Name: תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד שיטה לבידוד וגידול תרביות עיקריות מעורבות של תאי מעי דק ממקור מורין לחקר הפרשת הורמוני מעי ודימוי תאי Enteroendocrine בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GLP-1-מבחנים חיסוניים בוצעו על ידי מעבדת assay ביוכימיים Core בבית חולי Addenbrooke. עבודה זו, לאורך השנים, היה נתמך על ידי קרן Wellcome (כיום מענקים פעילים 106,262 / Z / 14 / Z ו- 106,263 / Z / 14 / Z) ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) (מענקים MRC_MC_UU_12012 / 3 ו MRC_MC_UU_12012 / 5).

הנהלים כל חיה אושרו על ידי אוניברסיטת קיימברידג &#39;צער בעלי חיים וגוף סקירה אתיות תאמו את חיות (הליכים מדעיים) Act 1986 תקנות תיקון (SI 2012/3039). אופן ההכנה 1. ב Advance <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים aliquot של מטריקס קרום במרתף (BMM) (~ 200 μL) על הקרח להפשיר. הערה: BMM מבצרת בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חמים 50 מ&quot;ל סטרילי גבוהה גלוקוז בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) (ללא תוספות) ו ~ 40 בינוני מ&quot;ל סטרילי תרבות (DMEM גלוקוז גבוהה בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 U / mL פניצילין 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל סטרפטומיצין (P / S), ו 2 מ&quot;מ L- גלוטמין) ב 50 מבחנות צנטריפוגה מ&quot;ל באמבט מים 37 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידן טרום צמרמורת ומגנזיום המכיל פוספט שנאגר מלוח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול 15 מ&quot;ג collagenase (גולמי XI), להוסיף צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל ולשמור על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; זהירות: Collagenase מזיק. זה גורם לגירוי עור (H315) וגירוי בעיניים רציני (H319). זה עלול לגרום תסמיני אלרגיה או אסטמה או קשיי נשימה אם נשאף (H334). זה עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה (H335). יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, למנוע היווצרות אבק ולהימנע נושמים אבק. להבטיח אוורור נאה. </li></ol></li></ol> אוסף רקמות 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 20 מ&quot;ל L-15 בינוני עד צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל ומניחים אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר נקע בצוואר הרחם, או שיטה 1 אחרים שאושרו הזמנים. הערה: רקמת מעי בדרך כלל מתקבלת מעכברים על רקע C57BL6. עם זאת, רקע גנטי אחר גם שמש למשל 129 / SvEv 15. ניסויי הדמיה דורשים שימוש עכברי כתב ניאון למשל Glu-ונוס 1. רקמות מתקבלות עכברים בוגרים (2-6 חודשים) של שני המינים. העכברים הם שוכנו individually-מאוורר כלובים עם כרצונך גישה למים צ&#39;או רגיל. עם זאת, ניסויים כדי לבחון את ההשפעה של תזונה עתירת שומן, למשל, על תפקוד התא enteroendocrine 16 יכול להתבצע אם נתמך על ידי רישיון הפרויקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח בעדינות להסיר מעי עכבר (מ בשוער להתחיל של פי טבעת) באמצעות מלקחיים ומספריים דיסקציה. ולאחסן אותו בינוני L-15 על הקרח עד מוכן לשימוש. </li></ol> 3. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רקמת המעי בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ המכיל מספיק PBS כדי לכסות את הרקמה. קח 10 סנטימטרים של רקמה רצויה (מעי דק העליון למשל, 10 סנטימטרים עליונים, דיסטלי שוער). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוקן את תכולת המעיים בעזרת פיפטה פלסטיק פסטר PBS מקורר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות אחיזה בקצה אחד של קטע המעי ומקום קצה פיפטה פסטר לתוכו. לרוקן את תכולת עם PBS צונן. חזור משני קצותיו עד majoוביטחון של התוכן כבר סמוק החוצה. מעבירים לצלחת פטרי נקי המכיל PBS צונן ורענן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את רקמת השומן ואת לפדר, מקפיד לא לשלוף את שכבת השריר בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את השריר שכבת off &quot;כמו גרב&quot; תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים בסדר. הערה: שלב זה אינו חיוני, אבל מומלץ מאוד. ישנן דרכים חלופיות של הסרת שכבת השריר לזו המתוארת כאן. לדוגמה, במעי ניתן לחתוך פתוח אורכית הראשון, לפני הסרה של שכבת השריר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא נקודת התחלה בסוף הפרוקסימלי יותר של הרקמה שבה קיים דש גלוי של שריר. בעדינות להתרחק כמות קטנה של שכבת השריר לאורך כל הדרך סביב המעי. הערה: כדי למנוע קריעה של שכבת השריר או האפיתל במעי, לצמצם את כוח המתיחות ידי כיווץ שטח פנים גדול יותר מאשר באמצעות tIPS של מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד במעי כמה שיותר דש שריר ככל האפשר, בעדינות לפרק ולהתחיל לקלף את שכבת השריר מרחבי המעי. כדי למנוע קריעה היא שכבת השריר אפיתל, לשמור readjusting עמדת המלקחיים כדי לשמור אותם קרובים זה לזה. בדרך זו, להסיר את שכבת השריר מן האורך של קטע המעי וזורק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי פתוח אורכי או לשטוף ידי מתערבל בצלחת פטרי נקי עם PBS צונן ורענן. חזור במידת הצורך להסיר כל chyme או ריר הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת בשר טחון עם להב אזמל כירורגי כדי להשיג ריבועים של ~ 1-2 מ&quot;מ 2 ולהוסיף האלה ~ 20 מ&quot;ל מקורר PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל בעזרת פיפטה פסטר. כדי להימנע חתיכות רקמה דבקות פיפטה, לנתק את הקצה להרטיב את פיפטה ידי triturating עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הצינור כדי להמשיך לשטוף את חתיכות רקמה. לאפשר לרקמות להתיישב ושופכים או pipette את רוב PBS וחזרו עם PBS הטרי עד PBS נראה ברור. </li></ol> 4. הכנת פלייט / כלי BBM מצופה עיכול בינוני הערה: השלבים הבאים יש לבצע במנדף בתרבית רקמה (עם צעדי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מים באמבטיה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון BMM 2% ב DMEM המקורר (ללא תוספות). תוך כדי עבודה, לשמור על פתרון קרח. אם אתם מחפשים פתרון 2%, להוסיף 140 μL מופשר BMM כדי 7 מ&quot;ל DMEM (מספיק כדי להכין צלחת 24-היטב יחיד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL 2% פתרון BMM לכל טוב (24 גם צלחת) או לכל צלחת הדמיה זכוכית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחות / מנות מצופות למשך 30 דקות לפחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר פילמור נאותה של BMM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מ&quot;ל 50 מחומם מראש DMEM (ללא תוספות) אל