Name: קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר CMAH נוק- out עכברים. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: למד לזהות חומצות סיאליות בכבד וחלב של עכברי CMAH knock-out באמצעות HPLC. שיטה זו מאפשרת לכמת רמות חומצות סיאליות בדגימות ביולוגיות ולחקור את השפעת הגנוטיפ על מטבוליזם הסיאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (מענק מספרים 31471703, A0201300537 ו 31671854 ל JV ו LL), ואת 100 תוכנית כשרונות זרים (מענק מספר JSB2014012 ל JV).

נהלים הקשורים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית של המרכז החינוכי הניסויי של נאנג &#39;ינג האוניברסיטה החקלאית בהתאם להנחיות הלאומיות לרווחת בעלי חיים ניסיוני (משרד המדע והטכנולוגיה, יחסי ציבור של סין, 2006) עם בעלי החיים השוכן SPF מתקן (מזהה הרשאה: SYXK-J-2011-0037). 1. Cmah לדפוק את העכבר דגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש wild-type C57Bl / 6 עכברים מהמרכז הרפואי השוואתי של אוניברסיטת יאנגז &#39;ו (סין). הערה: Cmah לדפוק את העכברים נוצרו על סמך המידע שסופק מן Cmah הקודם לדפוק- out מחקרים 17 , 19 ו שהושגו מסחרית באמצעות אסטרטגיה CRISPR / Cas9 20 על ידי הסרת 92 זוגות זוג מן אקסון 6 של הגן Cmah , שהוא גם נמחק בגן CMAH האנושי 19 . חיובי F 0/ Sub&gt; -mice (2 אנשים) חצו עם עכברים מסוג בר כדי להשיג heterozygous F- 1 עכבר. לאחר חציית F הטרוזיגוטיים F- 1 (5 אנשים), הומוזיגיים Cmah לדפוק- F 2- עכברים ניתן להשיג בהצלחה (3 אנשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע genotyping של עכברים באמצעות DNA גנומי על פי השיטה המוצגת על ידי Zangala 21 באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את קטע ה- DNA המקביל של הגן Cmah באמצעות פולימראז דנ&quot;א מסחרי ואת זוג primer 5&#39;gaaagggctcggctctgtatgaa3 &#39;ו 5&#39;tttaaaatgtcccgggtgagaagc3&#39;. בצע את הגברה הגן באמצעות 34 מחזורים PCR המורכב denaturation ב 94 מעלות צלזיוס במשך 40 s, חישול ב 63 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות, התארכות ב 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו מוצרים PCR על ג&#39;ל agarose 1%. יש לצפות בלהקה בודדת (0.5 קילו-בייט) עבור האדם מסוג wild wild, פס כפול (0.4 ו -0.5 קילו-בייט) עבורהטרוזיגוסית, ולהקה בודדת (0.4 קילו-בייט) לאדם ההומו-ציגי. </li></ol></li></ol> 2. אוסף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף חלב עכבר באמצעות פרוטוקול המתואר על ידי Willingham et al. 22 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמת הכבד העכבר באמצעות פרוטוקול המתואר על ידי Gonçalves et al. 23 ו חנות דגימות ב -80 ° C. </li></ol> 3. בידוד של חומצות סיאליות מחלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של פתרון 2 חומצה אצטית M על ידי הוספת 12 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחוני לתוך 88 מ&quot;ל של מזוקק H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 50 μL של חלב לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגה להוסיף 1.2 מ&quot;ל של תמיסת חומצה מימית מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור את ההשעיה במשך 4 שעות ב 80 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגה המדגם ב XG 14,000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את μL 1000 העליון של supernatant לתוך צינור צנטריפוגות טרי 1.5 מ&quot;ל רםOve ממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר כדי להשלים יובש (בהתאם משאבת ואקום המצורפת זה ייקח 4-20 שעות). Re- להמיס את המדגם μL 500 של מזוקקים H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טור חילופי מיקרו אניון. שלב זה יהיה להעשיר תרכובות anionic במיוחד ולהסיר תרכובות קטיוני וניטרלי מן דגימות חלב וכבד, ולכן מגביר את הסלקטיביות של fluorogenic OPD סוכן תיוג עבור derivatization חומצה sialic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עבור כל מדגם 200 מ&quot;ג של שרף חילופי אניון (Dowex 1X8) לתוך צינורות ריק 3 מ&quot;ל טור עם שסתום המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תמיסת חומצה אצטית מימית מוכן בשלב 3.1 כדי להחליף את יוני כלור שרף עם יונים אצטט. סגור את שסתום ברגע ממס מגיע לראש שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 2 מ&quot;ל של מזוקק H 2 O, לפתוח את שסתום לעצור את הזרימה ברגע שרוב הממס מגיעהחלק העליון של השרף. ודא כי שרף תמיד מכוסה ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את שרף טור פעמיים נוספות עם 2 מ&quot;ל של מזוקק H 2 O להסרת עודף אצטט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את μL 500 וכתוצאה מכך ממס מדגם משלב 3.4. על העמוד שרף וזורקים את הזרימה דרך. בעדינות לשטוף את שרף עם 2 מ&quot;ל של מזוקקים H 2 O. Elute אניונים מדגם מן שרף באמצעות 1 מ&quot;ל של פתרון 50 מ&quot;מ אמוניום אצטט (386 מ&quot;ג של אצטט אמוניום מומס 100 מ&quot;ל של מזוקק H 2 O) לתוך 1.5 מ&quot;ל צינור צנטריפוגה. הסר את הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר ליובש. הערה: דגימות יבשות ניתן לאחסן על 4-6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים. </li></ol> 4. בידוד של חומצות סיאליות מ רקמת כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפשיר 20 - 50 מ&quot;ג של הכבד העכבר ולהעביר אותו לתוך מטחנת רקמה Dounce (1 מ&quot;ל או 2 מ&quot;ל של