פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים
1 במאי 2017
פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ללכוד דינמיקת ממברנה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים לאחר אינדוקציה של פעילות עצבית באמצעות אופטוגנטיקה ולאחר מכן הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדרות לאחר הגירוי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח ובביולוגיה של התא לגבי המנגנונים של מיחזור שלפוחית סינפטית ואולי גם מודלים בקנה מידה מהיר מאוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לדמיין שינויים מורפולוגיים בתוך תא באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים בסולם זמן של אלפית השנייה.
ההליך יודגם על ידי שואו לי, סטודנט לתואר שני וסומאנה ראיצ'ודורי, עמית מחקר. שניהם מהמעבדה שלי. לפני הכנת הקיבוע, סמן שני קבצים קריוגניים של מיליליטר בעיפרון בהתאם למספרי הדגימה שלהם.
לאחר מכן שלבו את כל הריאגנטים המקבעים, וציינו מיליליטר אחד של נפחים של הקיבוע לכל בקבוקון. לאחר סגירת הצינורות, טבלו מיד מקבעים בחנקן נוזלי ואחסנו את הבקבוקונים בקופסת קלקר סגורה. לאחר מכן, מלאו יחידת החלפה חופשית אוטומטית ומקפיא בלחץ גבוה בחנקן נוזלי.
לאחר מכן הניחו מיכל קטן של אצטון בתא הדגימה של יחידת ההחלפה החופשית והמתינו עד שהטמפרטורה של יחידת ההחלפה תגיע למינוס 90 מעלות צלזיוס. כדי לתכנת את פרוטוקול גירוי האור, לחץ על ערוך בחלון גירוי האור של צג מסך המגע. ייפתח חלון נוסף.
הזן 15 שניות עבור השלב הכהה. 100 אלפיות השנייה עבור התקופה. 10 אלפיות השנייה עבור הדופק, ואחת עבור מספר התקופות עבור גירוי יחיד של 10 אלפיות השנייה.
במסך הראשי, ודא שתיבת גירוי האור מסומנת, ולחץ על אחסון דגימה ואחריו ערוך. בחלון החדש, השתמש בלחצן הפלוס או המינוס כדי לבחור שתיים כדי לאחסן שתי דגימות בכל ערוץ ולאשר שחנקן נוזלי מופעל באחסון. כעת תחת מיקרוסקופ סטריאו, הנח תא דיסק ספיר כלפי מעלה בבאר של צלחת שחורה אמצעית.
ואחריו טבעת מרווח של 100 מיקרון. טבלו צד אחד של דיסק ספיר ריק בתמיסת מלח מחוממת מראש והניחו את הדיסק מעל טבעת המרווח, כשצד המלח כלפי מטה. הניחו טבעת מרווח נוספת של 100 מיקרון.
וטבעת מרווח של 400 מיקרון על גבי דיסק הספיר האחרון, והשתמש בנייר סינון כדי להסיר עודפי נוזלים. תוך כדי החזקת הדגימות, הקפד לא ללכוד בועות אוויר בין דיסקיות הספיר. לאחר מכן הנח את כל המכלול בין שני חצאי הצילינדרים השקופים וסגור את המכסה האדום העליון כדי להתחיל את תהליך ההקפאה.
הכיסוי האדום יופיע בחזרה אוטומטית לאחר השלמת תהליך ההקפאה. לאחר שכל הדגימות הוקפאו, פתח את הדלת לדואר האחסון והעביר את הדואר לספסל. העבירו את תא הדגימה ממחסן האחסון למגש דגימה מיוחד מלא בחנקן נוזלי.
ופתח את הכפתור כדי לשחרר את הדגימה. לאחר מכן השתמש בזוג פינצטה עם קצות מקוררים בחנקן נוזלי כדי להסיר את חצאי הגלילים השקופים מכוס הדגימה. והעבירו בזהירות את הצלחות השחורות האמצעיות לכוס קטנה המכילה חנקן נוזלי.
