הרגיל במכסה עם המגנט. מכיוון שהמגנט חזק מאוד, תפעל אותם בזהירות. לאחר הטיפול מניחים את המנה על קרח ושואבים בזהירות את כל המדיום מהמנה.

הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזיס תאים ודגר במשך 10 דקות על קרח. לאחר מכן, אספו את הליזאט באמצעות מגרד תאים והעבירו אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. גלולה את החרוזים המגנטיים באמצעות מעמד ההפרדה המגנטית והעבירו את הליזאט הכולל של התא לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ומקורר מראש של 1.5 מיליליטר.

הסר אליקוט של 15 מיקרוליטר מהליזאט הכולל של התא שהתקבל לאחר הפרדת חרוזים לניתוח כתם מערבי. שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר ליזיס קר כקרח. לאחר מכן, הוסף מאגר דגימה של 50 מיקרוליטר לגלולת החרוזים.

לאחר ערבוב המתלה על ידי מערבולת, הרתיחו אותו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות באמצעות תנור בלוק יבש. חלק זה מכיל את מתחמי ההדבקה המבודדים. המשך לניתוח ביוכימי או אחסן את השבר במינוס 20 מעלות צלזיוס.

איור זה מוצג כדי להדגים את טיהור מתחמי ההדבקה. GAPDH immunoblotting משמש כבקרת העמסה עבור ליזאט תאים כולל ולבדיקת טוהר מתחמי ההדבקה. חשיפה ארוכה שימשה כדי לאמת את היעדר האות הציטופלזמי בשבר קומפלקס ההדבקה המטוהר.

חרוזים מצופים פיברונקטין שימשו לחקירת תהליכי התמרה מכנית המתרחשים לאורך זמן במתחמי ההדבקה בתגובה למתח. לאחר הפרדה מגנטית של שבר קומפלקס ההדבקה, הליזאט ושבר קומפלקס ההדבקה נותחו על ידי כתם מערבי. בקרת העמסה ומועמדים הידועים כמגויסים או זרחניים במתחמי הידבקות בתגובה למתח מכני היו אימונולוגיים.

בעוד שהמתח לא השפיע על גיוס פקסילין למתחמי ההדבקה, הזרחן שלו על טירוזין 31 הוגבר בתגובה למתח מכני הן בליזאט התא הכולל והן בשבר קומפלקס ההדבקה. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל כוחות מתיחה על חלבוני משטח הדבקה באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור להיות זהיר עם המגנטים החזקים. בעקבות הליך זה ניתן לבצע מחקרים ביוכימיים כגון כתמים מערביים, בדיקת פילמור אקטין או בדיקה אנזימטית כדי לענות על שאלות נוספות כמו האם פעילות הקינאז מווסתת על ידי מתח. טכניקה זו עשויה לסייע לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור מסלולי איתות רגישים מגנטיים בתאים.