הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בעורקי התנגדות מבודדים כדי לבדוק את תגובתיות כלי הדם לגירויים כלי דם. זה גם יראה כיצד להעריך שינויים במנגנוני בקרת שרירים חלקים ותכונות מכניות פסיביות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של כלי הדם בנוגע למנגנוני בקרת האנדותל והשריר החלק של כלי הדם בעורקים בעלי התנגדות קטנה במצבים שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד עורקים בעלי התנגדות קטנה מסביבת התאים הפרנכימליים ולשמור עליהם בלחץ הרגיל שלהם בזמן שנבדקות תגובות לגירויים כלי דם. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של תפקוד לקוי של כלי הדם. סוג זה של מניפולציה אינו אפשרי in vivo.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלת כלי דם היקפיים, ניתן ליישם אותה גם על מחלת עורקים כליליים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי המיקרוקנולציה בגלל עדינות ההליך והצורך להימנע מפגיעה בעורק. ביום הניסוי הכינו שני ליטר תמיסת מלח פיזיולוגית בבקבוק ארלנמאייר בנפח שני ליטר.

בעת הוספת מלאי החיץ 20X, ודא שהתמיסה מאוזנת ברציפות עם תערובת הגז ומערבבת אותה עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, צפו ב-pH תוך הוספת 0.28 גרם מונוסודיום פוספט לתערובת. במידת הצורך, יש להעלות את ה-pH על ידי הוספת טיפות של שש חומצות הידרוכלוריות-רגילות או 6.5 תמיסת נתרן הידרוקסיד רגילה מפיפטה של פסטר כך שה-pH יישאר על 7.4.

לאחר מכן הוסף 1.98 גרם גלוקוז לתמיסת המלח הפיזיולוגית. לאחר מכן, הכינו 500 מיליליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית נטולת סידן על ידי דילול תמיסת המלאי פי 20 במים נטולי יונים. לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר ממלאי המאגר 20X בבקבוק Erlenmeyer והוסף 0.07 גרם מונוסודיום פוספט לתמיסה תוך ניטור והתאמת ה-pH של התמיסה.

השתמש בצינורות טטרפלואורואתילן כדי לחבר מיכל גז המכיל את תערובת הגז המתאימה לאמבטיית האיברים. בועות רציפות של התמיסה בקצב מספיק כדי להבטיח בעבוע רציף, אך לא סוער של התמיסה הזורמת לתוך תא הכלי. כמו כן, הנח אבן אוויר קטנה המחוברת לתערובת גז שיווי המשקל בתא הכלי כדי לסייע בשמירה על הרכב הגז של תמיסת המלח הפיזיולוגית.

מניחים את תמיסת המלח הפיזיולוגית בבקבוק מריוט של שני ליטר. הוסף צינור זכוכית מרכזי לפקק שישמש כמאגר שיספק באופן רציף את תמיסת המלח הפיזיולוגית לאמבט האיברים הפרמקולוגי המספק את התמיסה לתא הכלי. הנח את פתח צינור הזכוכית המרכזי בבקבוק מריוט באותה רמה כמו החלק העליון של תמיסת המלח הפיזיולוגית באמבט האיברים.

זה יבטיח ראש לחץ הידרוסטטי קבוע להעברת תמיסת המלח הפיזיולוגית לאמבט האיברים. השתמש בצינור פוליאתילן המחובר לצינור זכוכית בצורת J כדי להעביר את תמיסת המלח הפיזיולוגית מבקבוק מריוט לאמבט האיברים. לשפע לומנלי, השתמש בצינורות פוליאתילן כדי לחבר את פיפטת הזרימה למאגר תמיסת מלח פיזיולוגי המורכב ממזרק פלסטיק בנפח 66 סמ"ק המוגבה למצב השומר על לחץ הזרימה הרצוי.

עקוב אחר הלחץ על ידי חיבור מתמר לחץ למערכת באמצעות תא עצירה. לאחר מכן, חבר את פיפטת הזרימה לצינור פוליאתילן למאגר הדומה למאגר הזרימה על מנת לאפשר לתמיסת המלח הפיזיולוגית לזרום דרך הכלי בתגובה לשיפוע לחץ. כמו כן, השתמש בחיבור פקק ומתמר לחץ דומה כדי לפקח על לחץ היציאה.

הסר את המוח של חולדת ספראג דולי והנח אותו במצב שכיבה בצלחת פטרי מזכוכית מלאה בתמיסת מלח פיזיולוגית קרה כקרח. לאחר מכן, הניחו את המנה מתחת לסטריאוסקופ. השתמש במספריים של Vannas ובמלקחיים עדינים של Dumont מספר חמש כדי להוציא את עורקי המוח האמצעיים מהמוח.

