פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה
28 במרץ 2017
כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.
המטרה הכללית של שיטה זו היא להנחות באופן מהיר ואמין כימות של סיבי שריר בשרירי חולדה שלמים, באופן אוטומטי שאינו תלוי במשתמש, תוך שימוש בפלטפורמה בקוד פתוח. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-מוסקולרי בנוגע לפגמים כתוצאה מהזדקנות, מחלה או טראומה בשרירים השלדיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לנתח באופן מהימן אוכלוסיות של סיבי שריר ולהפיק תמונות באיכות גבוהה של חתכים רוחביים של השריר.
לאחר הפשרה מספקת, שטפו בזהירות את הדגימות ב-PBS מועשר ב-Triton X, או PBST, בשתי שטיפות: אחת למשך 10 דקות ואחת למשך חמש דקות. לאחר השטיפה השנייה, ייבשו את החתכים באוויר למשך שתי דקות. לאחר מכן, השתמשו בטוש הידרופובי כדי להקיף את החתכים הרוחביים הבודדים.
לאחר 15 דקות נוספות של ייבוש באוויר, חסמו קשירה לא ספציפית באמצעות PBST המועשר בסרום עיזים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות והוסיפו לכל דגימה את תערובת הנוגדנים הראשוניים המתאימה לצביעה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור. בסיום הדגירה, שטפו את השקופיות פעם אחת למשך 10 דקות ופעם אחת למשך חמש דקות ב-PBST.
לאחר מכן, סמנו את נתחי השריר באמצעות תערובת הנוגדנים המשניים המתאימה למשך שעה אחת, תוך הגנה מאור. לאחר שטיפת השקופיות פעמיים ב-PBST, כפי שהודגם, ייבשו את השקופיות ולאחר מכן צבעו את הגרעינים באמצעות ערכה לצביעת גרעינים ב-DAPI לפי הוראות היצרן. הסירו את עודפי ה-DAPI בשטיפה של דקה אחת ב-PBST, ולאחריה ייבוש קצר באוויר.
לאחר מכן, כסו את הדגימות במדיום קיבוע פלואורסצנטי ובכיסוי זכוכית, ואחסנו את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C בהגנה מפני אור. בתוך 24 עד 48 שעות מהצביעה, טענו את השקופיות לסורק שקופיות ופתחו פרויקט חדש בתוכנת התוכנית. עבור תצוגה מקדימה של השקופית, בחרו בערוץ ה-DAPI ובעדשה של 2.5x, ובצעו מיקוד ידני של הדגימה הראשונה.
סמנו את כל חתכי הרוחב שיש לכלול בתהליך הרכישה המפורט וקבעו את זמני החשיפה עבור כל ערוץ. כעת, הפעילו את רכישת התמונות האוטומטית, תוך בדיקה שהשדה הראשון נרכש בצורה נכונה, כדי למנוע רכישה שגויה בשלב מוקדם של התהליך האוטומטי. עם השלמת רכישת התמונות, בדקו ידנית שמיקוד האוטופוקוס של חתכי הרוחב תקין ושהסיבים הבודדים ניתנים להבחנה בבירור.
חיוני לבדוק ולתקן ידנית את המיקוד האוטומטי (autofocus) עבור כל תמונה במידת הצורך. תהליך הכימות האוטומטי של סיבי השריר דורש תמונות באיכות גבוהה כדי להשיג תוצאות אופטימליות. לאחר מכן, עבור כל חתך רוחב שצריך להיכלל בניתוחים הסופיים, ייצאו כל ערוץ בנפרד, למעט DAPI, כקבצי JPEG, ושמרו ומינו את הקבצים בתיקיות בעלות השם המתאים בהתאם לערוצים שנחשפו.