נפח). הוסף 1.2 מ&quot;ל של תמיסת חומצה אצטית מימיתמוכן בשלב 3.1 ו homogenize הרקמה על ידי גז עדין במשך 10 s. מעבירים את ההשעיה וכתוצאה מכך צינור צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 3.3. Solid הערה: דגימות יבשות ניתן לאחסן על 4-6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים. </li></ol> 5. הכנת תקן חומצה Sialic מעורב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקלים בין 5 - 8 מ&quot;ג של חומצה N-acetylneuraminic על איזון אנליטית לתוך צינור 1.5 צנטריפוגות מ&quot;ל. שים לב למשקל המדויק ולהוסיף 164 μL של H 2 מזוקק עבור כל מ&quot;ג ( כלומר אם המשקל של Neu5Ac הוא 7.2 מ&quot;ג ואז להוסיף 7.2 x 164 = 1, 181 μL של מזוקק H 2 O). התוצאה היא פתרון 20 מ&quot;מ Neu5Ac המניות אשר ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג N-glycolylneuraminic חומצה בכמויות קטנות במחיר מתון כגון 1 מ&quot;ג aliquots. הוסף 154 μL של מזוקק H 2 O ישירות למתחם על מנת להשיג ~ 20 מ&quot;מ Neu5Gc פתרון המניות. להעביר אתפתרון לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ&quot;ל. פתרון זה ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 12 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 5 μL מהפתרון כל המניות משלב 5.1 ו 5.2 לתוך צינור צנטריפוגה טרי 1.5 מ&quot;ל ולהסיר את הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר ליובש. הערה: תקן חומצה sialic מעורב יכול להיות מאוחסן על 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד 12 חודשים. </li></ol> 6. הקרינה Derivatization של חומצות Sialic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של OPD פתרון, בהיקף של 100 מ&quot;ג של o-phenylenediamine o ו 208 מ&quot;ג של מימן sulfite נתרן 10 מ&quot;ל של מזוקק H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של OPD פתרון לדגימות חומצה sialic נגזר חלב העכבר (שלב 3), כבד העכבר (שלב 4), או תקן חומצה sialic מעורבת (שלב 5). וורטקס במרץ עבור 30 ד ו דגירה דגימות במשך 4 שעות ב 80 ° C בחושך ( כלומר לעטוף את microtubes רדיד אלומיניום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הדגימות להתקרר במשך 5 דקות, להוסיף 80 μ, L מזוקקים H 2 O ו צנטריפוגה צינורות ב XG 14,000 במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 80 μL מן supernatant לתוך בקבוקון 300 μL גבוהה התאוששות HPLC. הדגימות חומצה sialic derivatized ניתן לאחסן 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד. </li></ol> 7. HPLC ניתוח של Sialic חומצה נגזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הדגימות באמצעות מערכת HPLC סטנדרטי מחובר גלאי פלואורסצנטי באינטרנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טור שלב C18 הפוך עם ממדים סטנדרטיים של 250 מ&quot;מ אורך ו 4.6 מ&quot;מ קוטר לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ממס על ידי דילול 200 מ&quot;ל של פתרון המניות עם 800 מ&quot;ל של מים כיתה LCMS (LCMS - כרומטוגרפיה כרומטוגרפית נוזלית מסה). פתרון המניות עצמו יכול להיות מוכן כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 46 גרם של חומצה פורמית ל 800 מ&quot;ל של LCMS כיתה H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את pH 4.5 על ידי הוספת drop הוספת hydroxide אמוניום פתרון (purissa הרשות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הממס למדידת גליל ולמלא עד 1000 מ&quot;ל עם LCMS כיתה H 2 O. פתרון זה המניות ניתן לאחסן 4 - 6 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ממס B, השתמש אצטוניטריל LCMS בכיתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את חומצות sialic נגזרים בקצב 1 מ&quot;ל / דקות הזרימה עם elution הבאות gradient: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי הוספת 10% של ממס ב &#39;מעורב א ממס א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ 0 דקות עד 15 דקות, להגדיל בהדרגה את שיעור ממס B עם שיפוע ליניארי ל 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ 15 דקות עד 16 דקות, להגדיל במהירות את שיעור ממס B עם שיפוע ליניארי מ 60% ל 90%. זה יוזם את הכביסה של העמוד HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף עוד את העמודה HPLC, לשמור על רמת ממס ב 90% בין 16 דקות ו 18 דקות לפני הפחתת בהדרגה את רמת ממס ממס שוב 10% בין 18 דקות ו 19 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-equilibrate עמודות HPLC לתנאי ההתחלה של 10% B בין 19 ו 24 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בJect 50 μL של המדגם לתוך מערכת HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג eluents באמצעות גלאי פלואורסצנטי עירור / פליטת גלים של 373/448 ננומטר, ואת חומצות sialic derivatized ניתן לצפות בשעה משוער פעמים של 9 דקות (עבור Neu5Gc-OPD) ו 10 דקות (עבור Neu5Ac-OPD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום היחסי של Neu5Gc (F Neu5Gc) מאזורי השיא הקרינה של Neu5Ac (א Neu5Ac) ו Neu5Gc (א Neu5Gc) כדלקמן: F Neu5Gc [%] = 100 × Neu5Gc / (א Neu5Gc Neu5Ac + A). במקרה של דגימות חלב וכבד מן העכבר Cmah לדפוק החוצה עכבר F Neu5Gc צריך להיות 0%, ואילו הערכים עבור F Neu5Gc של העכברים הטרוזיגיים wild-type עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לגיל העכבר ואת סוג הרקמה (בין 2% ו - 90%) עם שולי שגיאה צפויים של ± 12%. </li></ol>

