Name: ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: חקור מסלולים ביוכימיים בתגובה למתח מכני בקולטני הידבקות תאית באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים ליגנד. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי של תהליכי מכנוטרנסדוקציה בביתאוסטזיס ובהתפתחות רקמתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CG נתמך על ידי תרומות של סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR-13-JSV1-0008), מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (n˚8304162 אינטגרציה מארי קירי קריירה) ומן המועצה האירופית למחקר (ERC) תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר תוכנית חדשנות (n˚639300 גרנט המוצא ERC).

1. ליגנד הצמידה כדי חרוזים מגנטיים הערה: נטיה ליגנד מתבצע באמצעות חרוזים פאראמגנטי המופעל Tosyl עם 2.8 מיקרומטר קוטר (ריכוז פתרון המניות 10 8 חרוזים / מ&quot;ל, 30 חרוזים מ&quot;ג / מ&quot;ל). הפרוטוקול הבא מבוסס על דגימות של כ 2 x 10 5 תאים, אשר מתאימות MRC-5 תאים שגודלו 80% confluency בצלחת בתרבית רקמה 60 מ&quot;מ. כוון את עוצמת הקול של חרוזים ריאגנטים בהתאם אם באמצעות צלחות בגדלים או תאים שונים בהתלכדויות שונות. השתמש בסכום של חרוזי פאראמגנטי כדי שיהיו 2 חרוזים לכל תא. לכן, 4 x 10 5 חרוזים נדרשים על צלחת 60 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing לפחות 30 שניות. Aliquot 40 μL של חרוזים פאראמגנטי מושעים (המקביל ל 4 x 10 6 חרוזים) כדי צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על separati מגנטיעל דוכן על מנת להפריד החרוזים המגנטיים מהפתרון. בטל supernatant, להסיר את צינורית מדוכן הפרדה מגנטי ו resuspend את החרוזים ב 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב לשטוף וחזור פעמיים עם 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, resuspend את החרוזים ב 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 מיקרוגרם שור פיברונקטין (FN) או כל ליגנד רצפטור הידבקות תאים אחרים אל pH 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט 7.4 המכילה חרוזים ומערבבים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים קודמים על ידי החלפת FN או כל ליגנד ספציפי אחר עם BSA, פולי- D- ליזין או apo-transferrin עבור פקדים שליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לניתוח ג&#39;ל, לקחת aliquot 10 μL של פתרון ליגנד עבור ניתוח יעילות crosslinking ומערבבים עם נפח מתאים של חיץ מדגם Laemmli מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים עם תמיסה המכילה ליגנד 12-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מצרף חרוזים להופיע לאחר התגובה התרחשה, sonicate (חשמל רציף 39 W) לכל היותר 10-20 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את החרוזים באמצעות עמדת פרדה מגנטית, לשאוב את הפתרון הנותרים ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS / 0.2% BSA pH 7.6 פתרון. דגירה של 1 ש &#39;על הרוטור על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים באמצעות פעמיים מגנט עם 1 מ&quot;ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. חרוזים Resuspend ב 1 מ&quot;ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Sonicate אם אגרגטים להופיע לכל היותר 20-30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להסיר aliquot 10 μL בניתוח היעילות צימוד ידי כתם המערבי (לערבב עם נפח מתאים של חיץ מדגם מרוכז Laemmli). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לתא מבחנים או חרוזי חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להפעיל ג&#39;ל SDS-PAGE ו כתם כחול Coomassie לנתח crosslinking FN כדי חרוזים מגנטיים. </li></ol> 2. יישום של כוחות Tensional על חרוזים מצופים ליגנד Bound הידבקות קולטנים על הגבפני השטח של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי חסיד תרבות על צלחת תרבות 60 מ&quot;מ רקמה במדיום גידול מתאים (בדרך כלל DMEM 4.5 גר &#39;/ ל D- גלוקוז בתוספת FCS 10%) עד שמגיע 80% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה הלא denaturing הלא יוניים (20 מ&quot;מ טריס HCl 7.6 pH, 150 מ&quot;מ NaCl, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 0.1% NP-40) וצינורות צמרמורת microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים מצופים ליגנד ממדור 1.10 ו resuspend ב 1 מ&quot;ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. הוספת 100 μL של פתרון חרוזים מצופים ליגנד עד 5 מ&quot;ל של מדיום מערבולת תרבות חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני בצלחת תרבות 60 מ&quot;מ ולהוסיף 5 מ&quot;ל מדיום הגידול חם בתוספת חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 20 דקות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר החרוזים משקעים לדבוק תאים. זה חיוני כדי לא יעלה על 20 דקות מאז חרוזים ניתן הפנימו ידי phagocytosis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להתבונן החרוזים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות obje 10X או 20Xctive ולבדוק הידבקות חרוז ידי טלטול צלחת להפלות בין מצורף צף חרוזים מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על תרבות הצלחת בחממה, להחליף את מכסת הצלחת הנורמלית מכסה עם מגנט ניאודימיום עגול 38 מ&quot;מ המצורפת על הפנים העליון. המגנט מוחזק במקום על ידי שני מגנטי ניאודימיום קטנים 13 מ&quot;מ ממוקמים בחלק התחתון של הפנים של המכסה. מאז המגנטים הם מאוד חזקים, לתפעל אותם בקפידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים נתונים מתח עבור נקודות הזמן הרצויות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול, מניחים צלחת על הקרח ובזהירות לשאוב את המדיום כולו מצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL של חיץ תמוגה התא, דגירה במשך 10 דקות על הקרח. אסוף את lysate באמצעות תא מגרד והעברת צינור microcentrifuge מראש צונן 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת החרוזים המגנטיים באמצעות דוכן ההפרדה המגנטי ולהעביר את lysate התא הכולל עד צמרמורת מראש חדשהאד צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. אחסן חלק זה ב -20 ° C לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 3 פעמים עם חיץ 1 תמוגה קר כקרח מ&quot;ל. הוסף 50 μL Laemmli מדגם חיץ גלולה חרוז, ומערבבים על ידי pipetting ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמצעות תנור לחסום יבש. חלק זה מכיל את מתחמי הידבקות המבודדים. המשך ניתוח או חנות ביוכימיים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן lysate התא הכולל המתקבל לאחר ההפרדה חרוזים (כ -300 μL), להסיר aliquot 50 μL לניתוח כתם המערבי. הערה: 250 μL עזב יכול לשמש מחקרים ביוכימיים נוספים כגון מחקרי אינטראקציה בין חלבונים (immunoprecipitation, מבחני נפתח GST) או ניסויי פעילות GTPase (שינוי למאגר תמוגה עשוי להיות נחוץ תלוי GTPase של עניין). </li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDischer%2C+DE+%22Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%22">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate</a>. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).</li>
<li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+forces%3A+architectural+control+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).</li>
<li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).</li>
<li>Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+mechanical+stress%3A+role+of+integrins%2C+Rho%2C+cytoskeletal+tension+and+mechanosensitive+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels.</a> J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).</li>