הקפד לשמור את הדגימות הקפואות תחת חנקן נוזלי בכל עת, ולשמור תמיד לטפל בדגימות עם פינצטה מקוררת מראש. מצננים מראש את הפינצטה שוב, ומעבירים במהירות את הצלחת האמצעית הראשונה לאצטון שהתקרר מראש. ניעור עדין והקשה על הצלחת כדי להפריד את דיסק הספיר מהצלחת.
לאחר מכן הנח קובץ קריוגני פתוח של קיבוע לתוך תא דגימה ביחידת ההחלפה. העבירו את דיסק הספיר לתוך הבקבוקון. ומיד מכסים את הבקבוקון.
לאחר שכל הדגימות הועברו, הגדר את הפרמטרים המתאימים של תוכנית ההחלפה החינמית והתחל את התוכנית. בתום תוכנית ההחלפה החינמית, השתמש בכפפות כדי להעביר את הקבצים הקריוגניים מתא הדגימה למכסה המנוע הכימי והשתמש בפיפטה כדי להוסיף אצטון בטמפרטורת החדר לכל בקבוקון. החלף את הכביסה בכל בקבוקון באצטון טרי ארבע עד שש פעמים במשך שעה עד שעתיים.
לאחר מכן הוסף שרף אפוקסי טרי של 30% שהוכן לכל בקבוקון לדגירה של שעתיים-שלוש בטמפרטורת החדר בשייקר אורביטלי ב-120 סל"ד. בתום הדגירה, החלף את שרף האפוקסי 30% בשרף אפוקסי 70% למשך שלוש עד ארבע שעות על שייקר המסלול. לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי להעביר כל דיסק, צד התא כלפי מעלה, למכסה של קפסולת הטבעה ולהוסיף שרף אפוקסי 90% לדיסקים לדגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, העבירו כל דיסק ספיר למכסה של קפסולת הטבעה חדשה, ומלאו את הפקק בשרף אפוקסי 100% שהוכן טרי. לאחר הדגירה האחרונה של שרף אפוקסי של 100%, יש לפלמר את הדגימות בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. כאשר הדגימות התפלמרו, הנח את הדגימה הראשונה הפוכה על מיקרוסקופ הסטריאו כך שדיסק הספיר ממוקם בחלק העליון של גוש השרף, והשתמש בסכין גילוח כדי להסיר שכבה דקה של שרף מהחלק העליון של הדגימה.
לאחר מכן, השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך קו רדוד לאורך קצה הדיסק כדי להפריד את דיסק הספיר משרף האפוקסי. וטבלו את הדיסק בחנקן נוזלי למשך כ -10 שניות כדי להפריד את הדיסק משאר השרף. העבירו את השרף תחת מיקרוסקופ מנתח, והדביקו את הדגימה לשלב המיקרוסקופ.
באמצעות הגדלה של פי 4 עד 10, מצא אזור עם תאים והשתמש בסכין גילוח פיפיות כדי לחתוך אזור של שניים על שני מילימטר סביב אזור העניין. לאחר מכן השתמש בדבק-על כדי להרכיב את התאים על גוש דמה גלילי עשוי שרף אפוקסי, ודגירה על הבלוק בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר חיתוך על ספר אולטרה מיקרו, העבירו את הדגימות למיקרוסקופ אלקטרונים שידור להדמיה בהגדלה של 930,000X.
בתמונה זו, מוצג איחוי שלפוחית סינפטית באמצעות אקסוציטוזיס שנרשם 15 אלפיות השנייה לאחר הופעת האור באזור הפעיל של קרום פרה-סינפטי בנוירון היפוקמפוס של עכבר. 100 אלפיות השנייה לאחר הופעת האור ניתן להבחין בבור אנדוציטוטי הסמוך לאזור הפעיל, הממחיש אנדוציטוזיס מהיר במיוחד על ידי תא העצב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבד דגימות באמצעות ניסויי פלאש והקפאה.
