Name: שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: למדו שיטה לייצור חלבון mCD1d רקומביננטי בתאי חרקים High Five באמצעות זיהום בבקולובירוס. שיטה זו מאפשרת ייצור טטרמרים לזיהוי תאי NKT במחקרים אימונולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

I. ההפשרה תאים קח את הבקבוקון קפוא של TN5 תאים, להפשיר אותה אמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום אקספרס חרקים (Invitrogen, קטלוג מספר 10486) בבקבוק 2 25cm TC. שים לב אקספרס five מגיע ללא גלוטמין, צריך להוסיף 10 מ&quot;ל של סטרפטוקוקוס עט גלוטמין גלוטמין 100x או לבד עד 1 ליטר התקשורת. הוסף TN5 תאים לתוכו דגירה במשך 30 דקות ב 27 מעלות צלזיוס חממה. ואז, לשאוב את המדיום עם DMSO בעדינות מבלי להפריע תאים המצורפת בתחתית הבקבוק. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום טריים. השנייה. גידול והרחבת תאים צג התאים בכל יום. כאשר הבקבוק הוא כמעט 70% ומחוברות, להביא את התאים ההשעיה מדפיקות את הבקבוק משני הצדדים ולהעביר את התאים בקבוק 175cm 2 על ידי הוספת 21 מ&quot;ל של מדיום לבטא חרקים ו 5 מ&quot;ל של תרבית תאים. כל בקבוק T175 צריך מסביב בינוני 25-30 מ&quot;ל נפח סופי. פיצול בקבוק ומחוברות (כ 1000000 / ml קונצרט כלשהו.) 04/01 או 05/01 לפי הצורך. אל תתנו לגדול יותר תאים. ספירת הקטעים שיש לך לפצל את התאים. אל לצמוח לאורך קטע מספר 30 כי זה עלול לגרום להזדקנות של תאים והתוצאה תמוגה התא. כאשר אתם מגיעים בנפח הרצוי בריכוז של 1 מ&quot;ל / מיליון דולר, להדביק את התאים. אני בדרך כלל גדלים 2-2.5 ליטר, אשר בדרך כלל כמויות עד שבעים 175cm 2 צלוחיות וכ. 25 עד 30 מ&quot;ל בבקבוק / או חמש Erlenmeyer 1 ליטר צלוחיות וכ. 400ml ל -500 מ&quot;ל בבקבוק אחד הערה: אתה גם יכול לגדל תאים בקבוק T-175 תקע חותם או בקבוק קורנינג Erlenmeyer. התאים גדל Erlenmeyer צלוחיות הוא מהיר וקל יותר. ג. Titering וירוס על ידי שיטת נקודת הסיום דילול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3000-5000 פלייט לכל התאים היטב לתחתית צלחת שטוחה 96 היטב 200ul של המדיום five SFM Express. בואו התאים להתיישב 27 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את דילול המניות הסידורי של baculovirus. אחד צריך לעשות 1 / 10 דילול בשורה אחת של צלחת 96 U היטב לתחתית בעזרת 250ul לכל טוב. דילולים מתקבלות בינוני חמישה SFM Express. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טפטפת רב, להעביר סכום קבוע (בדרך כלל 20 ul) של דילולים שונים על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ב 27 ° C למשך 7 ימים. כדי למנוע אידוי של שורות לקצה, לעטוף את הקצוות של צלחת עם parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים, לבדוק את הצלחת לקבוע אילו דילול של נגיף דלקת נותן 50% - במחצית בארות בריכוז זה וירוס נגועים). ואז להשתמש בנוסחה כדי לחשב את titer, המתבטא pfu / מ&quot;ל ​​(pfu-פלאק יחידות להרכיב). הנוסחה היא למצוא מדריכים baculovirus ביותר. </li></ol> IV. הדבקה של תאים חשוב מאוד לדעת את titer מדויק של הנגיף. הוסף את הכמות הנדרשת של הנגיף. להכנת מלאי ויראלי התאים צריך להיות נגוע על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של לא יותר מ 1 (1pfu כדי 1High חמש התא) גבוהה משרד הפנים מוביל הייצור של מוטציות ויראליות. עבור ייצור החלבון, הכמות הרגילה היא 50-10 MO1. דוגמה: כייל של baculovirus mCD1d = 1X108 pfu / ml הוסף הפנים = 1 (כדי להגביר את הנגיף) = 20X10 ^ 6 תאים / בקבוק / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 UL / בקבוקון משרד הפנים = 5 עד 10 (לייצור חלבון) = 1ml כדי 2ml עבור 20x10 ^ 6 תאים / בקבוקון ביום 4 לאחר ההדבקה, מסתכל על תאים נגועים. הם צריכים להיות מנותקת, מרחפת, נקניקיות נפוחות יוצרים. V. Supernatants שחזור קחו את המדיום של צלוחיות נגוע, להעביר בקבוקי 250 מ&quot;ל כחול כובע פלקון ספינינג. הם יכולים להיות autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר. מלאו את הבקבוקים באופן שווה צנטריפוגות התאים Sorvall GSA הרוטור ב 200rpm, 20 דקות, 4 ° C. אסוף את supernatant והמשך לטיהור נוסף. VI. טיהור mCD1d רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזה וריכוז במאגר סודיום פוספט 150mm (pH 7.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי Ni-agarose כרומטוגרפיה נ.ת. ע, elute החלבון mCD1d + b2m עם 150mm פוספט נתרן 200 mM Immidazole </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה באמצעות טור Desalting 20mm טריס HCL pH8 חיץ להיפטר Immidazole </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Exchange כרומטוגרפיה אניון באמצעות טור MonoQ לחסל את המזהמים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז כדי 1mg/ml באמצעות י&quot;מ 30 concentrator (Millipore) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotynlation בירה האנזימטית של mCD1d על פי פרוטוקול של היצרן (רעבתנות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביוטין חינם מסולק על ידי טור S200 (הרחקה Chromatograpy גודל) באמצעות בופר פוספט (PBS), pH7.4. ממוצע של 2 עד 3 מקלעים של חלבון biotynlated ניתן לקבל 2 ליטר של supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה של-Galcer CD1d tetramer. </li></ol> על מנת לטעון מולקולה CD1d עם-Galcer, מסיסים biotynlated CD1d-B2מ &#39;הוא מודגרות לילה עם עודף three טוחנת קיפול של Galcer-a, מומס 0.5% ב -20 Tween PBS, כלוריד הנתרן O.9% בטמפרטורת החדר. Tetramers נוצרים על ידי ערבוב של-Galcer מונומרים טעון CD1d עם עודף של פי 4 טוחנת PE - streptavidin מצומדות ו דוגרים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. חנות ב 48 ° C.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

