סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

מטרת הליך זה היא להכין פיגומי תאים מתכלים, דמויי קצף תלת מימדיים המבוססים על אלסטומרים גבישים נוזליים בעלי שרשרת צד תואמת ביולוגית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של גביש נוזלי וביו-רפואי, כגון ההשפעות של תכונות אלסטומר גביש נוזלי על התפשטות התאים ויישור התאים. היתרון העיקרי של שיטה זו של פיגומי תאים דו-ממדיים הוא שהיא מאפשרת לחקור אינטראקציות מרחביות בין תאים לתאים, דבר שלעתים רחוקות אפשרי בסביבות מאקרו דו-ממדיות.

בדרך כלל, אלה החדשים בשיטה זו יתקשו עם מבחני הדחיסה המישוש. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה לאחר שנאלצנו להחליף את המדיה במאות צלחות פטרי. תהינו אם אלסטומרים של גביש נוזלי יכולים לתמוך בתאי שריר ברשת תלת-ממדית, כדי למנוע את השימוש בכל כך הרבה צלחות פטרי.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבים מסוימים דורשים מניפולציה זהירה של כימיקלים. יתר על כן, עיצוב תבנית קצף המתכת עשוי להיות מאתגר. ראשית, מלאו אמפולה של 20 מיליליטר בתמיסה של 2% בנפח של PFOTES בטולואן.

מערבבים את התמיסה באמפולה למשך 24 שעות כדי לסנן את פנים האמפולה. שוטפים את האמפולה הסילנית באלכוהול איזופרופיל ומייבשים אותה בחום של 140 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מניחים באמפולה היבשה 3.64 גרם אפסילון-קפרולקטון מזוקק, 0.5 גרם אלפא-כלורו-אפסילון-קפרולקטון ו-0.25 מיליליטר גליצרול.

מערבלים את התערובת למשך דקה. לאחר מכן, הוסיפו 4.90 גרם DL-lactide לתערובת, וטהרו את אטמוספירת האמפולה בגז חנקן למשך דקה אחת. מכסים את פתח האמפולה בנייר אלומיניום, ומחממים את התערובת בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך כשעתיים כדי להמיס את ה-DL-לקטיד.

מערבל את התערובת כדי לשבש את כל המוצקים הלא מומסים, ולאחר מכן, הוסף 66 מיקרוליטר של 10-2-אתיל הקסנואט לאמפולה, ומערבולת שוב. סוגרים את האמפולה בנייר אלומיניום ומחממים את התערובת בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס מחדש את ה-DL-לקטיד. לאחר שה-DL-lactide נמס שוב, מערבל במרץ את התערובת, וטהר את אטמוספירת האמפולה בגז חנקן.

אוטמים את האמפולה במחיצת גומי. הכנס מחט המחוברת לקו ואקום דרך המחיצה והפעל את הוואקום. אטמו את צוואר האמפולה בלהבה, והקפידו לא להמיס את פקק הגומי.

לאחר איטום הצוואר, מחממים את תערובת התגובה בחום של 140 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר מכן, הניחו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר. שוברים את האמפולה וממיסים את תערובת התגובה הצמיגה ב -10 מיליליטר דיכלורומתאן.

העבירו את התערובת למשפך הפרדה. הניחו בקבוק המכיל 100 מיליליטר מתנול באמבט קרח יבש ואצטון כדי לקרר את המתנול למינוס 78 מעלות צלזיוס. לאחר שהמתנול התקרר, אבטח את משפך ההפרדה מעל הבקבוק.

מוסיפים את תערובת התגובה למתנול הקר בקצב של שתי טיפות בכל שנייה. אוספים את המשקעים הלבנים המתקבלים על נייר פילטר. יבש את המשקעים בתנור ואקום בין 50 ל-60 מעלות צלזיוס כדי לקבל את מוצר ה-SBC אלפא-כלורו בעל שלוש זרועות.