<ol><li>Lamari, F. N., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+methods+for+sialic+acids+and+critical+evaluation+of+their+biologic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).</li>
<li>Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+the+absence+of+N-glycolylneuraminic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans.</a> J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).</li>
<li>Chou, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+human+CMP-sialic+acid+hydroxylase+occurred+after+the+Homo-Pan+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).</li>
<li>Rehan, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Glycomics+of+Livestock%3A+Discovery+of+Highly+Sensitive+Serum+Biomarkers+Indicating+an+Environmental+Stress+Affecting+Immune+Responses+and+Productivity+of+Holstein+Dairy+Cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows.</a> J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).</li>
<li>Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ganglioside+and+glycoprotein+sialic+acid+in+breastfed+compared+with+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants.</a> Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).</li>
<li>Yao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sialic+acids+in+red+meat+by+UPLC-FLD+using+indoxylsialosides+as+internal+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards.</a> Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+natural+human+antibodies+against+a+nonhuman+sialic+acid+that+metabolically+incorporates+into+activated+and+malignant+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells.</a> J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).</li>
<li>Byres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+non-human+glycan+mediates+human+susceptibility+to+a+bacterial+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin.</a> Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).</li>
<li>Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+human-specific+mechanism+for+diet+and+antibody-mediated+inflammation+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).</li>
<li>Tangvoranuntakul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+uptake+and+incorporation+of+an+immunogenic+nonhuman+dietary+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).</li>
<li>Svennerholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+sialic+acids.+II.+A+colorimetric+resorcinol-hydrochloric+acid+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method.</a> Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiobarbituric+acid+assay+of+sialic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The thiobarbituric acid assay of sialic acids.</a> J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).</li>
<li>Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+sialic+acids+by+gas+chromatography+of+the+mannosamine+derivatives+released+by+the+action+of+N-acetylneuraminate+lyase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase.</a> J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).</li>
<li>Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+sialic+acids+for+stabilization+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+and+concomitant+differentiation+of+alpha%282+--%3E+3%29-+and+alpha%282+--%3E+6%29-isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).</li>
<li>Hurum, D. C., Rohrer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sialic+acids+in+infant+formula+by+chromatographic+methods%3A+a+comparison+of+high-performance+anion-exchange+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection+and+ultra-high-performance+liquid+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods.</a> J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorometric+high-performance+liquid+chromatography+method+for+sialic+acid+determination%3A+an+internal+standard+method+and+its+application+to+sialic+acid+analysis+of+human+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22E.+Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein.</a> E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid%2C+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li>
<li>Manzi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+liquid+chromatography+of+sialic+acids+on+a+pellicular+resin+anion-exchange+column+with+pulsed+amperometric+detection%3A+a+comparison+with+six+other+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems.</a> Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).</li>
<li>Hedlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-glycolylneuraminic+acid+deficiency+in+mice%3A+implications+for+human+biology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution.</a> Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zangala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genomic+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of genomic DNA from mouse tails.</a> J Vis Exp. (6), e246(2007).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar J. 6, 169(2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר הערכה פנוטיפית של הומוזיגוס Cmah לדפוק את העכברים על ידי ניתוח וכימות כמויות יחסית של Neu5Gc של חלב ודגימות כבד. הניתוח בוצע באמצעות התקנה סטנדרטית HPLC עם זיהוי פלואורסצנטי. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא הכנת העמודות חילופי אניון וביצוע כרומטוגרפיה אניון החליפין; כדי ליישב את שרף כראוי לאסוף את הכביסה הנכון שברים elution לוקח קצת תרגול. לחלופין, כאן משמש נגזר הגזירה OPD ניתן...

