מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לתרבית תאי אנדותל ושריר חלק יחד במבחנה כדי ליצור צמתים מיואנדותליים המתרחשים בעורקי התנגדות בקוטר קטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הלב וכלי הדם כגון, לוקליזציה של חלבונים והפעלת מפלי איתות בדופן העורק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לבודד באופן ספציפי שברי צומת מיואנדותל מהאנדותל והשריר החלק, מה שאי אפשר לעשות באמצעות עורק אמיתי.

הדגמה חזותית של הטמעת פרפין היא קריטית במיוחד, מכיוון ששלבי ההטמעה יכולים להיות קשים ללימוד מבלי לראות את התהליך. התחל בבניית תרבית תאי כלי הדם או VCCC, על ידי ריסוס צלחות פטרי ומכסים בגודל 150 מילימטר בחומר חיטוי ולאחר מכן ניגוב במגבת נייר או מגבונים נטולי מוך. לאחר מכן, רססו את צלחות הפטרי באתנול 70% והניחו אותן במכסה המנוע לייבוש באוויר.

פתח את צלחת תוספות המסנן בתנאים סטריליים. מצפים את הצד התחתון של המסננים בתמיסת פיברקטין על ידי פיפטינג של עד מיליליטר אחד של תמיסת פיברקטין דרך החריצים הצדדיים לתחתית הצלחת. ודא שהמחצית התחתונה של המסנן מכוסה והשאיר את התוספות במכסה המנוע, תוך שמירה על מכסה הצלחת.

לאחר 30 דקות של טיפול בתמיסת סיבים, שואב כל תמיסה עודפת מבלי להפריע לתוספות המסנן. לאחר מכן, הפוך את הצלחת, הנח את המסננים בחצי התחתון של צלחת הפטרי הנקייה. נסה בקבוק של 225 סנטימטר מרובע של תאי שריר חלק עם שלושה מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA מחוממת מראש.

לאחר שהתאים התרוממו, הוסיפו תשעה מיליליטר של מדיום SMC כדי לנטרל את הטריפסין. מעבירים לצינור חרוטי ומערבבים היטב. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר על המוציטומטר כדי לקבוע את מספר התא.

לאחר ביצוע ספירת תאים, צלחו בזהירות 750 מיקרוליטר של תרחיף התאים המכיל כ-75,000 תאי שריר חלק על הצד התחתון של כל מסנן. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השני, מלאו כל באר של צלחת נקייה של שש בארות בשני מיליליטר של מדיום SMC טרי שחומם מראש.

הסר את המדיום מתוספת על ידי יניקה והעביר אותו לצלחת שש הבארות עם מדיום SMC. מוסיפים מיליליטר אחד של תמיסת ג'לטין בקר 0.5% לצד העליון של התוספות ומניחים בחום של 37 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות לפחות. נסה בקבוק של 225 סנטימטר מרובע של תאי אנדותל עם שלושה מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA מחוממת מראש.

עם הקשה עדינה על הבקבוק כדי להרים את התאים מהצלחת. לאחר השעיה מחדש של התאים במדיום EC וביצוע ספירת תאים, הסר את הג'לטין מהפילטר. לאחר מכן, צלח 360,000 ECs בנפח מיליליטר אחד על הצד העליון של כל תוספת מסנן.

תנו לתאים לדגור ללא הפרעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. התחל בפיצול, על ידי שאיבת המדיום מצלחת אחת של שש בארות של תוספות במכסה המנוע של תרבית התאים ולאחר מכן, הובלה לחדר קר על קרח. בחדר הקירור, פיפטה 10 מיקרוליטר PBS על צד ה- SMC של התוספות.

השתמש במרים התאים כדי לגרד את ה-SMC. לאחר מכן, העבירו את התאים מהמגרד לצלחת פטרי מסומנת המכילה מאגר ליזה. לאחר שמגרד התאים נגע במאגר הליזיס, אל תאפשר לו לגעת במסנן ההכנסה עד שהוא ניגב לחלוטין והתייבש על מגבות נייר.

חזור על גריטת מסנן ה-SMC פעם או פעמיים נוספות, כדי להסיר לחלוטין את שאריות תאי ה-SMC. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר PBS על צד תא האנדותל של מסנן ההכנסה. מגרדים את התאים לצלחת פטרי מתויגת כראוי של מאגר ליזה, כפי שהודגם זה עתה.

