Name: Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: חקור שיטת מעבדה לזיהוי אתרי זרחון ספציפיים באמצעות מבחן תחרות אוליגופפטידים. טכניקה זו מאפשרת סינון מקדים יעיל במחקר ביוכימיה וביולוגיה תאית לחקר מחלות כמו סרטן ודלקת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (מס &#39;2015R1A2A1A10052663 ו No. 2014M1A3A3A02034698).

<ol><li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK%3A+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li>
<li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li>
<li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li>
<li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li>
<li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li>
<li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%3A+myths%2C+facts%2C+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li>
<li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites%3A+a+quick+guide+for+cell+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li>
<li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li>
<li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half-lives+of+some+radioactive+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365(1951).</li>
<li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li>
<li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כדרך פשוטה ונוחה להעריך את האותנטיות של אתרי זרחון חזוי בתיווך AMPK, כאן אנו מתארים assay קינאז במבחנה שניתן להשתמש בהם כדי לגלות אתר זרחן ספציפי באמצעות פפטידים תחרותיים כדי לאמת אותו באמצעות מוטציה אתר ספציפי . הנתונים המייצגים המתקבלים מתוך מבחנה פעילות מבחנה AMPK תחרותי תואם את התוצאות של assay באמצעות חלבון מוטציה האתר מכוונת, המציין כי assay התחרות פפטיד הוא כלי שימושי לקביעת אתר זרחון. שיטה זו שימשה גם במחקר זיהוי אתר ספציפי phosphorylated ידי PKC...