N-Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ו- N-glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc) הם חומצות sialic הנפוצים ביותר יונקים 1 . למרות יכולת סינתזה Neu5Ac endogenously, בני אדם אינם מסוגלים לייצר Neu5Gc בשל מחיקת אקסון העיקרי על קידוד הגן CMAH עבור הידרוקסילאז CMP-Neu5Ac 2 , 3 . עם זאת, מוצרי מזון המבוססים על בעלי חיים יכולים להיות מקורות תזונתיים של Neu5Gc 4 , 5 , 6 , המוביל לייצור נוגדנים נוגדי Neu5Gc ולכן מפעיל תגובה חיסונית כלפי Neu5Gc 7 . השפעה זו תזונתית של Neu5Gc חשוד לתרום דלקת כרונית ומחלות שונות 8 , 9 , 10 . על מנת להבין את ההשפעות של Neu5Gc ב חUmans, מודל חיה עבור המחקר השיטתי של ההשפעות של חומצות סיאליות במזון הוא רצוי מאוד. למרות פרוטוקולים המבוססים על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לניתוח של נוק- out עכברים מבוססים היטב דרך נוחה להערכה genotypical, ניתוח פונקציונלי של פנוטיפ ברמה המטבולית דורש שיטות ניתוח ספציפי יותר. פנוטיפ של מודל Cmah לדפוק את העכבר ניתן להעריך על ידי בידוד וניתוח הרכב של חומצות sialic בדגימות כבד או חלב. מספר שיטות לאיתור חומצות סיאליות ברקמות בעלי חיים דווחו בעבר: תגובה של חומצות סיאליות עם רסורצינול 11 או חומצה thiobarbituric 12 לגרום להיווצרות של מוצר chromophoric וניתן פשוט ניתח באמצעות ההתקנה מבוסס platereader, אבל רק את סך sialic ניתן לקבוע תוכן חומצי. לחלופין, ניתוח של חומצות sialic תוארה גם באמצעות כרומטוגרפיה גז13 , MALDI-ToF ספקטרומטריית מסה 14 או שיטות אמפומטריות 15 . עם זאת, הנפוץ ביותר sialic החלים שיטות ניתוח מבוססים על שחרור hydrolytic, ואחריו derivatization פלואורסצנטי ואחריו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית 16 , 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-חומצה אצטילנוראמינית</td><td>סיגמא</td><td>A0812</td><td></td></tr><tr><td>N-גליקולילנויראמנית חומצה</td><td>סיגמא</td><td>50644</td><td>1 מ"ג אליקוט אמור להספיק</td></tr><tr><td>o-פנילאנדיאמין</td><td>סיגמא</td><td>694975</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן גופרתי</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>75234</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כלים/חומרים: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל צינורות SPE</td><td>Supelco</td><td>Sigma 57024</td><td>עמודי חילוץ פאזה מוצקה ריקים</td></tr><tr><td>Luer stopcock</td><td>Sigma</td><td>S7396</td><td>כדי לעצור את זרימת צינור SPE</td></tr><tr><td>Dowex 1X8 Dowex</td><td></td><td>Sigma Sigma 44340</td><td>200 - 400 mesh</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Dounce</td><td>Sigma</td><td>D8938</td><td>התאמה הדוקה</td></tr><tr><td><חזקה>ניתוח HPLC: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בעל התאוששות גבוהה בקבוקון HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>#5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>גלאי פלואורסצנטי עבור HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs</td><td></td></tr><tr><td>HPLC עמוד</td><td>Phenomenex</td><td>Hyperclone ODS</td><td>250 x 4.6 מ"מ</td></tr><tr><td>LCMS בדרגת H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS בדרגת LCMS Acetonitrile</td><td>Merck Millipore</td><td>#100029</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום הידרוקסיד</td> היפרדראד <td>Fluka</td><td>#44273</td><td>puriss. פ.א.</td></tr></tbody></table>