לפני תחילת תהליך הכימות של סיבי השריר, בצעו תצוגה מקדימה של כל תמונה בתוכנה המתאימה לעריכת תמונות כדי לוודא ניגודיות מספקת בין הסיבים הצבועים לרקע. לאחר מכן, בתוכנת ImageJ, השתמשו בפקודה Plugins>Macros>Edit כדי להציג את קוד המקור של המאקרו, ושנו את נתיב התיקייה עבור כל ערוץ בקוד המקור של המאקרו. כעת, השתמשו בפקודה Run כדי להפעיל את המאקרו.
כל התמונות בתיקייה ייטענו למאקרו ויכומתו בסדר עוקב. בסיום הכימות, ייצא את התוצאות לתוכנת גיליון אלקטרוני מתאימה, וזהה את הערכים עבור סיבים איטיים, בינוניים ומהירים שנספרו כחיוביים. לאחר מכן ניתן לחשב את מספר הסיבים הכולל.
צביעה אימונופלואורסצנטית של סיבי שריר היא מהירה עם תגובת-בסיס נמוכה, והתמונות המתקבלות מדגימות ניגודיות גבוהה בין הסיבים הצבועים לרקמה הסובבת, כמו גם הבחנה חזקה בין סוגי הסיבים השונים. ניתוח אוטומטי מאפשר זיהוי של אוכלוסיות סיבי השריר היחסיות בדיוק של פלוס או מינוס 4% בהשוואה לניתוח ידני, כאשר הספירות המוחלטות הכוללות גבוהות יותר בהשוואה לניתוח הידני. עם זאת, הספירות היחסיות נותרות דומות, בטווח של פלוס או מינוס 4%.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפוך את הכימות של סיבי השריר לאוטומטי. זכרו כי עבודה עם DAPI עלולה להיות מסוכנת. לכן, יש להשתמש בציוד המגן המתאים בעת ביצוע הצביעה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר, אמין וניתן לשחזור לכימות אוטומטי של אוכלוסיות סיבי שריר בחתכים רוחביים של שריר שלד של חולדה. באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של איזופורמים של myosin heavy chain וניתוח תמונה אוטומטי באמצעות ImageJ, השיטה מאפשרת הערכה בעלת תפוקה גבוהה שאינה תלויה במשתמש של סיבי שריר איטיים, בינוניים ומהירים, ובכך מפחיתה משמעותית את זמן הניתוח ואת השונות בין משתמשים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של השריר
- היסטולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
- ניתוח תמונות
רקע
- הרכב סיבי השריר מושפע ממחלות, טראומה והזדקנות.
- שיטות מסורתיות לסיווג סוגי סיבים הן גוזלות זמן ודורשות עבודה רבה.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של איזופורמים של שרשראות כבדות של מיוזין מאפשרת זיהוי של סוגי סיבים מרובים בחתך בודד.
- ניתוח תמונה אוטומטי יכול לשפר את השחזוריות והיעילות בכימות של אוכלוסיות סיבי שריר.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של פרוטוקול מהיר ואמין לכימות סיבי שריר.
- מתן אפשרות לניתוח אוטומטי, שאינו תלוי במשתמש, של חתכים רוחביים של שריר שלם.
- צמצום זמן הניתוח והשונות בין משתמשים באמצעות כלים בקוד פתוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה וחיתוך של דגימות שריר שלד מוטמעות.
- צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים ראשוניים ספציפיים לשרשראות כבדות של מיוזין, נוגדנים משניים פלואורסצנטיים ו-DAPI לצביעת גרעינים.
- סריקה אוטומטית של חתכים רוחביים שלמים באמצעות סורק שקופיות לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה.
- כימות אוטומטי של אוכלוסיות סיבים באמצעות מאקרו מותאם אישית ב-ImageJ, ולאחריו ייצוא וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מניב תמונות באיכות גבוהה ובניגודיות גבוהה, עם הבחנה ברורה בין סוגי הסיבים.
- ניתוח אוטומטי מזהה אוכלוסיות יחסיות של סיבי שריר בדיוק של ±4% בהשוואה לניתוח ידני.