<li>Zhao, X. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+activates+smooth+muscle+alpha-actin+promoter+activity+through+the+Rho+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+biosensors+to+measure+mechanical+forces+within+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells.</a> Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).</li>
<li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+atomic+force+microscopy+and+side-view+optical+imaging+for+mechanical+studies+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells.</a> Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).</li>
<li>Bays, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+phosphorylation+differentially+regulates+mechanotransduction+at+cell-cell+and+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions.</a> J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).</li>
<li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+tensional+forces+on+PECAM-1+elicit+a+global+mechanotransduction+response+via+the+integrin-RhoA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway.</a> Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).</li>
<li>Gordon, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Allostery%3A+Evidence+for+a+Force+Requirement+in+the+Proteolytic+Activation+of+Notch%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch.</a> Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).</li>
<li>Lessey-Morillon, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoA+guanine+nucleotide+exchange+factor%2C+LARG%2C+mediates+ICAM-1-dependent+mechanotransduction+in+endothelial+cells+to+stimulate+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration.</a> J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).</li>
<li>Osborne, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+regulates+LARG+and+GEF-H1+during+EMT+to+affect+stiffening+response+to+force+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).</li>
<li>Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+on+JAM-A+activates+RhoA+via+GEF-H1+and+p115+RhoGEF%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF.</a> Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).</li>
<li>Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+fields+applied+to+collagen-coated+ferric+oxide+beads+induce+stretch-activated+Ca2%2B+flux+in+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts.</a> Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).</li>
<li>Glogauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+and+tyrosine+phosphorylation+interact+coordinately+with+actin+to+regulate+cytoprotective+responses+to+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching.</a> J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).</li>
<li>Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+myosin-II-responsive+focal+adhesion+proteome+reveals+a+role+for+%CE%B2-Pix+in+negative+regulation+of+focal+adhesion+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).</li>
<li>Schiller, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B21-+and+%CE%B1v-class+integrins+cooperate+to+regulate+myosin+II+during+rigidity+sensing+of+fibronectin-based+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).</li>
<li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+nuclei+adapt+to+force+and+reveal+a+mechanotransduction+pathway+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus.</a> Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).</li>
<li>Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+integrin+and+growth+factor+receptor+signaling+pathways+within+the+focal+adhesion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex.</a> Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+alpha%285%29beta%281%29+integrins+determines+adhesion+strength+whereas+alpha%28v%29beta%283%29+and+talin+enable+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).</li>
<li>Ajeian, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+integrin-associated+complexes+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells.</a> Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).</li>
<li>Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitivity+of+integrin+adhesion+complexes%3A+Role+of+the+consensus+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome.</a> Exp Cell Res. , (2015).</li>
<li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+integrin-based+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of integrin-based adhesion complexes.</a> Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).</li>
<li>Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+modulation+of+adhesion+complex+composition%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition.</a> PloS One. 9 (12), e115213(2014).</li>
<li>Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+integrin+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Sign%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of integrin adhesion complexes.</a> Sci Sign. 4 (167), pt2(2011).</li>
<li>Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+%CE%B14%CE%B21+integrin+adhesion+complexes+reveals+%CE%B1-subunit-dependent+protein+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment.</a> Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).</li>
<li>Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+magnets+and+magnetic+beads+to+dissect+signaling+pathways+activated+by+mechanical+tension+applied+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells.</a> Methods. , San Diego, Calif. (2015).</li>
<li>Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+activity+regulates+vinculin+recruitment+to+focal+adhesions+through+FAK-mediated+paxillin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation.</a> J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).</li>
<li>Sawada, Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+transduction+by+Triton+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force transduction by Triton cytoskeletons.</a> J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).</li>
<li>Grinnell, F., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+fibronectin-coated+beads+with+attached+and+spread+fibroblasts.+Binding%2C+phagocytosis%2C+and+cytoskeletal+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization.</a> Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).</li>
<li>Schroeder, F., Kinden, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytosis+using+fluorescent+latex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Meth%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads.</a> J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li>
<li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה המתוארת כאן מהווה גישה פשוטה ליישם מתח לקולטנים הדבקה פני תא ולאפשר הטיהור הבאה שלהם. עם זאת, כמה צעדים חיוניים כדי לבצע טיהור הדבקה יעילה אופטימיזציה פוטנציאלי יכולים להיעשות בהתאם קולטנים הידבקות הממוקדות. אנו מציגים בעיות פוטנציאליות המשתמש עלול להיתקל בהמשך. השתמשנו חרוזים מגנטיים 2.8 מיקרומטר בקוטר אבל חרוזים גדולים יותר יכולים לשמש כגון 4.5 מיקרומטר קוטר. עם זאת, קוטר חרוז צריך להיות מוגבל 2-5 מיקרומט...