collagenase 15 מ&quot;ג (מהמדרגות 1.2 ו 1.4) כדי ליצור פתרון 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ו להפוך להתמוסס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עַלCE נמס לגמרי, באמצעות מזרק 20 מ&quot;ל, לסנן את הפתרון collagenase דרך פילטר 0.2 מיקרומטר סטרילי לתוך צינור צנטריפוגות חדשות סטרילי 50 מ&quot;ל. תווית זו כאמצעי העיכול. </li></ol></li></ol> לעיכול רקמת 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את חתיכות רקמה מן PBS באמצעות 10 מ&quot;ל פיפטה סרולוגיות ולהוסיף צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל סטרילי המכיל DMEM סטרילי מצונן (ללא תוספות), מערבולת ולאחר מכן הסר DMEM. הערה: כדי למנוע רקמות דבקות פיפטה סרולוגיות, להרטיב אותו על ידי טחינה דקה עם DMEM לפני קשר עם הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;Digest&quot; 1 ו 2: סילוק פסולת תא תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עיכול מיליליטר 7 על פיסות הרקמה ולתת צינור מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות (לא מערבולת) הצינור עבור ~ 3 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לרקמות להתיישב וזורקי מדיום העיכול, הזמנהנפח קטן להסתכל במיקרוסקופ. הערה: במיוחד כאשר החלו לצאת, מומלץ מאוד לבדוק נפח קטן של כל &quot;לעכל&quot; (~ 30 μL) תחת מיקרוסקופ כדי לאמוד את התקדמות תהליך העיכול. אם מאורות רבים הם נצפו בשלב זה, את הרעד עשוי להיות יותר מדי נמרץ. לקבלת תמונות מייצגות של מה השלבים השונים &quot;Digest&quot; בדרך כלל נראים, לעיין ב איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.2.-5.2.4 חזור על השלבים (עם מדיום עיכול טרי). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;דייג&#39;סט&quot; 3 עד 5: אוסף של שברי הקריפטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 בינוני העיכול מ&quot;ל לרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לנער כל 5 דקות במשך 10-12 s. הערה: הטלטול הוא יותר נמרץ מאשר רועד עבור &quot;מעכל&quot; 1 ו 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר רקמות מעוכלות להתיישב ולאסוף את מדיום עיכול צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. אםרקמת נאסף בטעות יחד עם המדיום, ולאפשר לו להתיישב, להסיר אותו בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגיות ולהעביר אותו בחזרה אל צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל המכיל את רקמות מעוכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שנאספו בינוני / supernatant ב RT עבור 3 דקות ב 100 גרם x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלולה מ&quot;ל 5 בינוני התרבות מחומם מראש על ידי טחינה דקה עדינה ומניחים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק נפח קטן של השעית התא תחת מיקרוסקופ (ראה הערת משלב 5.2.4). הערה: באופן אידיאלי, שברי הקריפטה להתחיל להופיע &quot;לעכל&quot; 3 יחד עם פסולת תא תאים בודדים. &quot;דייג&#39;סט&quot; 4 ו 5 להכיל מספר גדול משמעותית של שברי הקריפטה עם פסולת התא מופחת (איור 1). התאם רועד בעוצמה לפי הצורך כלומר אם הרקמה לא מעכלים ושברי הקריפטה אינם מופיעים, לנער במרץ רב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.3.1-5.3.6 עד 5 &quot;מעכל&quot; היוהושלם או עד שרוב הרקמות כבר מעוכל (א שיידרש 6 th בתקציר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל supernatants מ &quot;מעכל&quot; 3-5 (או 3-6) נאספו, צנטריפוגה לעכל supernatants ב RT עבור 3 דקות ב 100 גרם x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויי הפרשה, לשלב את supernatants מ &quot;מעכל&quot; 3-5 (או 3-6) לפני צנטריפוגה. הערה: רקמה פחות נחוצה עבור ניסויי הדמיה, ולכן לבחור את supernatant Digest כי הוא (פסולת בהעדר תא תאים בודדים) הנקי עם המספר הגדול יותר של שברי הקריפטה. זהו בדרך כלל &quot;לעכל&quot; 4 או 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant בעדינות מחדש להשעות את הגלולה ידי triturating עד גושים לא גלויים. Re- להשעות את גלולה במדיום תרבות מחומם מראש בתוספת 10 מיקרומטר Y-27,632 dihydrochloride (כדי למנוע anoikis 17). השתמש 5 מיליליטר עבור ניסויי הפרשה ו 2 בינוני תרבות מיליליטר עבור ניסויי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְסַנֵןתא השעיה דרך מסנן 100 מיקרומטר (כדי להסיר את כל רקמה מעוכלת). הפעל מ&quot;ל 2 נוסף של המדיום התרבות מחומם מראש דרך המסנן כדי לשטוף (הנפח הכולל: 7 מ&quot;ל ו 4 מ&quot;ל עבור הפרשת ודימות, בהתאמה). הערה: סינון אינו חיוני, אולם, שברי רקמות גדולות יותר נוטים שלא לדבוק צלחת / מנות. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> איור 1: נציג תמונות של &quot;מעכלת&quot; משיטת תרבות מעי דק עיקרית. (א) חומר אופייני מ &quot;מעכלים&quot; 1 ו 2 המכילים תאים ופסולת תא בודדים בעיקר. (ב) דוגמא של מוצרים מן &quot;לעכל&quot; 3. החיצים השחורים מצביעים שברי הקריפטה המופיעים החומר לעכל. (C) האופייני של &quot;לעכל&quot; 4 או 5. לוח (D) מייצגות ויקווה לעכל חומר&quot;מעכל&quot; 3-5 עבר דרך פילטר 100 מיקרומטר להסיר את שברי רקמות רצויים הגדולים לראות (C). כל התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הפוך עם מטרת 20X. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 6. תרבויות מעי ציפוי (מועשר עבור תאי קריפטה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור פתרון BMM עודף מצלחת או מנות, ולהוסיף 250 μL בינוני התרבות מחוממת מראש ל הפרשה היטב. הערה: מנות ההדמיה הן נותרו ללא בינוני כך להמשיך לשלב הבא במהירות כדי למנוע את המנה מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 250 השעית תא μL לכל טוב (24 גם צלחת) או לכל צלחת זכוכית תחתונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה חכם פלייט ב &quot;זיג זג&quot; בהילוך איטי על פני הבאר. אפשר שברי הקריפטה להסתפק ~ 5 דק &#39;לפני שעבר את הצלחת thחממת דואר. הערה: זה אמור לעודד חלוקה שווה של מאורות / תאים בתוך הבאר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת או מנות לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. הערה: בשכבה &quot;טלאים&quot; צריכה יצרה. לקבלת תמונה מייצגת של התרבויות הבאות שלושה שוטף, ראו איור 2 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות ההדמיה &quot;מבול&quot; עם 2 מיליליטר מחומם מראש בינוני תרבות לכל צלחת. הערה: אלו מאכלים יהיו מתאימים הדמיה עד ~ 72 h הבאים ציפוי. תרבויות גסות בדרך כלל מעמד זמן רב יותר, עד 7 ימים. תאים אשר לא דבק ניתן להסיר על ידי צעד לשטוף. תרבויות ראשיות מוכנות כעת לשמש בניסויים. </li></ol>