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; cmah</em&gt; נוק- out עכברים.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-Acetylneuraminic acid hydroxylase) הוא אחראי על החמצון של חומצות cytidine monophosphate-N- אצטילנורמין ב יונקים. עם זאת, בני אדם לא יכולים לחמצן cytidine monophosphate-N- חומצה אצטילנוראמית כדי cytidine monophosphate-N- חומצה glycolylneuraminic בשל מחיקת אקסון העיקרי של הגן CMAH . כדי להבין את ההשפעות ואת ההשלכות של חוסר פעילות CMAH בפירוט רב יותר, מודל Cmah לדפוק את העכברים הוא עניין רב במחקר בסיסי ויישומי. שיטת ניתוח כדי לקבוע את הפנוטיפ של מודל העכבר כאן הוא תיאר בפירוט, והוא מבוסס על זיהוי של שניהם חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד וחלב של wild-type ו- Cmah לדפוק את העכברים. חומצות sialic אנדוגניים משתחררים ו derivatized עם o-phenylenediamine לייצר נגזרות fluorogenic, אשר ניתן לנתח לאחר מכן על ידי HPLC. הפרוטוקול המוצג יכול להיותחל גם על ניתוח של דגימות חלב ורקמות ממקורות שונים אחרים, והוא עשוי להיות שימוש כדי לחקור את התזונתיים ואת ההשפעות הבריאותיות של N-glycolylneuraminic חומצה.

סקירה סכמטית של שיטת הניתוח המתואר מוצג באיור 1 וכולל את הבידוד של חומצות sialic מדגימות חלב וכבד של wild-type ו- Cmah לדפוק- out עכברים מוטציה, ו derivatization פלואורסצנטי וניתוח HPLC של רכיבים אלה. איור 2 איור 3 להראות chromatograms HPLC נציג של חומצות sialic derivatized של חלב דגימות כבד מ הומו ו heterozygous לדפוק החוצה Cmah עכברים (- / ...

אנו מתארים שיטה מבוססת HPLC לקביעת חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד העכבר חלב.