בשנת metazoa, מתח מכני מכוון התפתחות רקמת הומאוסטזיס באמצעות הסדרת מספר עצום של תהליכים תאיים כגון התפשטות, בידול הישרדות 1, 2. מתח מכאני יכול לנבוע מטריקס או יכול להיוצר על ידי תאים חסידים, אשר מדגם הסביבה התאית שלהם באמצעות מכונות התכווצות actomyosin שמושכות אל תאי מטריקס וזונדים הנוקשים שלה באמצעות מולקולות מתח רגיש. בתגובת מתח, חלבוני הידבקות mechanosensitive לעבור שינויים מרחביים המפעילים מפלי איתות מורכבים. בתורו, מסלולי איתות אלה לתזמר mechanoresponse מקיף התפשטות, בידול והישרדות אשר מתאים את ההתנהגות הסלולר לסביבה התאית. ניתן ליישבם תהליכים כאלה בתוך פרק זמן קצר טווח (שניות עד דקות) להאכיל בחזרה במהירות אל הלולאה של מכה<html> notransduction ידי שינוי מבני mechanosensitive. למשל, הידבקויות מבוססי integrin לחזק בתגובה מתח דרך שיפוץ cytoskeletal בתיווך GTPase Rho 3, 4, 5. במקביל, מסלולי איתות אחרים מופעלים על שעות וימים לשלוט תכנות גנטי כי בסופו של דבר להשפיע תא גורל 6. בעוד מחקרים רבים הדגישו את השפעת נוקשות מטריקס על דטרמיניזם תא ומחלות פיתוח 1, 2, המנגנונים המולקולריים המדויקים של mechanotransduction בתיווך ההידבקות עדיין להישאר חמקמקים. גישות שונות פותחו כדי לחקור את ההשפעות של כוחות שנוצר תא או כוחות חיצוניים על התנהגות תא, כוללים מערכות זרימה, העברת אנרגית תהודת קרינת חיישני -tension (סריג) 7,ילדה = &quot;Xref&quot;&gt; 8, תואם מצעים 9, פינצטה המגנטית, פינצטה אופטית 10 ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 11. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזי פאראמגנטי לאפיין מסלולי mechanotransduction בתגובת כוחות tensional להחיל קולטנים הידבקות ספציפיים. חרוזי פאראמגנטי הם חלקיקים כי הפיך למגנט כאשר הניחו שדה מגנטי. לאחר מצופה ליגנד עבור קולטן מסוים, חרוזים אלה מספקים כלים רבים עצמה כדי לחקור את ההשפעות של יישום כוח תאי. שיטה זו תאומת על ידי מספר מחקרים 3, 5, 12 - 17 מציגה את היתרון כדי להקל על ניתוח ביוכימיים בעיקר על תאים חסידים. באמצעות חרוזים מגנטיים דומים מצופה קולגן ואחריו ניתוח ביוכימיים, עבודה מוקדמת דיווחה על עלייהזירחון החלבון טירוזין ו RhoA ההפעלה בתגובה מתח 5, 18, 19. השיטה המתוארת להלן שמשה גם עם פיברונקטין (FN) חרוזים מצופים לאפיין את מסלולי האיתות במורד זרם המתח להחיל integrins 3. במחקר זה, Guilluy et al. המתח עולה כי מפעיל RhoA באמצעות גיוס של הגורמים החליפין נוקלאוטיד שני גואנין (GEFs), LARG ואת GEF-H1, לקומפלקסים הידבקות integrin. מאז, מחקרים אחרים הראו כי GEF-H1 מגויסת לקומפלקסים דבקים בתגובת מתח תא שנוצר באמצעות שיטות שונות 20, 21, הוכחת את החוסן של המתודולוגיה המתוארת כאן. כתוצאה מכך, מופעל RhoA הוצגה לקדם חיזוק הידבקות, דרך שיפוץ cytoskeletal. מערכת זו גם שמשה לחקור מיושם מתח to קולטנים הידבקות תא / תא. יישום של כוחות על חרוזים מגנטיים