- ספירות סיבים מוחלטות גבוהות יותר בניתוח אוטומטי, אך הפרופורציות היחסיות נותרות עקביות.
- השיטה מפחיתה באופן משמעותי את זמן הניתוח ואת השונות בין משתמשים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר, הדיר ומדויק של סוגי סיבי שריר בחתכים של שריר שלם.
- ניתוח אוטומטי באמצעות ImageJ יעיל למחקרים רחבי היקף וממזער הטיות של המשתמש.
- השיטה מתאימה לחקירת שינויים בהרכב השריר עקב מחלה, טראומה או הזדקנות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות אוטומטי של אוכלוסיות סיבי שריר באמצעות אימונוהיסטוכימיה של myosin heavy chain נותן מענה לצורך בפנוטיפיקה של רקמות בעלת תפוקה גבוהה וחזרתיות במחקר פרה-קליני. פרוטוקול זה מפחית את השונות בין משתמשים ומאיץ את הפקת הנתונים, ובכך תומך בתיקוף יעילים של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות למערכות הנוירו-מוסקולרית והשלדית. גישה זו מאפשרת הערכה כמותית וניתנת להרחבה של עיצוב מחדש של רקמות בתגובה למחלה, טראומה או התערבות טיפולית, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי בנקודות מפנה מרכזיות בתהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של הרכב סיבי השריר כדי להבהיר מנגנוני מחלה והשערות טיפוליות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין אוכלוסיות של סיבים איטיים, בינוניים ומהירים בחתכים של רקמה שלמה.
- מפחית עמימות מנגנונית באמצעות תהליכי עבודה של ניתוח אוטומטי וסטנדרטי.
- מסייע במיון תיקי פיתוח (portfolio triage) על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של פנוטיפ רקמה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין חתכים מוכשרים של רקמה לסריקה המשך של תרכובות מועמדות או התערבויות.
- מסטנדרט את תוצרי הבדיקה באמצעות כימות אוטומטי, ללא תלות במשתמש, באמצעות מאקרו-ים של ImageJ מקוד פתוח.
- מאפשר דימות בעל ניגודיות גבוהה וחזרתיות, והבחנה בין סוגי סיבים לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה במגוון מחקרים וצוותי מחקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפיקה ברמת הרקמה עם נקודות סיום רלוונטיות למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן קריאות כמותיות ועקביות.
- מפחיתה סיכונים בהחלטות קידום על ידי אספקת נתונים חסונים הניתנים להשוואה בין מחקרים שונים על עיצוב מחדש של השריר.
- משפרת את הערך הניבוי ליעילות טיפולית במודלים של מחלה, טראומה או הזדקנות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספק פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפיקציה של רקמות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים באמצעות כימות של שינויים בסוגי הסיבים בתגובה למשתנים ניסיוניים.
- סריקה: מספקת פלטי בדיקה סטנדרטיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות או התערבויות.
- אנליטיקה: מספקת נתונים כמותיים, מוכנים לגיליון אלקטרוני, על אוכלוסיות סיבים, המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים על ידי קישור שינויים בהרכב הרקמה למחלה או לתגובה טיפולית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת זרימת עבודה ניתנת להרחבה ובקוד פתוח, הניתנת להתאמה בין תוכניות מחקר ומערכות מודל שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים ברמת הרקמה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ואוטומציה של הכמות, תוך מזעור הטיות של המשתמש ועומס עבודה ידני.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות נוירו-Sקולטליות (נוירו-שריריות) ומסקלטליות (שלד).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה ובניתוח תמונות דיגיטליות.
- נדרשת גישה למכשור לסריקת סרט-ביקורת (slides) ולתוכנת ImageJ בקוד פתוח.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, דימות וניתוח.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של שרירים, אך תלוי בספציפיות של הנוגדן ובאיכות הדימות.
- בקרת איכות ידנית של רכישת התמונות נותרת קריטית לצורך ניתוח אוטומטי אופטימלי.
