3: ניתוח מתילציה של DNA

מתילציה של DNA היא שינוי כימי של DNA המשפיע על ביטוי גנים בהקשרים תאיים שונים. חוקרים רבים מתעניינים במנגנון ובתפקודים של תהליך זה, שכן מתילציה חריגה של DNA נקשרה למחלות כמו סרטן.

בסרטון זה, נסקור את העקרונות מאחורי מתילציה של DNA ושיטות לאיתורו. לאחר מכן, נחקור פרוטוקול כללי לאחת מהשיטות הללו, ניתוח ביסולפיט, וכמה יישומים של טכניקה זו.

ראשית, בואו נסתכל מהי מתילציה של דנ"א וכיצד ניתן לזהות אותה.

במהלך התהליך הביוכימי הזה, תא מוסיף תג כימי המכונה קבוצת מתיל לבסיסי ציטוזין ב-DNA שלו. רוב הציטוזינים שעברו מתילציה מופיעים ליד בסיסי גואנין באותו גדיל DNA, והנוקלאוטידים הסמוכים הללו והקשר הפוספודיאסטר המקשר ביניהם מכונים "CpGs". למרות שרוב ה-CpG של בעלי החוליות עוברים מתילציה, אלה שאינם עוברים מתילציה נוטים להופיע קרוב זה לזה באיי CpG? ליד מקדמי גנים המתבטאים באופן פעיל, ורכיבי רצף רגולטוריים שונים אחרים.

כיצד שינויים במתילציה של DNA תורמים לוויסות גנים הוא עדיין נושא למחקר אינטנסיבי. נראה כי מתילציה של איי CpG חשובה להשתקת גנים יציבה וארוכת טווח הנראית בתהליכים אפיגנטיים כגון הטבעה גנומית, שהיא ביטוי ספציפי של הורה המקור של גנים מסוימים, כמו גם השבתת כרומוזום X, השתקה של אחד משני כרומוזומי ה-X בכל תא של נקבות יונקים. הוכח גם כי דיכוי גנים קריטיים עקב מתילציה חריגה של איי CpG תורם לצמיחת תאים בלתי מבוקרת, שעלולה להוביל לסרטן. מבחינה מכנית, מתילציה של DNA עשויה לתרום להשתקת גנים על ידי מניעת שיוך גורמי שעתוק למקדמים, או על ידי גיוס חלבונים המשנים היסטונים ומעצבים מחדש את הכרומטין למצב לא מתירני מבחינת שעתוק.

ישנן מספר שיטות לזיהוי מצב המתילציה של ה-DNA.

טכניקה אחת, מבחן HELP, כוללת שני אנדונוקלאזות הגבלה הנקראות HpaII ו-MspI, אשר בהתאמה מבקעות רק רצפי CCGG ללא מתילציה או מתילציה וללא מתילציה על ידי השוואת דפוסי העיכול המיוצרים על ידי שני אנזימים אלה, ניתן להסיק את מצב המתילציה של ה-DNA.

שיטה נוספת, הנקראת DNA מתילציה אימונופרספיטציה או ? MeDIP,? משתמש בנוגדנים הנקשרים לציטוזינים שעברו מתילציה כדי להעשיר את רצפי ה-DNA שעברו מתילציה.

לבסוף, ניתוח ביסולפיט משמש להבחנה בין ציטוזין מתיל לציטוזין לא מתילציה ב- DNA, על ידי ביצוע תגובה כימית הממירה ציטוזין לא מתילציה לאורציל. לאחר המרה זו, DNA שטופל בביסולפיט יכול להיות נתון ל-PCR, לרצף ולהשוות לגנום ייחוס. ציטוזינים ללא מתילציה הם אלה הקיימים בהפניה, אך הוחלפו בתימינים לאחר ניתוח ביסולפיט ו- PCR. על ידי הכפפת DNA שטופל בביסולפיט לספקטרומטריית מסה, חוקרים יכולים גם ליצור "אפיגרמות מתילציה",? המייצגים באופן ליניארי CpGs שונים בגנום ומתארים את מידת המתילציה בכל אחד מהם. אפיגרמות כאלה שימושיות במיוחד אם חוקרים רוצים להשוות דפוסי מתילציה בין סוגי תאים שונים.

בואו נסתכל כעת לעומק על הפרוטוקול לניתוח ביסולפיט.