צופה עם התחום התאי של E-cadherin שהגדיל גיוס vinculin בדומה מתחמי ההידבקות קשור integrin 12. קולינס ועמיתיו ציינו כי יישום של מתח PECAM-1 מקדם integrin ו RhoA הפעלת 13. גישה נוספת ניסיוני באמצעות חרוזים מגנטיים היא חקר מתח להחיל גרעינים בודדים. באמצעות חרוזים מצופים עם נוגדנים כנגד חלבון מעטפת הגרעין nesprin-1, מתחמי מעטפת הגרעין היו מטוהרים כדי להראות שהם מוסדרים באופן דינמי בתגובה מתח מכני 22. תוצאות אלו תומכות האדירות של שיטה זו בחקר מסלולי mechanotransduction. יתר על כן, בעוד מערכות זרימה או כוח המתיחה לעורר תהליכים תאיים כלליים, חרוזים מגנטיים שמתמקדים קולטן הידבקות תא באמצעות אחת הליגנדים קולטן 13, 15. יתרון נוסף של שיטה זו הוא הבידוד של מתחמי הידבקות באמצעות הליך טיהור זיקה ליגנד פשוט. עובדה ידועה היא כי תוספת של חרוזים מצופים ליגנד לתאים נקשר לקולטנים הידבקות ומשרה את הגיוס של חלבונים הידבקות מספר 23. בקשה נוספת של כוחות כדי חרוזים מגנטיים צופה ליגנד הופכת מתחמי הידבקות אלה לתוך פלטפורמות macromolecular שמתווכים מסלולי איתות מתח תלוי שונים 4, 24. Cell תמוגה ואחריו ריכוז חרוז באמצעות מגנט מתיר את בידודה של פלטפורמות הידבקות. שיטות אחרות להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות כבר שימשו תאים חסיד. הם משלבים crosslinking כימי כדי לחסוך אינטראקציות בין חלבוניםו צעד תמוגה התא על ידי חומר ניקוי ותזרים גזירה או sonication 20, 21, 25, 26, 27, 28. השלב האחרון הוא האוסף של ממברנות פלזמת גחון וכתוצאה המכילות את מתחמי ההידבקות. בניגוד לשיטות אלה, חרוזים מגנטיים לאפשר רמת טיהור גדולה של מתחמי הידבקות תא על ידי מיקוד סלקטיבי מש&#39; מסוימת של קולטנים הידבקות. חרוזים מגנטיים כבר להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות תאים שאינם חסיד המצורפת microbeads מצופה ליגנד 29, 30. השיטה המתוארת להלן מחק מצבים ביולוגיים שבו כוח מוחל לתקופה ממושכת קצרה (שניות עד דקות). לכן, זה מספק כלי רב עצמה על החקירה היא את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות מטוהריםמסלולי mechanosensitive-איתות במורד הזרם. כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות tensional לחלבוני משטח דבק. מגנט ניאודימיום קבע מושם על גבי משטח תרבות הצלחת. פן המוט של המגנט הוא ממוקם בגובה של 6 מ&quot;מ כך שהכח על חרוז מגנטי יחיד 2.8 מיקרומטר הוא קבועים (כ 30-40 pN) 31. משך גירוי מתח נקבע על ידי המפעיל בהתאם המולקולה של ריבית בקנה המידה בעת ההפעלה שלה. תאים הם סוף סוף lysed, מתחמי הידבקות הם מטוהרים על ידי פרדת חרוזים באמצעות מגנט וניתוחי ביוכימיים מעובדים. פרוטוקול זה כולל הכנת חרוזים פאראמגנטי מצופה ליגנד, ואת היישום של מתח באמצעות מגנט ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח להחיל ADH מבוסס integrinesions גורם שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.

