קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא זיהוי של N-Acetylneuraminic acid ו-N-Glycolylneuraminic acid בכבד ובחלב של עכברים מסוג wild-type ועכברים עם knock-out של CMAH באמצעות אנליזת HPLC. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחום הגליקו-מדע (glycoscience), ובמיוחד להשפעה של הגנוטיפים של מודלי עכברי CMAH על תכני החומצה הסיאלית בפועל בבעלי חיים אלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לסריקות גנטיות הוא שניתן לקבוע רמות יחסיות של חומצה סיאלית גם עבור עכברים הטרוזיגוטים.

הערכת שיטה זו תבוצע על ידי Cui Cao ו-Wang Wenjiao, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלנו. התחל את ההליך באיסוף חלב עכבר ורקמת כבד של עכבר מעכברים עם נשקיות (knock-out) של CMAH כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לבודד חומצות סיאליות מהחלב, העבר 50 µL של חלב לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 mL, והוסף 1.2 mL של תמיסת חומצה אצטית מימית שהוכנה מראש.

כדי לבודד חומצות סיאליות מרקמת כבד, הפשיר בעדינות 20 עד 50 מיליגרם של כבד עכבר והעבר אותו למטחנת רקמה מסוג dounce. הוסף 1.2 מיליליטר של תמיסת חומצה אצטית מימית והומוגניז את הרקמה על ידי גזיקה עדינה למשך 10 שניות. העבר את התו suspension שהתקבל לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

בשלב הבא, דגרו את החלב המוחמץ או את תרחיף הרקמה במשך ארבע שעות ב-80 °C. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך 10 דקות. העבירו את 1000 µL העליונים של הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת צנטריפוגה נקייה בנפח 1.5 mL.

הסר את הממס באמצעות אידוי בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר עד לייבוש מלא. המס מחדש את הדגימה ב-500 microliters של מים מזוקקים. לאחר מכן, הכן עמודת חילוף אניונים מיקרוסקופית על ידי העברה של 200 milligrams של שרף חילוף אניונים לכל דגימה לתוך מבחנות ריקות של 3 milliliter עם ברז עצירה מחובר.

הוסף 2 milliliters של תמיסת חומצה אצטית מימית כדי להחליף את יוני הכלוריד בשרף ביוני אצטט. סגור את הברז ברגע שהממס מגיע לחלקו העליון של השרף. הוסף בעדינות 2 milliliters של מים מזוקקים ופתח את הברז.

עצרו את הזרימה ברגע שרוב הממס מגיע לחלק העליון של השרף. ודאו שהשרף מכוסה תמיד בממס. לאחר מכן, שטפו את עמודת השרף פעמיים נוספות עם 2 mL של מים מזוקקים כדי להסיר את עודפי האצטט.

העבירו את 500 מיקרוליטר של ממס הדגימה שהתקבל אל עמודת השרף והשליכו את התסננת (flow-through). שטפו בעדינות את השרף עם 2 מיליליטר של מים מזוקקים. בצעו אלוציה של אניוני הדגימה מהשרף באמצעות 1 מיליליטר של תמיסת ammonium acetate בריכוז 50 מילימולארי לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

הסר את הממיס על ידי אידוי בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר עד לייבוש מלא. שקול בין 5 ל-8 מיליגרם של N-Acetylneuraminic acid באמצעות מאזניים אנליטיים לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. רשום את המשקל המדויק והוסף 164 מיקרוליטר של מים מזוקקים עבור כל מיליגרם.

רכשו N-Glycolylneuraminic acid בכמויות קטנות ובמחיר סביר, למשל באליקוטיות של 1 milligram. הוסיפו 154 microliters של מים מזוקקים ישירות לתרכובת כדי להכין תמיסת סטוק של Neu5Gc בריכוז של כ-20 millimolar. העבירו את התמיסה לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 milliliter.

ניתן לאחסן תמיסה זו במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים. ערבבו 5 µL מכל תמיסת מלאי בתוך מבחנת צנטריפוגה נקייה של 1.5 mL. לאחר מכן, הסירו את הממס באמצעות אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר עד לייבוש מלא.

הוסיפו 20 µL של תמיסת OPD לדגימות חומצה סיאלית שהופקו מחלב עכבר, כבד עכבר, או מתקן חומצה סיאלית מעורב. ערבבו את הדגימה בעוצמה באמצעות וורטקס למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 80 °C בחושך.

לאחר קירור הדגימות למשך חמש דקות, הוסיפו 80 µL של מים מזוקקים. לאחר מכן, סבבו את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 14,000 ×g למשך דקה אחת. בשלב הבא, העבירו 80 µL מהנוזל העליון (supernatant) לבקבוק HPLC עם התאוששות גבוהה של 300 µL.

ניתן לאחסן את דגימות חומצה הסיאלית שעברו נגזרת בטמפרטורה של ארבע עד שש מעלות צלזיוס למשך שבוע לכל היותר. נתח את הדגימות באמצעות מערכת HPLC סטנדרטית המחוברת לגלאי פלואורסצנציה מקוון. השתמש בעמודה מסוג C18 בפאזה הפוכה באורך 250 מילימטר ובקוטר 4.6 מילימטר לצורך הניתוח.

לאחר הכנת ממס A וממס B, והגדרת הרצת ה-HPLC כפי שפורט בפרוטוקול, הזרק 50 µL מהדגימה למערכת ה-HPLC. נטר את האלוציית באמצעות גלאי פלואורסצנציה באורך גל עירור של 373 nm ואורך גל פליטה של 448 nm. לבסוף, חשב את הכמות היחסית של Neu5Gc כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

מוצגים כאן כרומטוגרמות HPLC מייצגות של חומצות סיאליות המסומנות בפלואורסצנציה מדגימות חלב, שהופקו מעכברי CMAH עם נוק-אאוט הומוזיגוטי ומעכברי CMAH עם נוק-אאוט הטרוזיגוטי. מוצגים כאן גם עכברי wild-type. באופן דומה, מוצגות כאן כרומטוגרמות של חומצות סיאליות המסומנות בפלואורסצנציה שהופקו מכבד עכבר.

השוואה של הכמויות היחסיות של Neu5Gc מראה כי עכברים עם נוק-אאוט הומוזיגוטי של CMAH אינם מכילים Neu5Gc, בעוד שעכברים עם נוק-אאוט הטרוזיגוטי של CMAH ועכברים מסוג בר (wild-type) מכילים בין 10% ל-75% Neu5Gc. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להכין את הדגימות בתוך שמונה שעות אם הפרוצדורה בוצעה כראוי. את הדגימות ניתן לנתח באמצעות דגימה אוטומטית ב-HPLC במהלך הלילה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את בידוד חומצה הסיאלית ואת תהליך הנגזרת (derivitization) באותו היום. לאחר הפרוצדורה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אנליזה בספקטרומטריית מסות, כדי לאשר את מהותם של האותות הפלואורסצנטיים שהתקבלו. פיתוח טכניקה זו מאפשר לחוקרים לחקור את התפלגות חומצה הסיאלית בדגימות ביולוגיות.

אל תשכחו שעבודה עם חומצה אצטית מרוכזת וחומצה פורמית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן, בעת ביצוע פרוצדורה זו.