<ol><li>Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+sensing+in+L+cells%3A+A+primary+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucose sensing in L cells: A primary cell study.</a> Cell Metab. 8, 532-539 (2008).</li>
<li>Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+chemosensing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gut chemosensing mechanisms.</a> J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).</li>
<li>Lovshin, J. A., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19444259">Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).</li>
<li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li>
<li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).</li>
<li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+trigger+GLP-1+release+predominantly+by+accessing+basolaterally+located+G+protein-coupled+bile+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors.</a> Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).</li>
<li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).</li>
<li>Brubaker, P. L., Vranic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+rat+intestinal+cells+in+monolayer+culture%3A+a+new+in+vitro+system+to+study+the+glucagon-like+immunoreactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides.</a> Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).</li>
<li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag%2C+NCI-H716%2C+and+STC-1+cells%3A+a+comparison+to+native+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ATOH1+and+Neurog3+requirements+define+tuft+cells+as+new+secretory+cell+type+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium.</a> J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).</li>
<li>Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+the+detection+of+peptones+by+murine+small+intestinal+enteroendocrine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells.</a> Peptides. 77, 9-15 (2016).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+GLP-1+secretion+downstream+of+the+ligand-gated+ion+channel+TRPA1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1.</a> Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).</li>
<li>Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galanin+inhibits+GLP-1+and+GIP+secretion+via+the+GAL1+receptor+in+enteroendocrine+L+and+K+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells.</a> Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).</li>
<li>Tolhurst, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+stimulate+glucagon-like+peptide-1+secretion+via+G-protein-coupled+receptor+FFAR2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2.</a> Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).</li>
<li>Richards, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+impairs+the+function+of+glucagon-like+peptide-1+producing+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells.</a> Peptides. 77, 21-27 (2016).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-dependent+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+primary+murine+K+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells.</a> Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).</li>
<li>Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+type+1+receptor-dependent+GLP-1+and+PYY+secretion+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans.</a> Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).</li>
<li>Moss, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+5+and+cannabinoid+receptor+1+activation+inhibit+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+intestinal+K+cells+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents.</a> Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).</li>
<li>Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localisation+and+secretion+of+glucagon-like+peptide+1+and+peptide+YY+from+primary+cultured+human+L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells.</a> Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא בודד של תאי enteroendocrine שכותרתו. כדי להגדיל את הסיכוי של תרבויות המעי דק להיות מוצלחות, חשוב כי הפרוטוקול מתבצע מהר ככל האפשר (רצוי, בתוך 3 שעות של קצירת הרקמות) וכי הרקמות נשמרות במדיום קר כקרח או חיץ לפני לתהליך העיכול, להגביל מוות של תאים. אמנם זה לא הכרחי, במיוחד עבור תרבויות גסות, הסרת שכבת השריר מן המעי הדק הוא מעודדים. פרוטוקול תרבות המעי הדק כבר טופל ככל האפשר. עם זאת, חשוב לציין כי אין תהליך העיכול הוא זהה. ישנם צעדים רבים במהלך הפרוטוקול הזה שבו השתנות ניתן הציגו על בסיס יום-יומי למשל מידת הסרת שריר, בגודל של t&quot;טחון&quot; הוא חתיכות רקמה, עוצמת רועדת, את העוצמה של קבוצה מסוימת של collagenase וכו. לכן, חשיבות עליונה לבחון aliquots של כל אחד שונה &quot;מעכל&quot; תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התקדמות תהליך העיכול חייט טלטול ומספר &quot;מעכל&quot; בהתאם. מומלץ ללחוץ יותר בעדינות מלכתחילה, ואם שברי הקריפטה אינם ברורות מן &quot;לעכל&quot; 3 ואילך, מתחיל לרעוד יותר בתקיפות. מניסיוננו, תאי enteroendocrine לא להתרבות בתרבות ובדרך כלל הולכים לאיבוד מתרבויות קטנות מעי תוך 4 ימים. אף על פי כן, זה מאפשר מספיק זמן כדי לבצע ניסויי הפרשת פפטיד בטן (בדרך כלל מתבצע מעל 2 h, 18-24 ציפוי פוסט h) כדי לבדוק גירויים פיסיולוגיים ו / או סוכנים תרופתיים. ניסויים הדורשים דגירה לילה לפני הניסוי הפרשה גם למשל ריאליבמקרה של טיפול מקדים עם רעלן השעלת 15. טכניקת התרבות