Name: הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו הערכת תפקוד כלי דם בחולדות באמצעות מיקרוסקופיית וידאו מבודדת. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני בקרה אנדותליים ושרירים חלקים בעורקי התנגדות קטנים לטיפול בדיספונקציה וסקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אקספרס שלהם כנה תודה קייטי פינק ולין Dondlinger עבור שלהם בפז סיוע בהכנת כתב היד הזה.
תמיכה גרנט: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; #R01-HL128242.

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאמור במבוא, מאמר זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ הטלוויזיה ואת ההתנגדות מבודד עורק גישות להעריך את תפקוד כלי הדם לא רק במודלים עכבר סטנדרטי (כמו המועסקים וידאו), אבל גם ב שהתשתית גנטית זני עכברים מהונדסים, אשר מציגות את הרומן ואת התובנות עוצמה שניתן להשיג ניצול גישות אלה. השימוש של טכניקות עוצמה אלה כדי להעריך את הטון פעיל פסיבי תכונות מכניות של העורקים התנגדות קטן יכול לספק מידע חשוב לגבי קשת רחבה של מנגנוני הבקרה כלי דם כולל תקנה אנדותל תלוית של טון פעיל בהתנגדות העורקים, השריר החלק בכלי הדם הפונקציה תחת נורמלי ותנאי pat...

המחקרים המוקדמים של תפקוד כלי הדם העורקים מנוצל conduit עורקים, וכן רבים במקרים אבי העורקים. יצירת כח בעורקים גדולים נחקר בדרך כלל על ידי הצמדת קטע טבעת של העורק מתמר כוח באמבט רקמות; במקרה של אבי העורקים, על ידי חיתוך לוליינית רצועות של כלי השיט כך סיבי שריר חלק היו אוריינטציה בכיוון האורך בין הנקודה החזקה המתמר בכוח, כדי לספק את האומדן הטוב ביותר של הכוח שנוצר על ידי שריר חלק לאורך ציר האורך. הטכניקה הסטנדרטי לחיתוך רצועות לוליינית aortas היה למקם את מוט זכוכית לומן של כלי השיט, עושים חתך על הקיר כלי בזווית הרצויה של תחזיק בקצה של הקצה החשוף של הקיר כלי כמו גזירה הוארך כדי לייצר שלמה רצועת הסליל של כלי השיט. בשלב זה, הצד אנדותל של כלי השיט כלל נמוג ונעלם להסרת פסולת לפני הצמדת רצועת כלי מתמר כוח, השוקע ההכנה ב חמצן, טמפרטורה מבוקרת רקמות אמבט. בסופו של דבר, כי הגישה בראשות לאחת התגליות החשוב והמפורסם ביותר בהיסטוריה של פיזיולוגיה Furchgott ו- Zawadski1, כלומר את התפקיד של אנדותל נגזר גורם מרגיע (EDRF), לאחר מכן זוהה תחמוצת החנקן, ב ויסות תפקוד כלי הדם. האירוע מכריע שמוביל שגילוי היה מצב שבו החוקרים המתוחזקים של אנדותל ללא פגע על ידי הימנעות קשר של הצד אנדותל של העורק במשטחים זרים, והבחנתי כי רצועת אבי העורקים לא להפגין את הצפוי הציר כדי אצטילכולין (ACh), אבל במקום רגוע, בתגובה ACh. בהתבסס על המידע החיוני, החוקרים פיתח הכנה "כריך" שבו חיברו מקטע אבי העורקים עם אנדותל שלם (אך אין אפשרות ליצור כוח כויץ) לקבל רצועה לוליינית סטנדרטי של אבי העורקים, המרה של ACh-induced התכווצות לתוך הרפיה.
שני התקדמות גדולה באזור זה הנמצאים בשימוש נרחב כיום הם ההתפתחות של ההכנות למדוד פעיל כויץ כוח התנגדות קטן העורקים2,3 (כגון אלה של מצע המעי המעי3 ) ו לצינוריות עמידות העורק ההכנות4,5,6. באחד הדיווחים המוקדמים, Mulvany ו הלפרן3 תיאר את השימוש ההכנה myograph תיל ללמוד פעיל כויץ כוח מבודדים התנגדות העורקים מ מצע המעי המעי באופן ספונטני עם יתר לחץ דם העכברים (שומר), פקדים WKY normotensive. לאחר הפיתוח של מערכת myograph תיל, פותחו לצינוריות עמידות העורק ההכנות להתיר מחקרים של כלי קרוב ל ויוו 5,4,התנאים6.  בעוד שתי הגישות לספק תוצאות יקר, הכנת לצינוריות בעורק יש את היתרונות הוסיף יותר ביעילות שמירה על הטון פעיל מהותי בעורקים; ומאפשר החוקרים ללמוד תגובות myogenic הפעיל לשינויים תגובות הלחץ ואת כלי transmural שינויי קצב הזרימה ואת אנדותל גזירה (ראו סקירה על ידי הלפרן, קלי6).
