ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד ²⁺ חיישן Catcher ⁺

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להציג את הפרוטוקולים שלנו לתרבית וטרנספקציה של תאי HEK293 ו-C2C12 עם CatchER plus ויישומו לניטור מעברי סידן בתיווך קולטני ERSR במדידת NC2KD. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באיתות סידן ובהדמיה, כגון ריכוז הסידן הבסיסי והשינויים המהירים שלו ב-ERSR של תאים מוגדרים וכיצד ליישם חיישן ביולוגי CatchER plus למדידות אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להקליט את תגובת הקרינה של תאים בודדים בזמן אמת באמצעות קינטיקה מהירה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון מחלות הקשורות לסידן ERSR מכיוון ש-CatchER plus יכול לנטר מעברי סידן חריגים באברונים אלה הנובעים מאלמנטים לא מתפקדים של איתות סידן. ההדגמה החזותית לשיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הטרנספקציה וההדמיה הקרינה של התא מכיוון שלתרבית תאים ומיקרוסקופיה יש מספר אזורים לטעות. מי שתדגים את ההליך תהיה פלורנס רדיש, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל בניסוי זה, זרעי תאי HEK293 על מיקרוסקופ הזכוכית המעוקר מחליקים בצלחות של שישה סנטימטרים ומתרבבים במשך יום עד יומיים עד שהם מתכנסים בכ-70% ביום הטרנספקציה. לאחר מכן, רוקנו DMEM מהצלחת והוסיפו שלושה מיליליטר ממדיום הסרום המופחת. לאחר מכן, הוסיפו תערובת ריאגנטים של טרנספקציה DNA לתבשיל ודגרו במשך ארבע עד שש שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

טרנספקציה של תאי HEK293 היא בדרך כלל קלה יותר מקווי תאים אחרים, אך התאים פחות עמידים לתנאים קשים. לכן, זה קריטי לחשוף אותם רק לריאגנטים טרנספקציה למשך ארבע עד שש שעות כדי למנוע אפופטוזיס. לאחר ארבע עד שש שעות יש לשטוף את התאים בחמישה עד שישה מיליליטר HBSS.

השליכו את ה-HBSS מהצלחת והחליפו בשלושה מיליליטר DMEM טרי. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי של GECI. עבור תאי מיובלסט C2C12, נסו את התאים על ידי הוספת מיליליטר עד שניים של טריפסין כדי לכסות את תחתית המנה.

לאחר מכן, הניחו את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד שש דקות כדי לאפשר לטריפסין לשחרר את התאים מתחתית המנה. לאחר השלמת הדגירה, הסר את הטריפסין ושאף את התאים בשמונה מיליליטר של DMEM. פיפטו את התאים ביסודיות עם DMEM כדי לפזר ולהשעות מחדש את התאים באופן שווה.

לאחר מכן, זרעו אותם על הכיסויים הסטריליים בכלי תרבית של שישה סנטימטרים ולאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של DMEM כדי להשיג מפגש סופי של 60% לאחר מכן, העבירו את התאים באותו היום. דגרו אותם למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים בחמישה עד שישה מיליליטר HBSS.

השליכו את ה-HBSS מהצלחת והחליפו בשלושה מיליליטר DMEM טרי. לאחר מכן, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לאפשר ביטוי של GECI. בהליך זה, הפעל את המיקרוסקופ ומקור האור, ולאחר מכן פתח את תוכנית ה-PCI הפשוטה.

בעזרת צמר גפן, מכסים את החלק התחתון של תא ההדמיה של אמבט היהלום הפתוח בעל הפרופיל הנמוך בשכבה דקה של חומר איטום. לאחר מכן, הוציאו מהאינקובטור שקופית המכילה את התאים שהועברו ושטפו אותה בעדינות שלוש פעמים עם כמיליליטר אחד של מאגר רינגר עם 10 מילי-מולרי גלוקוז ו-1.8 מילי-מולרי סידן שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. השאירו בערך מיליליטר אחד של מאגר רינגר בצלחת כדי למנוע התייבשות התאים והשתמשו במלקחיים כדי להוציא את המגלשה מהצלחת.

ספגו עודפי תמיסה על ידי נגיעה בקצה השקופית ברקמת מעבדה. לאחר מכן, הנח אותו על צד החדר כשהתאים פונים לכיוון השומן. לאחר מכן, אבטח את החדר על תושבת הבמה באמצעות מברג.

הוסף כמיליליטר אחד של המאגר של רינגר לתא כדי למנוע מהתאים להתייבש בזמן הרכבתו על הבמה והשלמת הגדרת המיקרוסקופ. העבר את מטרת המיקרוסקופ ליעד טבילת שמן פי 40. הוסף טיפה אחת משמן הטבילה למטרה.

לאחר מכן, הנח את התושבת על המיקרוסקופ stage. לאחר מכן, הנח את קצה הוואקום בתא כדי לשמור על התמיסה מפולסת ולמנוע את מילוי יתר. לאחר מכן, הרם את המטרה באמצעות התאמת המסלול עד שהשמן על המטרה נוגע בתחתית המגלשה.