העיקרית המוצגת כאן היא שיטה מבוססת היטב, כפי שמעיד היקף תפוקת מחקר זה פיק לאורך השנים. מודל התרבות העיקרי נעשה שימוש כדי ללמוד את הפרשת מגוון של פפטידים בטן, כולל GLP-1 1, GIP 18 ו PYY 19, בתגובה המזינה מגוון ולא מזין 14, 20 גירויים ומעכבים. יתר על כן, באותה הטכניקה יושמה בהצלחה לתרבות של תאים אנושיים מעיים 21. לעתים קרובות, שילוב של שיטת תרבית תאים ראשונית יחד עם למשל מודל ניסיוני נוסף. vivo לשעבר או in vivo יכול לספק את רוב תובנה 6. יש לציין, ובניגוד לשיטות אחרות, הטכניקה הזו יש imיישומים הנסב מעבר למדידה של שחרור פפטיד המעיים. הוכחנו כי תרבויות מעי דק עיקריות נגזרו עכברי כתב מהונדסים הם כלים רבים עצמה עבור החקירה של מסלולי איתות תאיים המצמידים בבטן הפרשת פפטיד, באמצעות למשל Ca 2+ וחיישנים מחנים, 11 GCaMP3, 13 ו Epac2camps 14, בהתאמה, כמו גם טכניקות אלקטרו 12. כמו בכל הדגמים במבחנה, תרבויות המעיים העיקריות יש מגבלות מובנות מסוימות, לרבות אובדן הקוטביות של תאי האפיתל בתרבות, כמו גם האובדן של היצע עצבוב דם. קשה לאמוד את ההשפעות האפשריות של תנאים מלאכותיים אלה על תפקוד התא enteroendocrine. עם זאת, נתונים המתקבלים מתרבויות עיקריות עמדו פעמים רבות לתרגום ב in vivo settiננוגרם (למשל ההשפעות של חומצות שומן קצרות שרשרת על GLP-1 הפרשת 15). תרבויות המעיים העיקריות הן טכניקה תכליתית עם יישומים פוטנציאליים רבים. הם כבר סיפקו תובנות מכניסטית חשוב אל תקנה של הפרשת פפטיד המעיים.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי מעי בעכברים מעורב תרבות כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא חי של תאי enteroendocrine. גרסה מוקדמת של הליך זה פורסם במקור ב- 2008 על ידי ריימן ואח. 1 ומאז היווה את הבסיס של 20 פרסומים נוספים מהקבוצה שלנו. עבור כתב היד הזה, בחרנו להתמקד תרבויות מעי דק כפי שהם יותר מאתגרים להקים מ תרבויות גסות. תאים Enteroendocrine להפריש מערך של פפטידים הבטן כולל פפטיד גלוקגון דמוי 1 (GLP-1), גלוקוז-תלויים insulinotropic פפטיד (GIP), כולציסטוקינין (CCK) ו פפטיד YY (PYY) 2. יש פפטידים המעיים אלו תפקידים פיזיולוגיים חשובים ובארגון התגובות postprandial כגון האטת המעבר במעי, הגברה של שחרור אינסולין מגורה הגלוקוז אינדוקציה של שובע. GLP-1 mimeticsnd תרופות אשר מעכבים השפלה שלה מורשים כיום לטיפול בסוכרת מסוג 2 קיימת הערכה מתמשכת של הפוטנציאל הטיפולי של המרצת הפרשת אנדוגניים של פפטיד זה 3. הבנה טובה יותר של פיזיולוגית enteroendocrine ואת המנגנונים שבאמצעותם הפרשה או מגורה או עכבות הן, אפוא, חשיבות קריטית. גוט הפרשת פפטיד ניתן ללמוד באמצעות מגוון של במבחנה לשעבר vivo מודלים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות (לסקירה מקיפה האחרונות גם מכסה את השימוש במודלים vivo לראות סוונדסן et al. 4). Ex vivo טכניקות כגון לתאי Ussing המעי 5 ו perfused המבודד 6 כרגע בשימוש לחקור הפרשת פפטיד בטן בתגובה לחומרים שונים. היתרון העיקרי של שיטות אלה, כמולעומת תרבויות עיקריות, הוא שהסביבה המיידית של תאי enteroendocrine נותרת שלמה ברובו וחשובה, את הקוטביות של התאים נשמרה. לכן, אפשר לשאוב מידע לגביהם תא משטח secretagogue פועל 6. עם זאת, אלה הם בדרך כלל טכניקות נמוכה התפוקה ואיכות הנתונים הנגזרים מהם מסתמכת במידה רבה על היושרה ואת הכדאיות של רקמת המעי, אשר בהכרח ירידה לאורך זמן. Organoids מעיים כיום יותר ויותר בשימוש כמודלים חוץ גופית לחקר תפקוד התא enteroendocrine ופיתוח 7. Organoids, אשר יכול לנבוע הוא בעכברים ורקמות אדם, יש את היתרון של יצירת &quot;דמוית הקריפטה&quot; 3D מבנים המקיימים קוטבי בתא בתרבות. עם זאת, תאי enteroendocrine organoid הנגזרת טרם לאפיין באופן מלא דמיונם cel L מקורהls נשאר ברובו לא ידוע. יש תרבויות ראשיות היתרון של להיות צעד אחד קרוב יותר את ההגדרה הפיזיולוגית, כמו תאי enteroendocrine אינם מתוחזקים בדיל בתנאים מלאכותיים לתקופות זמן ממושכות. שיטת תרבות העיקרית חלופה אשר הועסקה על ההערכה של הפרשת פפטיד בטן היא הבידוד של תאים במעי עכברוש עוברי (FRICs) 8. עם זאת, התרבות של רקמת מעי מבוגרת זוכה להצלחה פחות כמה הבדלים נצפו על היענות FRICs לעומת תאי מעי בעכברים בוגרים (למשל גלוקוז 8). Enteroendocrine דמוי קווים סלולריים (למשל GLUTag, STC-1 ו- NCI-H716) שימשו באופן מסורתי להבחין vs ישיר. השפעות עקיפות על תאי enteroendocrine ולבתר מנגנונים מולקולריים שבבסיס צימוד גירוי ההפרשה; לראות Kuhre ואח </em&gt;. 9 לייצור והפרשת פפטיד ידי שורות תאי &quot;L תא דמוי&quot; הונצחו. זה כבר צורך כתאי enteroendocrine, הפזורים לאורך מערכת העיכול, מהווים רק תחת 1% של תאי האפיתל במעי 10 ו תאים ממוינים, בידיים שלנו, אינם שורדים בתרבות 1. קווים סלולריים להישאר כלים שימושיים בשל העובדה כי הם אוכלוסייה הומוגנית בעיקרה תא שבו היא תורמת מניפולציות גנטיות כגון-להשתקת גנים. כתוצאה מכך, קל לחקור את התפקיד של חלבונים אשר לא יכול להיות ממוקד פרמקולוגית, כאשר עכברים מהונדסים אינם זמינים. עם זאת, שורות תאים אינן מודלים תמיד תקפים של תאים ראשוניים. אמנם יש קווי דמיון רבים, ממצאים מתרבויות ראשיות בהזדמנות הדגישו הבדלי מסלולי האיתות מופעלים על ידי חומרים מזינים מסוימים בתאי L העיקריים לעומת תאי GLUTag, למשל (למשל. Peptones &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 11). באופן מכריע, בשילוב עם עכברי כתב ניאון מהונדסים, מודל התרבות העיקרי מאפשר בחינה מפורטת של תאי enteroendocrine העיקרי בודדים ברמת תאיים. Fluorescently- מתויגים בתאי L בתוך תרבויות עיקריות כבר בשימוש על ידי הקבוצה שלנו עבור תיקון clamping 1, 12 מחקרים, וסידן תא בודד 11, 13 ו הדמית monophosphate סריג אדנוזין מחזורי 14 מחקרים, אשר הניבו התקדמות משמעותית בתחום enteroendocrine פִיסִיוֹלוֹגִיָה. הפרוטוקול הבא מותאם לביצוע ניסויי הפרשה, באמצעות צלחת 24-היטב או לעריכה של עד 16 מנות הדמיה, מן קטע 10 סנטימטרים של המעי הדק בין עכבר מבוגר יחיד. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לחקר תאי המעי הגס על ידי הגדלת פעמים עיכול ושיתוףריכוז llagenase.