חלבון זרחן ב שאריות מסוים ממלא תפקיד משמעותי במגוון רחב של תהליכים תאיים. לפיכך, הבנה של רשתות איתות דורשת זיהוי של אתרי זרחן ספציפיים. בנוסף, האתר זרחן קובע את ההשפעה על תפקוד החלבון, כי תחומים בודדים בתוך חלבון יש מבנים שונים פונקציות. פעילות הגורם הגרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2), גורם נוגד חמצון מפתח, הוא מוסדר דו כיווני באמצעות זרחון באתרים שונים. המחקרים שלנו התמקדו קינאזות כי לזרז את זרחון של Nrf2. תגובת הלחץ של Nrf2 נגד אתגר חמצוני מתרחשת במהירות, בעיקר באמצעות זרחון ב serine 40 ו מתווכת על ידי חלבון קינאז C (PKC) -δ, אשר מפעיל Nrf2 3 , 4 . לעומת זאת, Fyn מזרז את זרחון מעכב של Nrf2 ב tyrosine 5עבור פיקוח הדוק על הפעילות. השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לגלות אתרי זרחון הוא כרומטוגרפיה נוזלית / ספקטרומטריית מסה (LC / MS) ניתוח. מהיר וזמן רגיש זרחון באתר מיפוי נתונים ניתן להפיק בדרך זו; עם זאת, יש כמה מגבלות טכניות, לעתים קרובות יצירת אותות מזויפים שלילי. כיסוי רצף גרוע לעתים קרובות מתרחשת ניתוח LC / MS. כדי לזהות אתרי זרחון, מידע על כיסוי מקסימלי של חומצות אמינו של חלבון נדרש 6 . פרוטאוליזה של חלבון של עניין עם מספר פרוטאזות במהלך הצעד העיכול עשוי להיות לעזור בשיפור רצף הכיסוי. מכשול נוסף לזיהוי שאריות זרחון הוא אובדן של חומצה זרחתית כי הוא נצפה לעתים קרובות עבור serine ו threonine-phosphideslated פפטידים 6 , 7 . זרחן פוספט moieties הם לעתים קרובותשוחרר מ phosphopeptides במהלך תהליך הפיצול 7 . האפשרות השנייה בעת חיפוש אתרי זרחון היא באמצעות שיטת microarray פפטיד. ניתן לבדוק את אתרי היעד kinase באמצעות שבב microarray המכיל שברי פפטיד נגזר חלבון של עניין. עם זאת, בשל הדרישה הציוד לייצור וזיהוי שבב microarray, שיטת microarray פפטיד נחשב זמן רב ויקר. כדי להתגבר על אתגרים אלה, במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז יכול לשמש קינאז חלבון עם מוטיבים הכרה ידוע. אם מוטיב ההכרה של קונצנזוס של קינאז הוא הקימה, אתרי זרחון putative של המצע המועמד ניתן לחזות, ואת האותנטיות של האתרים ניתן לאמת. השיטה המשכנעת ביותר עבור הליך זה היא להראות את הביטול של זרחון בחלבון מוטנטי שבו תחזיתD שאריות מוחלפת בחומצת אמינו שאינה phosphorylatable ( כלומר, serine או threonine כדי alanine, tyrosine כדי פנילאלנין). עם זאת, ייצור ובידוד של חלבונים מוטנטים הוא זמן רב. כחלופה בשלב הראשוני של המחקר, assay פפטיד קינאז תחרותי הוא פשוט ונוח. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור assay מבחנה במבחנה פפטיד ו עבור אימות של אתר זרחון.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי</td><td></td> קוקטייל מעכב פרוטאז 450243 <td></td></tr><tr><td></td><td>Calbiochem, נוטינגהאם, בריטניה</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, אגם Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, טאיפיי סיטי, טייוואן</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>EZblue ריאגנט צביעה</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu טורבו DNA פולימראז</td><td>Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies , סנטה קלרה, CA</td><td>200415-51</td><td>הימנע ממחזור הפשרה והקפאה מרובים</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Duchefa Biochemie BV, הארלם, הולנד</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix , סנטה קלרה, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>iNtRON Biotechnology, סונגנאם, דרום קוריאה</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, טאיפיי, טייוואן</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Bovogen Biologicals, ויקטוריה, אוסטרליה</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>גלוטתיון Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונים</td><td>Duksan כימיקלים טהורים, Ansan, דרום קוריאה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתיל אלכוהול &nbsp; &nbsp;</td><td>Daejung כימיקלים & Metals, Siheung, דרום קוריאה</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>טייפון FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ג'ל</td><td>Bio-Rad Laboratories, הרקולס, קליפורניה</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>שייקר רוקד</td><td>FINEPCR, סיאול, קוריאה</td><td>CR300</td><td>המכונה נחוצה לשטיפת</td></tr><tr><td>מכונת PCR</td> שלב <td>מעבדות Bio-Rad, הרקולס, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>חממה/שייקרים</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, קוריאה</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגות</td><td>LABOGENE, סיאול, קוריאה</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>עמודות כרומטוגרפיה</td><td>מעבדות ביו-ראד, הרקולס, קליפורניה</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

oligopeptide assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

זרחון חלבון באתרים ספציפיים קובע את הקונפורמציה שלו ואת האינטראקציה עם מולקולות אחרות. לפיכך, זרחון חלבון משפיע על פונקציות ביולוגיות ומאפיינים של התא. כיום, השיטה הנפוצה ביותר לגילוי אתרי זירחון היא ניתוח כרומטוגרפי נוזלי / ספקטרומטריית מסה (LC / MS), שיטה מהירה ורגישה. עם זאת, זרחני פוספט זולה יחסית משוחררים לעתים קרובות phosphopeptides במהלך שלב פיצול, אשר לעתים קרובות מניב אותות שלילי שווא. במקרים כאלה, מסורתי assay קינאז במבחנה באמצעות מוטנטים מכוונים האתר יהיה מדויק יותר, אבל שיטה זו היא מייגעת זמן רב. לכן, שיטה חלופית באמצעות תחרות פפטיד עשוי להיות יתרון. מוטיב ההכרה הקונצנזוס של 5 &#39;אדנוזין monophosphate המופעל קינאז חלבון (AMPK) הוקם 1 ו תוקף באמצעות פוזיטיון סריקה פפטיד סריקה התחתAy. לפיכך, אתרי זרחון AMPK עבור מצע הרומן יכול להיות ניבא ואושר על ידי מבחני התחרות פפטיד. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים ונהלים עבור במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ידי המחשה AMPK בתיווך גורם גרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2) זרחון. כדי לאמת את האתר זרחן, ביצענו רציף assay קינאז במבחנה באמצעות מוטציה באתר ספציפי. בסך הכל, assay התחרות פפטיד מספק שיטה למסך אתרי זרחן פוטנציאליים פוטנציאליים כדי לזהות אתרים לאימות על ידי מוטציות האתר זרחן.