כדי להכין את ה-SBC בעל שלוש הזרועות של אלפא כולסטריל, אטום הכלור התליון מוחלף באזיד. תגובת קליק עם כולסטריל 5-הקסינואט מביאה לכולסטריל תליון כחלק הגביש הנוזלי. כדי להתחיל בהכנת פיגום אלסטומר גביש נוזלי, שלב 0.75 גרם של SBC תלת זרועי אלפא-כולסטריל עם 0.25 מיליליטר HDI ו-0.24 מיליליטר אפסילון-קפרולקטון מזוקק.

הוסף לזה 60 מיקרוליטר של 10-2-אתיל הקסנואט ומערבל את התערובת. לאחר מכן, גזרו חתיכה של סנטימטר על ארבעה סנטימטרים של קצף מתכת ניקל. מגלגלים את קצף הניקל לגליל בקוטר סנטימטר אחד ובגובה סנטימטר אחד ליצירת תבנית לפיגום קצף אלסטומר גביש נוזלי.

מניחים את התבנית בבקבוקון זכוכית או במארז נייר אלומיניום, ויוצקים את תערובת אלסטומר הגביש הנוזלי על התבנית עד לכיסוי מלא. הניחו לתבנית לשבת בתערובת אלסטומר גביש נוזלי למשך שתי דקות, ולאחר מכן הסירו את העודפים בעזרת פיפטה. מחממים את התערובת והתבנית בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן, מקלפים את נייר האלומיניום, או שוברים את הכוס. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר עודפי אלסטומר גביש נוזלי כדי לחשוף את תבנית מתכת הניקל. מניחים את הקצף בבקבוק ומוסיפים 70 מיליליטר של תמיסה מימית רוויה של ברזל שלושה כלוריד.

מערבבים את הקצף בתמיסה למשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר כדי להמיס את תבנית הניקל. כל 24 שעות מערבבים את הקצף במים נטולי יונים למשך 30 דקות, ולאחר מכן ממשיכים לערבב בתמיסת ברזל טרי שלושה כלורידים. לאחר היום השני של הערבוב, בצע בדיקת דחיסה מישוש על קצף אלסטומר גביש נוזלי.

עמידות בפני דחיסת מישוש מצביעה על כך שתבנית הניקל עדיין קיימת בקצף. לאחר היום השלישי, כל תבנית הניקל בוטלה, והקצף שנוצר נראה רך מאוד וקל לדחיסה מלאה. יש לבטל לחלוטין את תבנית הניקל.

חשוב לשטוף היטב את קצף האלסטומר הגבישי הנוזלי בברזל כלוריד עד שהוא רך למגע בעת ביצוע בדיקת דחיסה מישוש. פיגום קצף אלסטומר קריסטל נוזלי מוכן כעת לאפיון ושימוש. לאחר שקצף אלסטומר הגביש הנוזלי רך, שטפו אותו עם 70% אתנול כדי לעקר אותו.

כדי להתחיל בהליך הזריעה, יש לשטוף שוב את פיגומי קצף האלסטומר הגבישי הנוזלי פעמיים במיליליטר אחד של אתנול 70% כדי לעקר את משטחי האלסטומר. לאחר מכן, הקרינו את הפיגומים באור UV למשך 10 דקות. שוטפים את הפיגומים עם מנה נוספת של מיליליטר של 70% אתנול.

שוטפים את הפיגומים במיליליטר אחד כל אחד של מים סטריליים ותמיסת מלח עם פוספט. טען את פיגומי אלסטומר הגביש הנוזלי המעוקר לתוך צלחות תרבית של 24 בארות. הכן וספור תרחיף של התאים המעניינים במדיום גידול התאים המתאים עם פניצילין וסטרפטומיצין.

מדללים את תרחיף התאים ל -1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים לכל 100 מיקרוליטר באמצעות מדיום גידול. הפקידו טיפה של תרחיף תאים מדולל על גבי כל פיגום אלסטומר גביש נוזלי. דגרו על פיגומי אלסטומר גביש נוזלי זרעים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך שעתיים.

הוסף עוד 0.5 מיליליטר של מצע גידול לכל פיגום, והמשך בדגירה. כל 48 שעות יש לשטוף את הפיגומים הזרעים עם מיליליטר אחד של PBS, ולהוסיף מצע גידול טרי. המשיכו לדגור על הפיגומים עד שהתאים מוכנים למיקרוסקופיה.