<table><tbody><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>לניסויי הפרשה</td></tr><tr><td>בומבסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4272</td><td>בקרה חיובית (ניסוי הדמיית סידן)</td></tr> <tr><td>צינורות צנטריפוגה, 15 מ"ל,</td><td>סטרילי גריינר ביו-וואן</td><td>188261</td><td>להכנה / עיכול</td></tr><tr><td>רקמות צינורות צנטריפוגה, 50 מ"ל,</td><td>קורנינג סטרילי&nbsp;</td><td>430828</td><td>להכנה/עיכול רקמות</td></tr><tr><td>קולגנאז XI (גולמי)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C9407</td><td>לאיפור עיכול</td></tr><tr><td>בינוני מראה דיכרואית</td><td>מחקר Cairn-לניסויי</td><td></td> <td>הדמיה</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה (4500 מ"ג)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6546</td><td>להמסת מטריג'ל (שמור על 4 מעלות; ג). להשלמת מדיום עיכול, יש לחמם מראש ל -37 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מסנן פליטה (רוחב פס 510-560 ננומטר)</td><td>Cairn</td><td></td> <td>Research-לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>לאיפור תרבית מדיום</td></tr><tr><td>מלקחיים/פינצטה</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>לדיסקציה/הסרה של המעי</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>בקרה חיובית (ניסוי הפרשה)</td></tr><tr><td>כלים עם תחתית זכוכית (35 מ"מ)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>פינצטה דיוק גבוה (110 מ"מ)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>להסרת שכבת שריר</td></tr><tr><td>מצלמת CCD דיגיטלית ברזולוציה גבוהה</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>בקרה חיובית (ניסוי הפרשה)</td></tr><tr><td>L-15 בינוני (לייבוביץ)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' L1518</td><td>לאיסוף רקמות, שמור על קרח</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513</td><td>לאיפור תרבית</td></tr><tr><td>מדיום מטריגל&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>354234</td><td>מטריצת ממברנת מרתף, לציפוי צלחות וכלים</td></tr><tr><td>MetaFluor&nbsp;</td><td>התקנים מולקולריים (מסופקים על ידי Cairn Research)</td><td>-</td><td>תוכנת הדמיה ביחס פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>עכברים (C57BL6)</td><td>מעבדות נהר צ'ארלס</td><td>C57BL/6J</td><td>עכברי רקע המשמשים לגידול. יכול לשמש גם לניסויי הפרשה</td></tr><tr><td>עכברים (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td> <td>בבית</td> <td>-</td> <td>לניסויי הדמיה והפרשה של סידן</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>לפוטומיקרוגרף של תרביות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td>IX71</td><td>מיקרוסקופ הפוך עם מטרת שמן פי 40 המשמש לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>מונוכרומטור</td><td>Cairn</td><td></td> <td>Research-לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר מעבדות</td><td>אלפא</td><td>LW4234</td><td>לניקוי רקמות</td></tr><tr><td>PBS המכיל Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>לשטיפת רקמות, שמור על קרח</td></tr><tr><td>פניצילין & סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0781</td><td>לאיפור תרבית בינונית</td></tr><tr><td>צלחות פטרי (100 מ"מ על 20 מ"מ)</td><td>קורנינג</td><td>CLS430167</td><td>לניקוי רקמות והסרת שכבת</td></tr><tr><td>שריר אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P/4280/53</td><td>בקרה חיובית (ניסוי הדמיית סידן)</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>לדיסקציה/הסרת מעי</td></tr><tr><td>מסננת תאים סטריליים 100 ומיקרו; m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363549</td><td>לסינון תרחיף תאי קריפטה לפני ציפוי</td></tr><tr><td>להב אזמל כירורגי מס' 22 (סטרילי, אל חלד)</td> <td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>לחיתוך</td></tr><tr><td>מסנני מזרק רקמות, Minisart NML (0.2 & micro; m גודל נקבוביות)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>לתמיסת קולגנאז מעקרת מסנן (מדיום עיכול)</td></tr><tr><td>מזרקים, 20 מ"ל, חד פעמי, סטרילי, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>לתמיסת קולגנאז מעקרת מסנן (מדיום עיכול)</td></tr><tr><td>מנורת קשת קסנון 75W</td><td>Cairn</td><td></td> <td>Research-לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>מעכב ROCK, הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"מ במים סטריליים (השתמשו ב-1:1,000 במדיום התרבית הסופי)</td></tr></tbody></table>