בהליך זה, הוא הראה כיצד ליזום, לגדול, להדביק תאים חרקים וכיצד titer baculovirus באמצעות תאים אלה. ההיבטים החשובים ביותר של הליך זה הם אחזקה של תאים לדעת את titer המדויק של baculovirus. ברגע שיש לך שנוצר CD1 tetramers, הם יכולים לשמש כלי רב עוצמה לניתוח glycolipid בתאי T תגובתי. מערכות Baculovirus משמשים גם נרחב כדי לייצר חלבונים רקומביננטי, כולל tetramers MHC Class II ולכן הליך זה יש תחולה רחבה הרבה יותר.

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td>מצע נטול סרום</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td>תאי חרקים</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>אנטיביוטיקה</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק TC 25cm2</td><td>פלסטיק</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק TC 175 cm2</td><td>בקבוק עם פקק אטימה</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ארלנמאייר</td><td>בקבוק לתרבית תאים</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>מרכז YM 30</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>ציוד FPLC</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנזים ובופר BrA</td><td>ערכה לביוטינילציה</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Ni-NTA Agarose</td><td>עמודה לניקוי חלבונים עם His Tag</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודת הסמכה</td><td>להסרת מלחים מהחלבון</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודת MonoQ</td><td>כרומטוגרפיית חילוף אניונים</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודת S200</td><td>כרומטוגרפיית הדרכה גודלית</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td>גליקוליפיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE- Streptavidin</td><td>לצמידת חלבון</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mcd1d בתוך תאים חרקים.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 חלבונים מהווים המחזור השלישי של אנטיגן הצגת מולקולות. הם פני התא גליקופרוטאינים, כפי שבאה לידי ביטוי שרשראות כבדות כ 50-kDa glycosylated המשויכים noncovalently עם microglobulin-Beta2. הם נקשרים שומנים ולא פפטידים. למרות המבנה שלהם מאשר את הדמיון של CD1 חלבונים MHC אני בכיתה ו הכיתה מולקולות II הצגת אנטיגן, mCD1d חריץ צר יחסית, עמוק, הידרופובי מאוד ויש לו שני כיסים מחייב במקום הכיסים רדוד מספר תיאר הקלאסית MHC- מקודד אנטיגן הצגת מולקולות. בהתבסס על רצפי אמינו חומצה שלהם, כגון חריץ hydrobphobic מספקת סביבה אידיאלית עבור הכריכה של אנטיגנים השומנים. הרוצח טבעי T (NKT) תאים להשתמש TCR שלהם להכיר glycolipids חייב או שהציג CD1d. בתאי T תגובתי שומנים שהציג CD1 היו מעורבים הגנה נגד מחלות אוטואימוניות זיהומיות בבית דחייה הגידול. לפיכך, היכולת לזהות, לטהר, ולעקוב אחר תגובת התא NKT CD1-reactive היא בעלת חשיבות רבה. הדור של tetramers של אלפא Galactosyl ceramide (א-Galcer) עם CD1d יש תובנה משמעותית לתוך הביולוגיה של תאים NKT. Tetramers בנויים CD1 מולקולות אחרות יש גם שנוצר אלה ריאגנטים חדשים הרחיבו מאוד את הידע של הפונקציות של שומנים בדם תגובתי בתאי T, עם שימוש פוטנציאלי ניטור התגובה השומנים מבוסס חיסונים באבחון של מחלות אוטואימוניות אחרות טיפולים.