<table><tbody><tr><td>מגנטים ניאודימיום (בחלק העליון של צלחת 60 מ"מ)</td><td>K& J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>כיתה N52 ממד: 1 1/2 אינץ' קוטר x 1/2 אינץ' מגנטים ניאודימיום בעובי x 1/2 אינץ'</td></tr><tr><td>(על הפנים התחתונות של צלחת 60 מ"מ)</td> <td>K& J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>כיתה N42 ממד: 1/2 אינץ' קוטר x 1/4 אינץ' עובי פלסטיק שחור מצופה&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>חרוזים סופר-פרמגנטיים&nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 מגנט</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1141-5MG</td><td>פיברונקטין מפלזמת בקר</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>אפו-טרנספרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1428-50MG</td><td>בקר אפו-טרנספרין</td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובט&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 60*15 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח cell surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

מתחמי הידבקות תא משטח Mechanosensitive לאפשר לתאים לחוש את התכונות המכאניות של סביבתם. מחקרים שנעשה לאחרונה זיהו הם מולקולות חישת כוח באתרים דבקים, ואת גורמי תעתוק תלוי כוח המווסתים ביטוי גנים ספציפי שושלת ולנסוע פלטי פנוטיפי. עם זאת, רשתות איתות המרת מתח מכאני לתוך הביוכימיים נותרו חמקמקות. כדי לחקור את מסלולי האיתות עוסקים על מתח מכאני להחיל פני תא קולטן, microbeads פאראמגנטי ניתן להשתמש. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות לחלבונים דבקים פני תא. בגישה זו, אפשר לחקור מסלולי איתות ציטופלסמית כוח תלוי רק לא על ידי גישות ביוכימיות שונות, אלא גם שיפוץ הידבקות על ידי בידוד מגנטי של מתחמי הידבקות מצורפים החרוזים מצופים ליגנד. פרוטוקול זה כולל הכנת שיתוף ליגנדחרוזי פאראמגנטי ated, ואת היישום של להגדיר כוחות מתיחים ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח שחל על הידבקות מבוססת integrin מפעיל שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.