תרבויות עיקריות מעורבות של murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי enteroendocrine

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

המעי הוא האיבר האנדוקרינית הגדול ביותר בגוף, עם תאים enteroendocrine מפרישי ההורמון ממוקמים לאורכה של האפיתל של הקיבה והמעיים. למרות החשיבות הפיזיולוגית שלהם, תאי enteroendocrine מייצגים רק חלק קטן של אוכלוסיית התא האפיתל ובעבר, אפיונם הציג אתגר משמעותי וכתוצאה מכך הסתמכות על מודלי קו התא. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הבידוד וההתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות העיקריות אלה שמשו לזיהוי מסלולי האיתות שבבסיס הגירוי והעיכוב של הפרשת פפטיד בטן בתגובת מספר החומרים מזינים נוירופפטידים כמו גם סוכנים תרופתיים. יתר על כן, בשילוב עם שימוש עכברי כתב ניאון מהונדסים, הוכחנו כי התרבויות העיקריות אלה הופכים כלי רב עצמה עבור הבדיקה של תאי enteroendocrine fluorescently-tagged בבית ברמת tracellular, באמצעות שיטות כגון הידוק תיקון וסידן תא בודד הדמית cAMP-סריג.

שימוש צעדי עיכול סדרו מאפשר האיסוף של הכנה יחסית נקיה של שברי הקריפטה להיות מצופה לניסויים. שני מעכל תחילה להסיר תאים בודדים בעיקר ופסולת תא מהחומר לעכל (איור 1A). במהלך Digest השלישי, שברי הקריפטה מופיעים חומר מתעכל (איור 1B). מעכל תשואה 4 ו 5 מספר גדול יותר של שברי הקריפטה עם תאים בודדים פחות (איור 1C). סינון החומר אסף מעכל 3-5 מסיר חתיכות גדולות של רקמה מעוכלת, שעלולה להזיק לתרבות, הפקת הכנת שבר הקריפטה נקיה (1D איור). בעקבות 18-24 שעות של תרבות, monolayers של תאי מעי דק עיקריים הם נצפו (איור 2 א). שימוש בתרביות המופקות עכברים טרנסגניים המבטאות את קאל במיוחדחיישן פלורסנט cium, GCaMP3, תחת שליטה של האמרגן proglucagon 11, תאי L שניתן לזהותם בקלות משובצים בתוך התרבות (איור 2B). בתרבויות מעי דק עיקריות, תרכובות מיקוד G q -Ca 2+ אני וקמפ אני תלויות מסלולים מגורים את הפרשת GLP-1 (עבור מתודולוגיה ניסוי הפרשה לראות ריימן et al. 1). Bombesin (BBS, 100 ננומטר) ושיתוף יישום של forskolin ו 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 מיקרומטר אחד) עורר 2 ו 11-לקפל, גירוי של GLP-1 שחרור ביחס הבסיס, בהתאמה (איור 2C). ביטוי תא L ספציפי של GCaMP3 מאפשר זיהוי של וניטור בזמן אמת של גיוס סידן בתאי L פרט. שני 100 ננומטר bombesin (BBS) ו אשלגן כלורי 30 מ&quot;מ (KCl) מגורה עלייה זמנית סידן תאיים מעיד על q G ידוע &lt;תת /&gt; - ומסלולי electrogenic מצמיד בתאי L העיקריים (2D איור). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> איור 2: נציג נתונים שמקורם בתרבויות מעי דק עיקריות. תמונות דוגמא של תרבויות מעי דק עיקריות מעורבות משמשות (א) הפרשה ו (ב) ניסויי הדמיה לפרסם 24 ציפוי h. תמונה (א) שנלקחה צלחת 24-היטב, באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הפוך עם מטרת 4X. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (ב) שימוש Glu-Cre x עכברים ROSA26 GCamP3, תאי L בתוך שדה הראייה (תאים ירוקים) זוהו על ידי הקרינה של GCaMP3. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. (ג) הפרשת GLP-1 נמדדה בתגובה bombesin (BBS, 100 ננומטר) forskolin / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 מיקרומטר אחד). הפרשת GLP-1 אחוז חושבהעל ידי מדידת רמות GLP-1 ב supernatants ו lysates תא. הנתונים מייצגים את אמצעי ± SEM של n = 3 עבור כל תנאי. (ד) הקרינה GCaMP3 (המשקף סידן cytosolic) של שני תאים שהותוו (B) במעקב בזמן אמת בתגובה אשלגן כלורי (KCl, 30 מ&quot;מ) ו BBS (100 ננומטר). הדמית תא יחידה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מטרת נפט טבילת 40X. GCaMP3 הסעירה ננומטר 475/10, באמצעות מנורת קשת קסנון 75 W ו monochromator בשליטת התוכנה דימות פלואורסצנטי. פליטה נרשמת עם מצלמה למכשיר תשלום מצמידים דיגיטלית ברזולוציה גבוהה (CCD) באמצעות מראה dichroic ומסנן רוחב פס 510-560 ננומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד ולתרבית תאי מעי עכבריים מעורבים כדי לאפשר את חקר הפרשת פפטידים מהמעי ודימוי של תאים חיים של תאי אנטרואנדוקריניים. פיתחנו במקור שיטה זו כדי לאפשר אפיון in vitro של תאים אנטרואנדוקריניים. תאים אנטרואנדוקריניים מנטרים את תוכן המעי ומווסתים את ההומאוסטזיס של הגוף.אך היה קשה לחקור אותם מכיוון שהם מפוזרים ברחבי האפיתל המעי. התרביות המתאימות המתוארות כאן שימושיות במיוחד כאשר הן משולבות עם סימון פלואורסצנטי גנטי של תאי אנטרואנדוקרין, שכן הדבר מאפשר שימוש בטכניקות של אלקטרופיזיולוגיה של תא בודד ודימוי תאים חיים. את הפרוצדורה תדגים שריל ברייטון, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלנו.בתחילה, העבירו תריסריים (duodenum) מבודד של עכבר לצלחית פטרי בקוטר 10 סנטימטרים מלאה ב-PBS. בעזרת פינצטה, אחזו בזהירות בקצה אחד של מקטע המעי, והחדירו את קצהו של פיפט פסטור אל תוך הלומן שלו. לאחר מכן, שטפו את תכני המעי בעזרת PBS קר.חזור על הפעולה עבור שני קצוות המעי עד להסרה של רוב התוכן. העבר את המעי השטוף לצלחת פטרי נקייה מלאה ב-PBS קר וטרי. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר רקמות שומן וקרומי מזוזה (mesentery) מקטע המעי, תוך מניעת קילוף של שכבת השריר.