זכרו, עבודה עם גלוטראלדהיד, אוסמיום טטרוקסיד וחנקן נוזלי יכולה להיות מסוכנת מאוד, ולכן הקפידו ללבוש ביגוד מגן. לאחר שליטה, ניתן לבצע את חלק ההקפאה של הליך זה תוך כמה שעות עבור 12 דגימות, אך שאר ההליכים כולל הדמיה וניתוח תמונה יכולים להימשך עד ימים או שבועות או אפילו חודשים, ולכן זה יכול להיות הליך ארוך מאוד. אם אתה ממקם חלבונים, או מדמיין את הדינמיקה שלהם, אתה יכול גם להשתמש בפרוטוקולים שונים כדי לשמר אנטיגניות, או פנינה מחלבונים פנינים ולדמיין את הדינמיקה שלהם באמצעות טכניקות אלה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג את טכניקת ה-"flash-and-freeze", שיטה למיקרוסקופיה אלקטרונית בעת רציפה (time-resolved) המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה מהירה של ממברנות בנוירונים. על ידי שילוב של גירוי אופטוגנטי עם הקפאה בלחץ גבוה, חוקרים יכולים ללכוד שינויים מורפולוגיים, כגון היתוך של שלפוחיות סינפטיות ואנדוציטוזה, ברזולוציה זמנית של מילישניות וברזולוציה מרחבית של ננומטרים. הפרוטוקול מודגם באמצעות נוירונים מההיפוקמפוס של עכבר המבטאים channelrhodopsin, מה שמאפשר השראה ותצפית מדויקות של אירועים סינפטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה אלקטרונית
- אופטוגנטיקה
רקע
- קממי תאים והתפלגויות חלבונים הם דינמיים ביותר, אך קשה להדמיים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה.
- במיקרוסקופיה אלקטרונית מסורתית חסרה היכולת לתעד אירועים תאיים מהירים וחולפים.
- אופטוגנטיקה מאפשרת בקרה זמנית מדויקת של פעילות נוירונלית.
- הבנת מיחזור של שלפוחיות סינפטיות ודינמיקת ממברנות היא קריטית למחקר במדעי המוח.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של שיטה לוויזואליזציה של דינמיקה מהירה של ממברנות בנוירונים.
- תיעוד שינויים מורפולוגיים במהלך העברה סינפטית בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי.
- אספקת פרוטוקול המאפשר לחוקרים ללמוד על היתוך של שלפוחיות סינפטיות ואנדוציטוזה בדיוק זמני גבוה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביטוי של channelrhodopsin בנוירונים של ההיפוקמפוס בעכבר לצורך גרייה אופטוגנטית.
- השראה של פעילות נוירונלית באמצעות פולס אור מבוקר.
- הקפאה בלחץ גבוה של תאים בנקודות זמן ספציפיות לאחר הגרייה.
- עיבוד דגימות הכולל תחליף הקפאה, הטמעה בשרף, חיתוך ודימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני חודר (transmission electron microscopy).
תוצאות עיקריות
- לכידה מוצלחת של היתוך של ואסיקולות סינפטיות (אקסוציטוזה) בתוך 15 ms לאחר גירוי באור.
- צפייה בבורות אנדוציטוטיות המעידות על אנדוציטוזה אולטרה-מהירה 100 ms לאחר הגירוי.
- יצירת מערכי נתונים גדולים לצורך ניתוח עיוור של שינויים מורפולוגיים לאורך זמן.
- הדגמה ששיטת ה-flash-and-freeze מאפשרת ויזואליזציה של דינמיקת ממברנה ברזולוציה של מילי-שניות.
מסקנות
- טכניקת ההקפאה המהירה (flash-and-freeze) מספקת גישה עוצמתית לחקר אירועים תאיים מהירים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.