סכמטית של הטכניקה מודגמת באיור 1 א. בעקבות נטייה ליגנד, חרוזים מגנטיים מודגרת עם תאים במשך 20 דקות, ולאחר מכן מגנט קבוע משמש כדי להחיל כוחות מתיחים של כ 30-40 pN עבור כמות זמן שונה. 1b איור מראה 2.8 מיקרומטר חרוזים מגנטיים מצופה FN כבול קולטנים הידבקות התא MRC5. השלבים לשטוף חרוזים פאראמגנטי לאחר תמוגה התא הם קריטיים ולקבוע את מידת טיהור. מינימום של שלושה שוטף מומלץ. Immunoblots ...

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את המסלולים הביוכימיים המופעלים בתגובה למתח, תוך שימוש בחרוזי מיקרו-מגנטיים מצופים בליגנדים והפעלת כוח על רצפטורים של היצמדות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות בתחום התעתוק המכני, כגון כיצד מתח מכני מהלומטריקה מנחה אותם להבחנה, או כיצד גמישות הרקמה מניעה את התמירתו שלהם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להעביר גירוי למספר רב של תאים לצורך ניתוח כימי, על ידי שימוש בחרוזים להפעלת מתח על תת-קבוצה ספציפית של רצפטורים של היצמדות.כדי להתחיל, השעיו היטב את חרוזי ה-super paramagnetic tosylactivated בתוך המבחנה המקורית באמצעות ערבוב ב-vortex למשך 30 שניות לפחות. העבירו מנה (aliquot) של 40 µL של החרוזים המושעים לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית בנפח 1.5 mL המכילה 1 mL של sodium phosphate בריכוז 0.1 M וב-pH 7.4. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מעמד הפרדה מגנטית כדי להפריד את החרוזים המגנטיים מהתמיסה.שפכו את העל-נוזל והוציאו את המבחנה ממעמד ההפרדה המגנטית. השעיקו מחדש את החרוזים ב-1 mL של נתרן פוספט 0.1 M ב-pH 7.4. לאחר שטיפת החרוזים פעמיים, השעיקו את החרוזים מחדש ב-1 mL מאותו באפר.לאחר מכן, הוסיפו 100 micrograms של bovine fibronectin או כל ליגנד אחר של קולטן להיצמדות תאים לחרוזי הניגוח וערבבו במערבל (vortex). חזרו על שלב זה כאשר תחליפו את הליגנד ב-BSA, poly-D-lysine, או apotransferrin לצורך ביסורי שליליים. דגרו את החרוזים עם התמיסה המכילה את הליגנד למשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius על גבי רוטור.אם מופיעים צברי חרוזיים לאחר התגובה, יש לבצע סוניקציה למשך לא יותר מ-10 עד 20 שניות. לאחר מכן, יש לבודד את החרוזיים באמצעות מעמד הפרדה מגנטית ולשאוב את התמיסה שנותרה. לאחר מכן, יש להוסיף 1 mL של תמיסת PBS המועשרת ב-0.2% bovine serum albumen.דגרו למשך שעה אחת על רוטור בטמפרטורה של 37 °C. בעזרת מגנט, שטפו את החרוצים פעמיים עם 1 mL של תמיסת PBS המועשרת ב-0.2% bovine serum albumen. לאחר מכן, השביו אותם בתמיסה של 1 mL מאותו באפר.במידה ומופיעים צברים, בצע סוניקציה לחרוזים למשך לא יותר מ-20 עד 30 שניות. המשך לבדיקות התאים, או אחסן את החרוזים בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך עד חודש אחד. תרבת תאים נצמדים בצלחת תרבית רקמות של 60 מיליליטר במצע גידול מתאים עד להגעה ל-80% confluency.לאחר השקעת החרו지를 המצופים בליגנד, השהו שוב את המשקע במילליטר אחד של תמיסת PBS בתוספת 0.2% bovine serum albumen. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת החרוזים המצופים בליגנד לחמישה מילליטרים של מצע גידול חמים וערבבו במכשיר vortex. לאחר מכן, שאבו את המצע בצלחת תרבית של 60 מילליליטר והוסיפו חמישה מילליטרים של מצע גידול חם בתוספת החרוזים.