שיטה להכנת תאים חרקים להדביק אותם עם baculovirus לצורך הייצור של proteinand רקומביננטי mCD1d יצירת tetramers mCD1d.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

חלבוני CD1 מהווים מחלקה שלישית של מולקולות מציגות אנטיגן. אלו הן גליקו-פרוטאינים על פני השטח של התא, המבוטאים כגליקו-פרוטאינים גליקוזילאציוניים בעלי מסה של כ-50 kDa...

שלום, אני Ashra Corona מהמעבדה של Dr.Mitch Kronenberg במחלקה לאימונולוגיה התפתחותית ב-La Jolla Institute for Allergy and Immunology. היום אראה לכם כיצד להכין תאי חרקים מסוג high five ולהדביק אותם ב-VIR לצורך ייצור של MA CD 1D tetramers. CD 1D tetramers משמשים את המעבדה שלנו ומעבדות אחרות לזיהוי של תאי NKT.מערכות VIR משמשות באופן נרחב לייצור חלבונים רקומביננטיים, כולל MS C class two TE tremors. לכן, לנוהל שיוצג בפניכם יש יישום רחב הרבה יותר. נוהל זה כולל את התחלתם וגידולם של תאי חרקים מסוג high five, הדבקת התאים בראו-וירוס (reovirus) הנושא CD 1D CDNA, איסוף הסופיננט (supinate) באמצעות סבוב (centrifugation) ארבעה ימים לאחר ההדבקה, ליזיס של ריכוז החלבון בבופר sodium phosphate בריכוז 150 millimeter, pH 7.4, טיהור של חלבון mouse CD 1D באמצעות nickel ו-T agros ושיטת iron exchange romme, ריכוז של M CD one G protein ל-one me per ML באמצעות מרכז YM 30, וביצוע enzymatic violation של mouse CD 1D לפי פרוטוקול AVID D, וסוף כל לאחר מכן סילוק של BioTeam חופשי באמצעות עמודת S 200.ולבסוף, הפקה של alpha gel CD 1D Tet. אף על פי שההליך כולו כולל את כל השלבים הללו, היום נראה לכם רק כיצד לטפל בתאים אלו ולהדביק אותם בנגיף במטרה להפיק עוד CD 1D tremors. בואו נתחיל.ראשית, אשמח להראות לכם כיצד להשתמש בתאי ח

a-method-for-production-of-recombinant-mcd1d-protein-in-insect-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר בית carboxylesterase לעוף חלבונים במבחנה עם מערכת ביטוי תא חרקים baculovirus מתווכת, מאוחר יותר פונקציונלית לאפיין את תפקידיהם פרמתרין חילוף חומרים, ובכך, היוועצות pyrethroid התנגדותם מבוססת תא MTT assay, במבחנה מטבולית מחקרים.

אפיון פונקציונלי Carboxylesterases הבית בקוטלי חרקים עמידים בזבובים, דומסטיקה זבוב

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

למדו שיטה לייצור חלבון mCD1d רקומביננטי בתאי חרקים High Five באמצעות זיהום בבקולובירוס. שיטה זו מאפשרת ייצור טטרמרים לזיהוי תאי NKT במחקרים אימונולוגיים.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

גלה סרטונים נוספים