באמצעות מצב השדה הבהיר, כוונן את הרווח ל-175 ואת זמן החשיפה ל-0.03 שניות כדי למקד את התאים. לאחר שהתאים ממוקדים, עברו למצב פלואורסצנטי באמצעות עירור של 488 ננומטר ושנו את זמן החשיפה ל-0.07 שניות. אתר שדה ראייה שיש בו מספיק תאים בריאים עם פלואורסצנטיות מספקת להדמיה.

לאחר מכן, צלם תמונות במצב פלואורסצנטי ושדה בהיר. הקף אזור עניין בתאים או הקף את התא כולו כדי לתעד את העוצמה מהאזור הנבחר. כעת, התחל את מדידת העוצמה כאשר קצב הפריימים מוגדר לאחד כל חמש שניות.

אפשרו לעוצמת קו הבסיס להתייצב למשך 20 עד 30 מסגרות. לאחר מכן, חשב את כמות ה-4-CMC הדרושה ממלאי של 20 מילי-מולר בהתבסס על נפח התא הסופי של 450 מיקרו-ליטר כדי ליצור ריכוז סופי של 200 מיקרומולר. לאחר מכן, העבירו בזהירות 60 מיקרוליטר של המאגר של רינגר מהתא לצינור מיקרו-צנטריפוגה.

לדלל את הכמות המחושבת של 4-CMC בתמיסה זו ולהוסיף בחזרה לתא כדי לעורר את התגובה המיועדת מהתאים המצולמים. אפשר זמן לתרופה להיקשר לקולטן ולירידה באות שלאחר מכן. לאחר מכן, שטפו את התאים עם שלושה עד שישה מיליליטר של מאגר רינגר ובמקביל הוסיפו את סמן האירוע.

חזור על ההליכים עבור 100 ATP מיקרו-מולרי ו-15 מיקרו-מולרי CPA באמצעות שקופית חדשה של התאים המועברים עבור כל בדיקה. לאחר השלמת המדידה, סיים את איסוף הנתונים בחלון מדידת העוצמה בתוכנית PCI הפשוטה. לאחר מכן, צלמו את תמונות הקרינה והשדה הבהיר של התאים.

לאחר מכן, פתח את קובץ הנתונים עבור הניסוי. הקף מחדש את התאים או אזורי העניין כדי לחשב מחדש את ערכי העוצמה במידת הצורך. כדי לקבוע את תאי המיובלסט NC2KD ו-C2C12, חזור על הליך הטרנספקציה והוסף מיליליטר אחד של מאגר רינגר נטול סידן בתא.

לחדור לתאים עם 0.002 עד 0.005% ספונין ומאגר תוך-תאי למשך 15 עד 30 שניות כדי לרוקן את התאים מכל CatchER פלוס שעשוי להיות בציטוזול. לאחר מכן, שטפו את התאים עם שלושה עד שישה מיליליטר של מאגר KCL המכיל EGTA ו-10 יונומיצין מיקרו-מולרי. אפשר לעוצמה לרדת עד שמגיעים לרמה.

לאחר מכן, שטפו את התאים בשלושה עד שישה מיליליטר של מאגר KCL עם 10 יונומיצין מיקרו-מולרי ואפשרו לעוצמה להתייצב. לאחר מכן, הוסיפו תמיסות סידן שונות כדי לאפשר לעוצמה להגיע למישור בין כל הוספה. כדי לכייל את החיישן לכימות ריכוז הסידן הבסיסי, השתמש ב-EGTA ובמאגר סידן של 100 מילי-מולרי כדי לקבל את עוצמת הקרינה המינימלית והמקסימלית.

מוצגות כאן התכונות המייצגות את העוצמה המנורמלת שנאספה מתאי מיובלסט C2C12 חדירים שהועברו עם CatchER plus. התאים היו חדירים עם 0.005% ספונין במאגר התוך תאי למשך 15 עד 30 שניות. תמיסות EGTA וסידן הוכנו במאגר KCL ו-N מתייחס למספר התאים שצולמו.

תמונות פלואורסצנטיות מוכנסות אלה הן נציגות התאים לפני ואחרי הטיפול. 0.2, 0.6, שתיים, חמש, 10, 20, 50 ו-100 מילי-מולרי סידן נוסף לתאי המיובלסט C2C12 החדירים בנוכחות 10 יונומיצין מיקרו-מולרי כדי לקבל KD של 3.1 פלוס מינוס 1.4 מילי-מולארי. איור זה מציג מדידת עוצמה מייצגת של CatchER בתוספת תאים שעברו טרנספטציה בערכי מינימום ומקסימום לאחר תוספת של EGTA מילי-מולרי אחד וסידן של 100 מילי-מולרי עם 10 יונומיצין מיקרו-מולרי כל אחד בהתאמה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 עד 60 דקות להדמיה או שלושה ימים אם כולל את הטרנספקציה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד לטפל בתאים בסביבה סטרילית, להכין ריאגנטים לפני הניסוי, למרוח שכבה אחידה של שומן על התא ולחבר את הוואקום שלך לפני שמתחילים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתם מערבי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו רמת הביטוי של CatchER plus.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום איתות והדמיית סידן לחקור את דינמיקת הסידן של ERSR בתאי יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר תאים ולדמיין אותם באמצעות CatchER plus.