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; CMAH</em&gt; נוק- out עכברים.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא זיהוי של N-Acetylneuraminic acid ו-N-Glycolylneuraminic acid בכבד ובחלב של עכברים מסוג wild-type ועכברים עם knock-out של CMAH באמצעות אנליזת HPLC. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחום הגליקו-מדע (glycoscience), ובמיוחד להשפעה של הגנוטיפים של מודלי עכברי CMAH על תכני החומצה הסיאלית בפועל בבעלי חיים אלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לסריקות גנטיות הוא שניתן לקבוע רמות יחסיות של חומצה סיאלית גם עבור עכברים הטרוזיגוטים.הערכת שיטה זו תבוצע על ידי Cui Cao ו-Wang Wenjiao, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלנו. התחל את ההליך באיסוף חלב עכבר ורקמת כבד של עכבר מעכברים עם נשקיות (knock-out) של CMAH כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לבודד חומצות סיאליות מהחלב, העבר 50 µL של חלב לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 mL, והוסף 1.2 mL של תמיסת חומצה אצטית מימית שהוכנה מראש.כדי לבודד חומצות סיאליות מרקמת כבד, הפשיר בעדינות 20 עד 50 מיליגרם של כבד עכבר והעבר אותו למטחנת רקמה מסוג dounce. הוסף 1.2 מיליליטר של תמיסת חומצה אצטית מימית והומוגניז את הרקמה על ידי גזיקה עדינה למשך 10 שניות. העבר את התו suspension שהתקבל לשפופרת צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.בשלב הבא, דגרו את החלב המוחמץ או את תרחיף הרקמה במשך ארבע שעות ב-80 °C. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-14,000

determination-sialic-acids-liver-milk-samples-wild-type-cmah-knock

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דגימות רקמה קפוא מבולבלות גלומות במדיום טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר) יכולות לשמש כדי לחקור הפצה וglycosylation טבעית של ריר מופרש. בעיבוד רקמות גישה זו היא מינימאלי והמצגת הטבעית של גליקוליפידים, mucins וglycan-אפיטופים נשמרה. סעיפי רקמות יכולים להיות מנותחים על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות זיהוי פלואורסצנטי או chromogenic.

שימוש ברקמות תתבטלנה, קפואות ללמוד הפצת mucin טבעית

בסרטון זה, אנו מדגימים זיהוי של חומצות סיאליות, חומצה N-אצטיל-נוירמינית וחומצה N-גליקולילינוירמינית, באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, HPLC, לאחר דה-ריווטציה עם מגיב תיוג פלואורסצנטי מתאים כדי לסייע בזיהוי פלואורסצנטי.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב ההפוך: שיטה חזקה לכימות של חומצות סיאליות עם תווית פלואורסצנטית ופירוק שבודדו מכבד עכבר

איסוף חלב ממודלים של בעלי חיים מקל על כיווני מחקר שונים: הבנת חסינות פסיבית, זיהוי פתוגנים האחראים להעברה אנכית, ובאמצעות שימוש בעכברים טרנסגניים, אפילו ייצור מסחרי של חלבונים המצויים בחלב אם. כאן אנו מדגימים שיטה פשוטה לאיסוף חלב בעכברים ובאייל המונטג'אק של ריבס.

שיטות איסוף חלב לעכברים וריבס &#39;Muntjac צביים

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור את ההשפעה של הביטול של גנים הקשורים הטעימה על תגובות חיסוניות נתרן גופרתי לתוספי (DSS)-induced מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלת העכבר מודל.

ההשפעות של טעם איתות חלבון ביטול על דלקת מעיים במודל עכבר מחלות מעי דלקתיות

אנו מתארים מודל הפטיטיס חיסון in vivo בעכברי BALB/c שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפתוגנזה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות, כולל הבדלי מין שנראו במחלה זו. נתאר כיצד מודל זה מדגים ניתוחים הניתנים לשחזור באמצעות טכניקות ניסיוניות in vivo ו- in vitro.

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

מאמר זה מתאר כיצד להרכיב מכשיר שניתן להשתמש בו לאיסוף חלב מעכברי מעבדה. מכשיר זה זול, נייד ומאפשר איסוף של 0.1-0.5 מ"ל חלב על ידי אדם מיומן אחד. פרוטוקול חליבה מפורט כלול גם כן.

טכניקה יעילה לאדם יחיד לדגימת חלב מעכברי מעבדה

למד לזהות חומצות סיאליות בכבד וחלב של עכברי CMAH knock-out באמצעות HPLC. שיטה זו מאפשרת לכמת רמות חומצות סיאליות בדגימות ביולוגיות ולחקור את השפעת הגנוטיפ על מטבוליזם הסיאלית.

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר

גלה סרטונים נוספים