לאחר מכן, נקה את כל רקמת המוח שנותרה מעורק המוח האמצעי באמצעות המלקחיים. העבירו את העורק לתא כלי הדם על ידי אחיזתו בעדינות בקצה הקטע שנכרת והנחו אותו בזהירות בתא. לאחר מכן, השחילו את עורק המוח על המיקרופיפטה הנכנסת על ידי משיכתו לכיוון בסיס הפיפטה עד שהקצה מתקדם לתוך לומן העורק.

אבטח את העורק על פיפטת הזרימה על ידי קשירת לולאה שהוכנה מסיב חד-גדילי שהתגרה בעבר מ-10-0 תפרים סביב העורק. לאחר מכן, אבטח את הקצה הנגדי של עורק המוח האמצעי לפיפטה היוצאת על ידי הידוק לולאת תפר שנייה סביב הכלי והשתמש במיקרומטר המחובר למחזיק פיפטת הזרימה כדי למתוח את העורק לאורכו באתרו. קשרו את כל הענפים הצדדיים באמצעות גדילים בודדים המתגרים מ-10-0 תפרים על מנת לשמור על לחץ קבוע בעורק.

לאחר מכן, הגדר מיקרוסקופ וידאו המורכב ממצלמת וידאו המחוברת למיקרוסקופ מנתח המחובר למיקרומטר וידאו ולצג טלוויזיה. השתמש בהגדרה זו כדי למדוד את הקוטר הפנימי של העורק. העריכו את הטון המיוגני ואת תגובות כלי הדם לגירויים מרחיבי כלי דם על ידי הקפדה על כך שהעורק מציג רמה מתאימה של טונוס פעיל לפני הניסוי.

השליכו עורקים חסרי טונוס פעיל במנוחה, למעט כלי דם כגון עורקים מזנטרים קטנים שאינם מציגים בדרך כלל טונוס מנוחה פעיל. לאחר מכן, הוסף ריכוזים הולכים וגדלים של אצטילכולין לתא הכלי ומדוד את קוטר כלי הדם כדי לבדוק את התגובתיות התלויה באנדותל של עורק ההתנגדות הקנולטי. בדוגמה זו, העורק מפגין תפקוד לקוי של האנדותל כפי שמודגם על ידי כישלונו להתרחב בתגובה לאצטילכולין.

בסיום הניסוי יש לקבוע את הקוטר המרבי של העורק על ידי הוספת תמיסת מלח פיזיולוגית נטולת סידן לפרפוזה ולסופרפוסאט. השתמש במדידה זו כדי לחשב את אחוז צליל המנוחה הפעיל. הדגמה של התרחבות מקסימלית בתמיסת מלח פיזיולוגית נטולת סידן מאמתת כי כישלון העורק להתרחב בתגובה לאצטילכולין נבע מתפקוד לקוי של האנדותל ולא עקב חוסר יכולת של העורק להירגע עקב שיפוץ מבני של כלי הדם.

איור זה ממחיש את התגובות לאצטילכולין מרחיב כלי הדם התלוי באנדותל בעורקי מוח אמצעיים מבודדים מחולדות רגישות למלח דאל זכר בשלושת הזנים הקונוגניים המצומצמים. זה מראה כי התרחבות תלוית אנדותל לאצטילכולין נעדרה בזן ההורים הרגיש למלח ובשני הזנים הקונגניים השומרים על אלל רנן הרגיש למלח. התרחבות תקינה שוחזרה בזן הקונגני הנושא את האלל החום של נורווגיה רנן ברקע הגנטי הרגיש למלח, מה שתומך בהשערה שתפקוד לקוי של האנדותל בחולדות SS נובע מפגיעה בוויסות הגן Renan.

בניסוי זה, כישלון הדיאטה עתירת המלח לחסל את ההתרחבות התלויה באנדותל לאצטילכולין בזן מסוים של חולדה, הממצאים לגבי תורמים ללחץ חמצוני כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל במהלך עלייה בצריכת המלח התזונתית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד שלוש וחצי שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בעורק המבודד בזהירות רבה כדי למנוע נזק לשריר החלק ובמיוחד לאנדותל.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הוספת אגוניסטים מכווצי כלי דם ומרחיבי כלי דם או אנטגוניסטים לקולטנים על מנת לענות על שאלות כולל מנגנונים המשפיעים על תגובתיות כלי הדם לחומרים שונים ומנגנוני פעולת תרופות על כלי הדם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של כלי הדם ופיזיולוגיה מיקרו-סירקולטורית לחקור את תפקוד השרירים החלקים והאנדותל בעורקי התנגדות ממיטות כלי דם שונות של חיות ניסוי ובני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להעריך מנגנוני בקרת שרירים חלקים אנדותל וכלי דם בעורקים בעלי התנגדות קטנה ממיטות כלי דם שונות.