בשלב הבא, זהו לשונית של שכבת השריר בקצה הפרוקסימלי של הרקמה. לאחר מכן, באמצעות שתי מערכות של פינצטות עדינות, משוך בעדינות כמות קטנה מהשכבה מסביב למעי כולו. אחז את המעי ואת מרבית לשונית השריר ככל האפשר, ואז הפר בעדינות את השכבות והתחל לקלף את שכבת השריר מהמעי.החזיקו את הפינצטות קרוב זו לזו, כדי למנוע קריעה של שכבת השריר והאפיתל. הסירו את שכבת השריר לאורך כל חלק המעי. לאחר מכן, פתחו את המעי על ידי חיתוך לאורכו, והעבירו אותו לצלוחית פטרי נקייה המכילה PBS מקורר וטרי.יש לנער את הרקמה כדי לשטוף ממנה שאריות של כימוס או ריר. לאחר השטיפה, חתכו את הרקמה בעזרת להב סכין כירורגית כדי לקבל ריבועים בשטח של כ-1 עד 2 מילימטרים רבועים. לאחר מכן, באמצעות פיפטת פסטור שהורטבה מראש עם קצה חתוך, העבירו את השברים שהתקבלו למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר המלאה בכ-20 מיליליטר של PBS קר.נערה בעדינות את המבחנה כדי לשטוף שוב את שברי הרקמה, והמתינו עד לשקיעת הרקמה. לאחר שהרקמה שקעה, שאבו את רוב ה-PBS ושטפו את הדגימה עם PBS רענן פעם אחת נוספת. כדי לעי껄 את המעי, השתמשו בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להעביר את שברי הרקמה למבחנת צנטריפוגה סטרילית של 50 מיליליטר, המכילה DMEM סטרילי קר, סובבו את התמיה, המתינו לשקיעת הרקמה, ולאחר מכן הסירו את המצע.הוסיפו 7 מיליליטר של מצע העיכול למקטעי הרקמה וסובבו את התהודה. הדגרירו את התהודה במקלח מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש דקות. לאחר ההדגירה, נערו בעדינות את המבחנה למשך כשלוש שניות.שקעו את הרקמה שלא התעכלה, והעבירו את מצע העיכול לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר. המתינו עד שכל רקמה שנאספה בטעות תשקע, ובאמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, העבירו אותה בחזרה למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר המכילה את הרקמה שלא התעכלה. שמרו נפח קטן של מצע העיכול לצורך תצפית מיקרוסקופית והשליכו את השאריות.עקוב אחר תכולת מדיום העיכול תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהסספנסיה אינה מכילה קריפטים רבים. לאחר מכן, הוסף 7 milliliters של מדיום עיכול טרי, ובצע את הליך העיכול פעם אחת נוספת. כדי להכין סספנסיה של פרגמנטים של קריפטים, הוסף 7 milliliters של מדיום עיכול טרי לפרגמנטים של המעי.דגרו את הרקמה במקלחת מים בטמפרטורה של 37 °C למשך עשר דקות. הפעם, נערו את הדגימה למשך זמן ארוך יותר ובצורה נמרצת יותר, מדי חמש דקות. שקעו את הרקמה שלא התעכלה, והעבירו את תווך העיכול לפרופיל צנטריפוגה של 15 mL.אפשרו לכל רקמה שנאספה בטעות לשקוע, ובאמצעות פיפט סרולוגי של 10 milliliter, העבירו אותה חזרה לשפופרת הצנטריפוגה של 50 milliliter המכילה את הרקמה שלא עברה עיכול. הוסיפו 7 milliliters של תמיסת עיכול רעננה למקטעי המעי, והתחילו את העיכול הבא. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה את התווך שנאסף מהעיכול הקודם ב-100 x g בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השביה מחדש את משקע התאים ב-5 milliliters של מצע גידול שחומם מראש, באמצעות פיפוט עדין. לאחר מכן, הset בצד את הדגימה ואסוף מנה (aliquot) קטנה של תרחיף התאים. תחת מיקרוסקופ אור, ודא שהדגימה מכילה מקטעי קריפטה (crypt fragments) מבודדים.חזור על עיכול הרקמה 2-3 פעמים נוספות או עד שרוב הרקמה תעוכלה. לאחר איסוף העל-מישובים (supernatants) של העיכול, חבר את כולם וסבב את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 100x g בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. השלך את העל-מישוב, וסבב מחדש את המשקע על ידי פיפוט עדין, עד שלא יראו גושים, לתוך 5 milliliters של מצע גידול שחומם מראש ותוממי ב-10 micromolar של Y-27632, המונע anoikis.לבסוף, סננו את תרחיף התאים דרך מסנן של 100 micron כדי להסיר שאריות של רקמה שלא התפרקה. שטפו את המסנן עם 2 milliliters נוספים של מצע תרבית שחומם מראש ותוממי ב-Y-27632. לפני זריעת התאים, הוציאו מהאינקובטור את הפלטה המצופה במטריצת קרומים בסיסיים (basement membrane matrix).הסיר את תמיסת מטריצת קרומי הבסיס העודפת מהפלטה, והוסף 250 µL של מצע גידול שחומם מראש ותומת ב-10 µM Y-27632 לכל באר. זרע 250 µL של תרחיף תאים לכל באר בפלטה בעלת 24 בארות, באמצעות פיפטינג בטיפות שבוצע בתנועת זיג-זג איטית. הדגר את הפלטה למשך לילה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide.מוצגות כאן תמונות מיקרוסקופיות של שכבות יחיד של תאי מעי דק ראשוניים, שצולמו לאחר 18 עד 24 שעות של תרבית. תאי מעי דק ראשוניים שגודלו in vitro הגיבו לגירויים המעלים את רמות הסידן התוך-תאי או את ה-cyclic AMP, מה שהוביל לעלייה של פי שניים בשחרור glucagon-like peptide-1 כאשר התאים טופלו ב-bombesin, ולהגברה של ההפרשה פי אחת-עשרה כאשר הם גורו בו-זמנית עם forskolin ו-IBMX. לבסוף, באמצעות תרביות שהופקו מעכברים טרנסגניים המבטאים GCAMP 3 תחת בקרתו של מקדם pro-glucagon, הוכח כי תאי L ראשוניים של המעי הדק מגיבים לגירוי באמצעות bombesin וקלייד פוטסיום בעלייה של הסידן הציטוזולי, כפי שהודגם על ידי הגברת הפלואורסצנציה.ההליך המודגם מתמקד בתרביות של תאי מעי דק, דבר שחוקרים רבים מצאו כאתגר. אנו משתמשים בשיטה מעשית דומה גם לתרביות של מקטעי מעי אחרים, ממקור עכברי ואנושי כאחד. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בארבע שעות, אם היא מבוצעת כהלכה.אין שתי הכנות זהות, לכן חשוב לזכור לבחון אליקוט של כל עיכול תחת המיקרוסקופ. פעולה זו מאפשרת להעריך את התקדמות התהליך ולהתאים בהתאם את עוצמת הניעור ואת מספר העיכולים.