- שיטה זו מקדמת את היכולת לחקור מנגנונים של מחזור שלפוחיות סינפטיות ועיצוב מחדש של ממברנות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקולים לצורך איתור חלבונים או ויזואליזציה של דינמיקה חלבונית באמצעות טכניקות שימור חלופיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית אלקטרונים בשיטת הקפאה מהירה (Flash-and-freeze) מאפשרת ויזואליזציה ישירה של דינמיקה מהירה של ממברנות ברזולוציה של מילי-שניות וננו-מטרים, ובכך היא ממלאת פער קריטי בהפחתת סיכונים מכניסטיים בקווי מחקר של נוירוביולוגיה וביולוגיה של התא. יכולת זו תומכת בביטחון ניבואי בתיקוף מטרות ובחקירת מסלולים תפקודיים, ובמיוחד עבור מחזורי שלפוחיות סינפטיות ועיצוב מחדש של ממברנות. גישה זו מייצרת מערכי נתונים בעירים שמעניקים מידע להחלטות בשלבי גילוי מוקדמים ובמחקרים תרגומיים בתיקי מחקר של מדעי המוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על אירועי התמזגות ומחזור של ממברנות בעקבות גרייה אופטוגנטית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות תיעוד שינויים מורפולוגיים חולפים בנקודות זמן מוגדרות.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות המעורבות במחזור של שלפוחיות סינפטיות ובתעבורת ממברנות.
- מספק ראיות ברזולוציה גבוהה כדי לבסס את הביטחון החזוי בתוכניות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור זרימות עבודה של דימוי כמותי בהמשך התהליך.
- מספק מערכי נתונים הניתנים לשחזור ובעלי רזולוציית זמן, המתאימים לניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולי גירוי והקפאה לצורך הגדלת קנה המידה של הבדיקה.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות או הפרעות גנטיות על דינמיקת ממברנה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדים מורפולוגיים לתהליכי קרום וסינפסה הרלוונטיים למחלה.
- מספקת רצף מתובנות מכניסטיות בשלב הגילוי ועד לתיקוף במודלים פרה-קליניים.
- מאפשרת התקדמות מותאמת-סיכון על ידי קישור אירועים תאיים לתוצאות תפקודיות.
- תומכת בפיתוח ביומרקרים באמצעות ניתוח כמותי של קינטיקת מחזור השלפוחיות.
שילוב תהליכי עבודה וסבבי עיבוד
שיטת ה-Flash-and-freeze משלבת את הממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומגשרת בין גרייה אופטוגנטית למיקרוסקופיה אלקטרונית ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח בעל רזולוציית זמן.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות לגבי התזמון והרצף של אירועי ממברנה בעקבות גירוי מוגדר.
- סריקה: מספקת תוצרי דימוג כמותיים וניתנים לשחזור לצורך השוואת תנאים ופיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מייצרת מערכי נתונים גדולים בניתוח עיוור התומכים בהערכה סטטיסטית של שינויים מורפולוגיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים לתהליכים רלוונטיים למחלות במערכות נוירונליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת להתאמה למחקרי לוקליזציה של חלבונים ומחקרים דינמיים בסוגי תאים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של ממברנות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של טיפול בדגימות והדמיה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת תהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים מורפולוגיים בעלי תוכן גבוה ורזולוציה זמןית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסים בתחומי הנוירוביולוגיה והביולוגיה התאית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באופטוגנטיקה, מיקרוסקופיה אלקטרונית וטיפול בדגימות בקריוגניקה.
- נדרשת גישה להקפאה בלחץ גבוה, החלפה בהקפאה ותשתיות דימוג מתקדמות.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי הגירוי וההקפאה בין צוותים שונים.
- ניתן להתאימו למחקרי לוקליזציה של חלבונים או למחקרים דינמיים באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- ספיקת הדגימות ולוחי זמני הניתוח עשויים להתארך בשל שלבי הכנה ודימוג מורכבים.