אסוף את תמיסת התא מהצד EC של המסנן עם הפיפטה והעביר לצלחת פטרי עם תווית מתאימה. היה יסודי מאוד בגריטת התאים משני צידי המסננים כדי להבטיח זיהום תאים מינימלי בשבר הצומת של השריר. לאחר מכן, השתמש בזהירות באזמל כדי לחתוך את המסננים מתוספת הפלסטיק.

עשה זאת על ידי חיתוך 70 עד 80% ממנו הרחק מהפלסטיק ושימוש במלקחיים כדי למשוך את המסנן לחלוטין ממבנה הכנסת הפלסטיק. כוון כל מסנן לצינור חרוטי מסומן בנפח 50 מיליליטר המכיל מאגר ליזה. ודא שהמסננים שקועים במאגר ונשארים רטובים.

לאחר שכל התאים נאספו מהפילטרים, מערבל את צינור ה-MEJ בנפח 50 מיליליטר במלוא העוצמה למשך 15 שניות או עד לערבוב טוב. הסר את המסננים מחרוט ה- MEJ בעזרת מלקחיים, גרור אותם לאורך דפנות הצד של הצינור כדי להשאיר את הכמות המקסימלית של חלבונים ונוזלים בצינור. לאחר שכל המסננים הוסרו מהצינור החרוטי של MEJ, בצע סיבוב מהיר בצנטריפוגה כדי למשוך את כל הנוזל והחלבונים לתחתית הצינור.

לאחר הסיבוב, העבירו את תכולת צינור ה-MEJ וצלחות הפטרי SMC ו-EC לצינורות צנטריפוגה קטנים יותר נפרדים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות בקרוב ל-16,000 x G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנטים.

לאחר מכן, בדוק ליזאטים של תאים לתכולת חלבון באמצעות מבחן ביזינקונטי. ביום החמישי של הדגירה של VCCC, הוסף 4% PFA לכל באר המכילה תוספת מסנן שטוף ודגירה למשך הלילה עם ניעור בארבע מעלות צלזיוס. לאחר כ-24 שעות, העבירו את התוספות ל-70% אתנול למשך 24 שעות לפחות.

עבד את המסננים לטווח ארוך במעבד רקמות אוטומטי. לאחר הריצה, הסר פילטר מהקסטה שלו באמצעות מלקחיים כדי להחזיק את המסנן בקצה ולאחר מכן, חתוך את המסנן לשניים בעזרת מספריים. הניחו כל אחד משני החצאים על צלחת קרה ומלאו את תבנית ההטבעה בפרפין נוזלי.

גע בקצרה מאוד בתבנית ההטבעה המלאה בצלחת הקרה, ולאחר מכן הטמיע כל מחצית של המסנן בתבנית ההטבעה כשהצד החתוך כלפי מטה כדי להבטיח שהמסנן נחתך מהמרכז. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את המסנן במקומו כדי למנוע מהחצאים ליפול זה לזה עד שהפרפין קריר מספיק כדי שיעמדו לבד. לאחר מכן, העבירו את תבנית ההטבעה לצלחת קרה עד להתמצקות מלאה.

הטמע וחתך את התוספת המסוננת בכיוון אנכי. לאחר החתך, ניתן לצבוע את ה-VCCC עבור אימונופלואורסצנציה רוחבית. תמונה זו של מיקרוסקופ אלקטרונים של העברה חיסונית מציגה עורק עכבר עם ביטוי של אלפא גלובין ב-MEJ המסומן בחרוזי זהב, המופיעים כנקודות שחורות.

כתם מערבי זה מדגים כי מעכב מפעיל פלסמינוגן ביטוי אחד מועשר בשבר MEJ לעומת שברי EC או SMC. פלסטיק EC מציין ECs הגדלים על צלחת פלסטיק שאינם יוצרים MEJ. צביעה חיסונית חושפת את המידור ההדוק של מודל ה-VCCC.

הקולטן האדרנרגי אלפא-1 נראה רק בשכבת תאי השריר החלק, קולטן הברדיקינין נראה רק בשכבת תאי האנדותל. צביעת F אקטין היא בכל שני סוגי התאים ב-MEJ במבחנה כפי שמצוין על ידי החץ הלבן. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הכל סטרילי עד למועד הקטיף, לצלחת בזהירות את התאים ולגרד היטב את המסננים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Western Blotting או אימונופלואורסצנציה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו לוקליזציה של חלבון, רמות ביטוי או הפעלה.