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה ולהציג את הווידאו הנלווה הפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי בעכבר, באמצעות גישת organoid יחידות על פיגום.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

טכנולוגיית הדמיה משופרת מאפשרת הדמיה תלת מימדית של איברים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים מערכת תרבית איברים שלמה המאפשרת הדמיה חיה של הווילי המתפתח במעי העכבר העוברי.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

תאים Enterochromaffin (EC) מהווים תת קבוצה קטנה של מערכת העיכול תאים אפיתל. תאים EC חשמלית טמפרמנט, לשחרר סרוטונין, אך קשיים culturing זיהוי תאים EC מוגבלת מחקרים פיזיולוגיים. השיטה המוצגת כאן יוצר מודל תרבות ראשי לבצע בדיקה של תאים בודדים EC מאת אלקטרופיזיולוגיה.

אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

כאן, אנו מציגים מודל פיזיולוגיים ועוצמתי כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת הבטן, הספיגה במעיים – המעי הדק מבודד עכברוש perfused.

המנגנונים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת הבטן באמצעות מבודד את Perfused המעי הדק עכברוש

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

למד שיטה לבידוד וגידול תרביות עיקריות מעורבות של תאי מעי דק ממקור מורין לחקר הפרשת הורמוני מעי ודימוי תאי Enteroendocrine בחיים.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

גלה סרטונים נוספים