דגרו את הת сусפנזיה למשך 20 דקות בתנאי תרבית תאים כדי לאפשר לחרוזים לשקוע ולהיקשר לתאים. חשוב מאוד לא לחרוג מ-20 דקות, שכן החרוזים עלולים להיבלע בתהליך פגוציטוזה. לאחר מכן, צפו בחרוזים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות עדשה של 10X או 20X.בדקו את היצמדות החרוזים על ידי ניעור קל של הצלחת כדי להבחין בין חרוזים צמודים לחרוזים צפים. הניחו מגנט נאודימיום עגול בקוטר 38 מילימטר על הפנימה העליונה של מכסה צלחת תרבית סטנדרטית בקוטר 60 מילימטר, והחזיקו אותו במקומו באמצעות שני מגנטי נאודימיום קטנים יותר בקוטר 13 מילימטר שמוצבים על הפנימה התחתונה של המכסה. דגרו את התאים הנחשפים למתיחה בנקודות הזמן ובתנאי תרבית התאים הרצויים.החליפו את מכסה הפטריה הרגיל במכסה עם המגנט. מכיוון שהמגנטים חזקים מאוד, טיפלו בהם בזהירות. לאחר הטיפול, הניחו את הפטריה על קרח ושאבו בזהירות את כל המצע מהפטריה.הוסיפו 300 µL של בופר לליזת תאים והדרימו למשך 10 דקות על קרח. לאחר מכן, אספו את הליזאט באמצעות גרד תאים (cell scraper) והעבירו אותו לפרוטוקול במיקרוצנטריפוגה של 1.5 ml שקולל מראש. שקיעו את החרוזיים המגנטיים באמצעות מעמד להפרדה מגנטית והעבירו את כל הליזאט התאי למיקרוצנטריפוגה חדשה של 1.5 ml שקוללה מראש.הוצאו מנה של 15 µL מתוך ליסאט התאים הכולל שהתקבל לאחר הפרדת החרו지를 לצורך אנליזת western blot. שטפו את החרו지를 שלוש פעמים עם 1 mL של בופר ליסיס קר מאוד. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של בופר דגימה למשקע החרוזים.לאחר ערבוב התרחופה באמצעות וורטקס, הרתיחו אותה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות באמצעות מחמם בלוקים יבש. פרקציה זו מכילה את קומפלקסי ההיצמדות המבודדים. המש aיכו לניתוח ביוכימי או שמרו את הפרקציה בטמפרטורה של 20- °C.איור זה מוצג כדי להדגים את טיהורם של קומפלקסי ההיצמדות. Immunoblotting של GAPDH משמש כבקרת טעינה עבור ליסאט תאי כולל וכדי לבדוק את טוהר קומפלקסי ההיצמדות. נעשה שימוש בחשיפה ממושכת כדי לתקף את היעדרו של אות ציטופלזמי בפרקציית קומפלקס ההיצמדות המטוהר.חרוזיים מצופים בפיברונקטין שימשו לבדיקת תהליכי ההעברה המכנית (mechano-transduction) המתרחשים לאורך זמן בקומפלקסי ההיצמדות בתגובה למתיחה. לאחר הפרדה מגנטית של פראקציית קומפלקס ההיצמדות, הליזאט ופראקציית קומפלקס ההיצמדות נותחו באמצעות Western blot. בוצעו סמימרג'ים (immunoblotting) לבקרת טעינה ולמועמדים הידועים ככאלה המגויסים או מזופספורים בקומפלקסי היצמדות בתגובה למתיחה מכנית.בעוד שמתח לא השפיע על גיוס Paxillin לקומפלקסי הדבקות, הפספורילציה שלו בטירוזין 31 הוגברה בתגובה למתח מכני, הן בליזאט התאי הכולל והן בפרקציית קומפלקס ההדבקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפעיל כוחות מתיחה על חלבוני פני השטח של ההדבקות באמצעות חרוזי מגנט. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעותיים, במידה והיא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בשימוש במגנטים העוצמתיים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע מחקרים ביוכימיים כגון western blots, בדיקת פולימריזציה של actin או בדיקה אנזימטית כדי לענות על שאלות נוספות, למשל האם פעילות kinase מווסתת על ידי מתיחה. טכניקה זו עשויה לסייע לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור מסלולי סיגנלינג הרגישים לשדות מגנטיים בתאים.