בתור התחלה, נתרן הידרוקסיד מתווסף לתכשירים של DNA גנומי, אשר לאחר מכן מודגרים ב-95 מעלות צלזיוס. זה מנטרל את ה-DNA והופך את בסיסיו לנגישים לתגובות כימיות עוקבות. לאחר מכן מוכנס נתרן מטאביסולפיט לתערובת ה-DNA המפורקת, ושני שלבי תגובה כימית יתרחשו. במהלך השלב הראשון, סולפונציה, קבוצת סולפיט מתווספת לציטוזין לא מתילציה ליצירת ציטוזין סולפונט. לאחר מכן, במהלך דה-אמינציה הידרולית, קבוצת אמינו מוסרת מציטוזין סולפונאט כדי ליצור אורציל סולפונט.

כדי להקל על השלבים הראשונים הללו של התגובה הכימית, תכשיר ה-DNA מכוסה בשמן מינרלי, המונע אידוי ומסייע בשמירה על ריכוז הנתרן מטאביסולפיט. לאחר מכן התגובה מודגרת ב-55? C בחושך. במהלך שלב זה מוסיפים לתערובת גם חומר למניעת חמצון, כמו קווינול.

כדי לאסוף DNA מותאם המכיל אורציל סולפונאט, וללא שמן מינרלי, התערובת עוברת צנטריפוגה ומשוחזרת השכבה הנוזלית הנמוכה ביותר. לאחר מכן מטוהר ה-DNA בתמיסה זו.

לאחר מכן, נתרן הידרוקסיד מתווסף לתערובת ה-DNA, אשר לאחר מכן מודגר ב-37 מעלות צלזיוס. זה נעשה כדי לגרום לדסולפונציה, אשר, כפי שאולי ניחשתם, מסיר את קבוצת הסולפיט מאורציל סולפונט, יוצר אורציל ומשלים את התגובה הכימית.

לבסוף, התערובת מנוטרלת בתוספת אמוניום אצטט, וה- DNA נאסף על ידי משקעי אתנול. לאחר טיהור ה-DNA שהומר לביסולפיט, הוא נתון ל-PCR ולריצוף.

כעת, לאחר שדנו בטכניקה הבסיסית לניתוח ביסולפיט, בואו נסתכל על כמה יישומים ניסיוניים.

חלק מהחוקרים משתמשים בניתוח ביסולפיט כדי לחקור הטבעה גנומית. כאן, החוקרים הכלאו שני זנים של Arabidopsis עם הבדלים גנטיים, כך שניתן היה להבחין בין DNA אימהי לאב. לאחר מכן הושוו דפוסי מתילציה בעוברים המתקבלים ובאנדוספרם הנלווה, או הרקמה התומכת בעובר. באמצעות שיטה זו, מדענים מצאו כי CpGs באלל האימהי של גן מקודד חלבון, MEA, נוטה לעבור מתילציה בעוברים אך לא מתילציה באנדוספרם, מה שמעיד על הטבעה ספציפית לרקמה.

חוקרים אחרים משתמשים בטכניקה זו כדי להבין כיצד גורמים סביבתיים או חברתיים יכולים לשנות דפוסי מתילציה. כאן, גורי עכברים הופרדו מאמהותיהם כדי לגרום לסטרס, ורקמות המוח שלהם בודדו לאחר מכן. לאחר ריצוף של DNA שטופל בביסולפיט, מדענים קבעו כי דפוסי מתילציה בגן מקודד הורמונים, AVP, השתנו באזור ספציפי במוח ב ?נפרד? PUPs, מה שמרמז על מנגנון מולקולרי אפשרי להשפעות ביולוגיות ארוכות טווח של ניסיון חיים מוקדם.

לבסוף, חוקרים רבים מנסים לייעל את ניתוח הביסולפיט כדי להקל על השוואת דפוסי המתילציה בין תאים בודדים וייחודיים. כאן, החוקרים שינו את שיטת ניתוח הביסולפיט כך שכל השלבים בוצעו על ביציות עכברים בודדות המוטמעות באגרוז, מה שעזר להגן מפני אובדן DNA. באמצעות שיטה זו, החוקרים הצליחו לזהות בקלות דגימות של ביצית בודדת שזוהמו בתאים אחרים על ידי חיפוש אחר אלה שנתנו דפוסי מתילציה מרובים.

זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על ניתוחים רגישים למתילציה. כאן, דנו בתפקיד שמתילציה של DNA ממלאת בוויסות גנים, שיטות שחוקרים משתמשים בהן כדי לזהות אזורים שעברו מתילציה בגנום, פרוטוקול כללי לניתוח ביסולפיט, ולבסוף, כמה יישומים של טכניקה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!