Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך בו זמנית אתרי זרחון פוטנציאליים מרובים ולזהות אתרים לאימות לאחר מכן על ידי מוטציות באתר זרחון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביוכימיה וביולוגיה של התא לגבי תפקידם של שינויים לאחר תרגום באיתות תאי. טכניקה זו מאפשרת סינון ראשוני קל וידידותי לתקציב עבור אתרי זרחון והחלבון המעניין.

ההשלכה של טכניקה זו התרחבה לאבחון וטיפול במחלות כולל דלקת וסרטן מכיוון שזרחון הוא אירוע ביוכימי חשוב במסלולי איתות במחלות אנושיות. מי שיסייע להדגמה יהיה סול-בי שין, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, שבזמן הביצוע ניהל מוטגנזה באתר. ראשית שלב 50 ננוגרם של הפלזמה pGEX JST NRF2, 125 ננוגרם של פריימר קדמי, 125 ננוגרם של פריימר הפוך, מיקרוליטר אחד של תערובת DNTP 2.5 יחידות של PFU DNA פולימראז ומאגר תגובה פי 10 על קרח.

הוסף מים מזוקקים סטריליים כדי להביא את הנפח ל-50 מיקרוליטר. בצע PCR כדי לשלב את הגדיל המוטנטי ולאחר מכן קרר את הדגימה על קרח למשך שתי דקות. הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת DPNI לדגימה שהתקררה.

מערבבים את הדגימה עם פיפטינג עדין ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה למשך דקה אחת ב-13,000 פעמים G.דגירה של הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לעכל את ה-DNA הדו-גדילי של ההורים. לאחר מכן השליכו תאי E.coli סופר-מוכשרים עם מוטציות endA1 ו-RACA1 על קרח. מוסיפים 50 מיקרוליטר מתערובת התגובה לתאים המצוננים ודוגרים על קרח למשך 30 דקות.

בינתיים, מחממים גוש חימום ל -42 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הדגירה, מחממים את התערובת בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות ולאחר מכן מצננים את התערובת על קרח למשך שתי דקות. הוסף מרק ליזוגני שחומם מראש לתאים שעברו טרנספורמציה.

דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה תוך ניעור ב-180 סל"ד. לאחר מכן מורחים את התאים על צלחות אגר LB אמפיצילין ודוגרים על הלוחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים מושבה אחת לחמישה מיליליטר מרק ליזוגני עם אמפיצילין.

דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות ב-180 סל"ד. חלץ את ה-DNA של הדגימה באמצעות ערכת הכנה מיני סטנדרטית לניתוח רצף DNA. הפעל לפחות 200 ננוגרם של מבנה HDNA במנתח DNA כדי לאמת את רצף המוטנטים.

בטא וטהר את חלבון ה-NRF2 המוטנטי המאומת. קבע את כמות ה-NRF2 המוטנטי המיוצר לפני שתמשיך בבדיקת הקינאז. כדי להתחיל בבדיקת תחרות הפפטידים, הכינו תמיסת חיץ קינאז 5X עם ריכוז אדנוזין מונופוספט של 500 מיקרומולר.

לאחר מכן יש להפשיר דגימות קפואות של NRF2 אנושי מסוג AMPK ושלושה אוליוגופפטידים המחקים את אתרי הזרחן של AMPK של NRF2. עבור כל פפטיד, בזמן שאתה על קרח, שלב 0.43 מיליגרם של הפפטיד עם 0.15 מיקרוגרם של AMPK, 0.4 מיקרוגרם של NRF2 ושישה מיקרוליטר של 5X Kinase Buffer. הוסף מים מזוקקים סטריליים כדי להגיע לנפח סופי של 30 מיקרוליטר.

ואז באזור מוגן, הגדר גוש חימום ל -30 מעלות צלזיוס. הוסף מיקרוקורי אחד של גמא 32P ATP לכל צינור, ערבב כל תמיסה ביסודיות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דגרו את תערובות התגובה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות.

במהלך הדגירה יש להכין ג'ל 7.5% STS PAGE. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטר של מאגר דגימת STS 10X לכל צינור וערבב היטב כדי לעצור את תגובת הקינאז. הפעל את הדגימות בג'ל בחום של 70 וולט למשך 20 דקות ולאחר מכן ב -140 וולט למשך שעה.

עם השלמת האלקטרופורזה של הג'ל, הסר בזהירות את הג'ל הרדיואקטיבי מאוד מתחת לקו הכחול של הברומופנול. העבירו בעדינות את הג'ל מהגלגלת לצינור זכוכית. תקן את הג'ל בתמיסה של 50% מתנול, 40% מים וחומצה אצטית 10% למשך 20 דקות.

לאחר מכן הניחו בעדינות את הג'ל על נייר פילטר וכסו אותו בניילון שקוף. יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום למשך שעה בחום של 80 מעלות צלזיוס. חשוף את הג'ל היבש למסך זרחן או לסרט רנטגן למשך כ-16 שעות למשך יומיים בהתאמה.

השתמש ב-Phosphorimager כדי ליצור קובץ TIFF או Bitmap ברזולוציה גבוהה של המסך. כדי להתחיל בבדיקת פעילות AMPK יש להפשיר דגימות של AMPK ושל מוטציה וסוג פרא GST NRF2 על קרח. שלב 0.4 מיקרוגרם של GST NRF2 מוטנטי עם 0.15 מיקרוגרם של AMPK ושישה מיקרוליטר של 5X Kinase buffer.

הוסף מים מזוקקים סטריליים כדי להביא את הנפח ל-30 מיקרוליטר. הכינו תערובת תגובה נוספת בדרך זו עם 0.4 מיקרוגרם של GST NRF2 מסוג בר. הוסף מיקרוקורי אחד של גמא 32P ATP לכל בקבוקון תגובה.

פיפטה את התערובות למעלה ולמטה מספר פעמים ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה את התערובות. דגרו את התערובות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באזור מוגן ולאחר מכן סיימו את תגובת הקינאז עם שלושה מיקרוליטרים של מאגר דגימת STS 10X. הפעל את STS PAGE, תקן את הג'ל וייבש את הג'ל באותם תנאים כמו בדיקת הקינאז התחרותית.

חשוף את הג'ל למסך זרחן למשך הלילה וסרוק את המסך עם ה-Phosphorimager. בדיקת AMPK במבחנה בוצעה בנוכחות שלושה 10 שאריות אוליגופפטידים המחקים אתרי זרחון AMPK ב-NRF2 אנושי. האוליגופפטיד המחקה את אתר Serine 558 הציע את התחרות הגדולה ביותר לזרחון AMPK.

מוטציה של NRF2 שהחליפה את סרין 558 באלנין סונתזה והוערכה במבחן פעילות במבחנה. מעט מאוד זרחון AMPK של מוטציה S558 A נצפתה המצביעה על כך ש-AMPK מזרחן ישירות את NRF2 האנושי בסרין 558. מכיוון שפפטידים נקשרים באופן תחרותי לחלבונים, ניתן ליישם את העיקרון של שיטה זו גם לזיהוי תרגום ושינויים אחרים כגון אצטיליזציה ושאריות ליזין ואינטראקציות חלבון חלבון.

אל תשכח שעבודה עם איזוטופ רדיו יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש לעבור הדרכות בטיחות רדיו איזוטופים לפני ביצוע הליך זה.