analyzing-cell-surface-adhesion-remodeling-response-to-mechanical

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

המאפיינים המכאניים של glycocalyx אנדותל נמדדו על ידי כניסה באמצעות כדורים בגודל מיקרון על cantilevers AFM. תאי אנדותל בתרבית בתא מותאם אישית תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים לגרום ביטוי glycocalyx. נתונים נותחו באמצעות מודל סרט דק כדי לקבוע את העובי ומודולוס glycocalyx.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

פינצטה המגנטית, טכניקת מניפולציה מולקולה בודדת חזקה, יכולה להיות מותאמת למדידות הישירות של טוויסט (שימוש בתצורה הנקראת באופן חופשי, המקיף פינצטה המגנטית) ומומנט (באמצעות תצורה כינתה פינצטה מומנט מגנטי) במקרומולקולות ביולוגיות. הנחיות לביצוע מדידות כאלה מקבלות, כוללים יישומים למחקר של ה-DNA וחוטי Nucleo-חלבון קשורים.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לאפיון תכונות ההדבקה הפנימיות של מולקולות הידבקות תאים משוערות.  האקטודומיין המופרש המתויג באפיטופ של מולקולת הידבקות תאים נלכד ממדיום התרבות על חרוזים קטנים ואחידים מתפקדים.  לאחר מכן ניתן להשתמש בחרוזים אלה באופן מיידי במבחני צבירת חרוזים פשוטים.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

טכניקות מסורתיות לבודת ג'ל polyacrylamide (PA) המכיל בדיקות ניאון כרוכות הרבדה ג'ל בין משטח חסיד ושקופיות זכוכית. כאן, אנו מראים כי ציפוי שקופית זו עם פולי-D-ליזין (PDL) ובדיקות ניאון מתאים את הבדיקות לבתוך 1.6 מיקרומטר ממשטח ג'ל.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

משטח TGT הוא פלטפורמה חדשנית לחקר גורם גדילה-אינטגרין crosstalk. תכנון הבדיקה הגמיש, הספציפיות של ליגנד ההדבקה והמודולציה המדויקת של תנאי הגירוי מאפשרים הערכות כמותיות חזקות של יחסי הגומלין בין EGFR-integrin. התוצאות מדגישות את EGFR כ'מכנו-מארגן' המכוון את מכניקת האינטגרין, ומשפיע על מכלול הידבקות המוקד ועל התפשטות התאים.

מד מתח קשירה בדיקות לכימות גורם גדילה מתווך מכניקת אינטגרין והדבקה

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

במאמר זה אנו מתארים מערך פינצטה מגנטית במהירות גבוהה המבצע מדידות ננו-מכניות על ביומולקולות רגישות לכוח בקצב מרבי של 1.2 קילוהרץ. אנו מציגים את היישום שלה על סיכות ראש DNA וקומפלקסים SNARE כמערכות מודל, אבל זה יהיה ישים גם על מולקולות אחרות המעורבות באירועים מכנוביולוגיים.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

חקור מסלולים ביוכימיים בתגובה למתח מכני בקולטני הידבקות תאית באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים ליגנד. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי של תהליכי מכנוטרנסדוקציה בביתאוסטזיס ובהתפתחות רקמתית.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

גלה סרטונים נוספים