LCs סמטיים אלה מאפשרים לחקור מבני רקמה מורכבים תוך קידום צמיחה והתפשטות של תאים. על מנת לשמור על כדאיות התאים, יש לעקר קצף ולשמור על ניקיון התרביות בכל עת. כדי להתכונן למיקרוסקופיה, תקן את התאים על הפיגומים בתמיסה של 4% פרפורמלדהיד ב- PBS למשך 15 דקות.

משרים את הדגימות שלוש פעמים בשלושה מיליליטר PBS למשך חמש דקות. הנח דגימת פיגום אחת בצינור אפנדורף. מכתים את הדגימה בתמיסה של 0.1% DAPI ב -500 מיקרוליטר PBS למשך 10 דקות.

משרים את הדגימה פעמיים במיליליטר אחד של PBS למשך חמש דקות. ואז, צלם מיד את הדגימה במיקרוסקופיה קונפוקלית. רכוש ערימות תמונות המשתרעות על המדגם ונתח את הנתונים בתוכנית עיבוד תמונה.

SBC בעל שלוש זרועות עם חלקי גביש נוזלי נוצק על תבנית קצף ניקל עם HDI כמקשר צולב. תבנית הניקל הוסרה על ידי תחריט כדי להשיג את קצף האלסטומר הגבישי הנוזלי. בדיקות עיוות דחיסה בוצעו מעת לעת כדי לפקח על תהליך התחריט.

לאחר שהניקל הומס לחלוטין, בדיקת עיוות הדחיסה הראתה ירידה של 70% בגודל בעת דחיסה. עם שחרור הדחיסה, קצף אלסטומר הגביש הנוזלי שחזר בעקביות את גודלו וצורתו המקוריים. התנהגות זו מיוחסת לחלקי הגביש הנוזלי, שכן קצף אלסטומר דומה חסר חלק הכולסטרול אפסילון-קפרולקטון לא התאושש מהדחיסה.

SCM של מורפולוגיה הקצף הפנימית הראה רשת מחוברת של תמוכות קצף חלולות. המורפולוגיה הרגילה יוחסה למבנה קצף הניקל, מה שמצביע על כך שניתן לשלוט בגודל הנקבוביות ובצורה הכללית על ידי בחירת תבנית מתכת מתאימה. הקצף נזרע בתאי נוירובלסטומה, שנצמדו לדפנות הרשת תוך יומיים.

30 יום לאחר הזריעה, מיקרוסקופיה קונפוקלית גילתה שהתאים השתרעו על פני רשת אלסטומר הגביש הנוזלי, ויצרו שכבות מרובות המפוזרות ברחבי קצף האלסטומר. נצפתה התארכות של גרעיני התאים, והייתה בקורלציה ליישור התאים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן ולהכין פיגומי תאי אלסטומר גביש נוזלי עם גדלי נקבוביות ומורפולוגיה ספציפיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לאפיין באופן מלא כל מוצר ולעקוב אחר כדאיות התאים והתרחבותם. יתר על כן, טכניקת צביעה נכונה חשובה כדי לרכוש בקלות תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות.

בעקבות הליך זה, אלסטומרים של גביש נוזלי יכולים להיחשף גם לגירויים חיצוניים, כגון מתח, או שדות מגנטיים וחשמליים, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו הסדר המולקולרי האנזוטרופי של אלסטומרים גבישים נוזליים משפיע על תגובת התא. ההשלכות של טכניקה זו חלות על חקר תהליכי מחלה, מכיוון שהיא מספקת פלטפורמה לחקר דינמי של ההשפעות של גורמים חיצוניים על פעילות המחלה המדומה, ותהליכי התיקון שלאחר מכן. למרות שקצף אלסטומר גביש נוזלי סמקטי זה יכול לספק תובנה לגבי אינטראקציות תא-תא, ניתן להשתמש בהם גם עם חומרים אחרים, כגון מוליכים למחצה או ננו-מבנים מתכתיים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומים ביו-רפואיים לתכנן פלטפורמות ניסיוניות ארוכות טווח המשקפות מערכות חיות.