איור 1 ואיור 2 מדגימים את התוצאות מניסויים חוזרים ונשנים בעיתון שדווח בעבר. שלושה oligopeptides 10-שאריות שונים מחקה את אתרי היעד AMPK putative (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 המורכבת Ser558) היו מסונתז המשמשים מתחרים ב Assay קינאז מבחנה . זרחון של Nrf2 על ידי AMPK היה מאוד פחתה בנוכחות אוליגופפטיד # 3 ( איור 1</s...

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך בו-זמנית מספר אתרי פוספורילציה פוטנציאליים ולזהות אתרים לצורך תיקוף עתידי באמצעות מוטנטים של אתרי פוספורילציה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביוכימיה והביולוגיה התאית בנוגע לתפקידן של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות באיתות תאי. טכניקה זו מאפשרת סריקה ראשונית פשוטה וחסכונית של אתרי פוספורילציה ובחלבון הנבדק.ההשלכות של טכניקה זו התרחבו לאבחון ולטיפול במחלות, כולל דלקות ומסרטנים, מכיוון שפוספורילציה היא אירוע ביוכימי חשוב במסלולי העברה של אותות במחלות אנושיות. בסרטון נסייע Sol-Bi Shin, סטודנטית לתואר מחוקר במעבדה שלי, בעודה מבצעת מוטגנזה מכוונת לאתר. ראשית, ערבבו על קרח 50 nanograms של הפלסמיד pGEX JST NRF2, 125 nanograms של פריימר קדמי, 125 nanograms של פריימר אחורי, one microliter של תערובת DNTP, 2.5 units של PFU DNA polymerase ו-10x reaction buffer.הוסיפו מים מזוקקים סטריליים כדי להביא את הנפח ל-50 µL. בצעו PCR כדי לשלב את הגדיל המוטגני ולאחר מכן קררו את הדגימה על קרח למשך שתי דקות. הוסיפו מיקרוליטר אחד של אנזים ההגבלה DPNI לדגימה המקוררת.ערבבו את הדגימה באמצעות פיפוט עדין ולאחר מכן סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-13,000 ×g. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים כדי לעכל את ה-DNA בעל הגדיל הכפול ההורי. לאחר

oligopeptide-competition-assay-for-phosphorylation-site-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים טכניקת כימות רגישה של זרחן חלבונים באמצעות בדיקה של מולקולה אחת הנפתחת כלפי מטה. הפונקציונליות של פוליאתילן גליקול-ביוטין והשימוש בנוגדנים מסומנים מגבירה את הזיהוי של טירוזין פוספורילציה עם ספציפיות.

בדיקת משיכה של מולקולה יחידה לניתוח זרחן חלבונים: טכניקת תפוקה גבוהה לכימות זרחן חלבונים בליזט התא

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה משווה את הזיקות היחסיות של שותפים מחייבים ל-GTPases ממשפחת Rho, כולל Rac1. in vivo, חלבונים קושרים Rac1 מתחרים על ממשק מחייב יחיד, שהקונפורמציה שלו מוכתבת על ידי נוקלאוטיד קשור. הנוקלאוטיד חשוב וקשה לשליטה בניסוי, בשל קצב ההידרוליזה הגבוה.

השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

חקור שיטת מעבדה לזיהוי אתרי זרחון ספציפיים באמצעות מבחן תחרות אוליגופפטידים. טכניקה זו מאפשרת סינון מקדים יעיל במחקר ביוכימיה וביולוגיה תאית לחקר מחלות כמו סרטן ודלקת.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

גלה סרטונים נוספים