יעד מרכזי של המאמר הנוכחי היא לתאר כיצד להעסיק את הטכניקה ששורשיה של מיקרוסקופ וידאו באמצעות התנגדות מבודדת, לצינוריות העורקים על מנת לקבל מידע מדויק לגבי המנגנונים המווסתים טון פעילים אלה חיוני . כלי, עצמאית של השפעות עצביות, ההורמונאלית או parenchymal תא. מידע בסיסי זה, העסקת דגם עכבר סטנדרטי ודוגמאות מן המחקרים שלנו של חדש גנטית זני עכברים מהונדסים, תספק את הקורא עם רעיון של סוגי לתובנות לגבי תפקוד כלי דם שניתן להשיג עם טלוויזיה גישות מיקרוסקופ, אשר יכול להיות מועסק ב מחקרים שכללו כל שליטה, בקבוצות ניסיוני של החוקר בוחר, כולל דגמים עכברוש ניסיוני חדש חזק המיוצר על ידי הרבעה סלקטיבית ולא מחדש פיתח גנטי טכניקות הנדסה.
בזכות הדיוק של גישות מיקרוסקופ טלוויזיה, במדידת קוטר שינויים בהכנות לצינוריות עורק יכול לספק מידע רב ערך מאוד לגבי מנגנונים תלויי-אנדותל ועצמאי אנדותל של כלי הדם הרפיה, כמו גם שינויים חשובים (וגם לפעמים בלתי צפויות) מנגנוני בקרה וסקולרית המתרחשים עם יתר לחץ דם, תזונה מלח גבוהה של התערבויות אחרות ניסיוני. בנוסף, מדידה של הלחץ-קוטר היחסים מבודדים, לצינוריות עורקים עמידות מקסימאלית רגועות על ידי טיפול עם Ca2 +-ללא פתרון או תרופה תרופתי מרחיב כלי דם, מתירה לחוקר להעריך ביצוע שינויים מבניים העורקים בשל שיפוץ כלי הדם, כדי לחשב יחסים מתח פאסיבי-זן7 שיכול לספק תובנה חשובה שינויים במאפייני מכני פסיבי של העורקים אשר יכולים להשפיע על תפקוד עורקי עצמאית של (או בנוסף) שינויים מנגנוני בקרה פעילה. חשוב גם לציין כי המידע הנרכש ממחקרים מבודד התנגדות העורקים ניתן להשלים על ידי מידע שהושג ניצול LDF, שיטה מעשית להערכת רקמות זלוף-כל בעלי החיים ברמה8,9 ,10, ומאגד לפי מידע שנרכש מתוך הערכת הצפיפות microvessel באמצעות fluorescently שכותרתה GS1 לקטין, אשר במפורש גליקופרוטאין moieties ב קרום המרתף של רבים, נימים קטנים11 , 12. השיטה השנייה מספק הערכה מאוד מדויקת של צפיפות microvessel שאינו כפוף הקשיים קלאסי באומדן צפיפות microvessel על ידי ספירת כלי ויוו, לדוגמה חסרים שאינם perfused כלי שבו זרימת הדם מופסק עקב סגירת פעילים רבים. כאשר נעשה שימוש יחד, גישות אלה יכולים לספק תובנה חשוב לתאם שינויים פונקציונליים העורקים מבודד התנגדות לשינויים רקמות זלוף ברמת microcirculatory; כמה דוגמאות לשימוש גישות יקרי ערך אלה בשילוב עם טכניקות עורק לצינוריות יסופקו בכתב היד הנוכחי.
המאמר הנוכחי מתמקד השימוש של טכניקות במיקרוסקופ וידאו כדי להעריך שינויים בכלי הדם העורקים של חולדות ספראג-Dawley outbred. עם זאת, חשוב לציין כי שיטות אלה הוכיחו להיות בעלי ערך גבוה ב שחקרתי שינויים פנוטיפי זני עכברים מהונדסים גנטית מאוד מיוחדים שנוצרו על ידי ברירה מלאכותית או ג'ין עריכה תוך שימוש בטכניקות. כתב יד זה, אנו מספקים דוגמאות איך וידאו טכניקות במיקרוסקופ סיפקו מידע חשוב לגבי תפקוד כלי הדם במספר של עכברוש יקר דגמים, כולל דאל רגיש מלח (הה) עכברים, עכברושים המפגרים המתח הוא נרחב ביותר משמש דגם ניסיוני ללמוד על מנגנוני מלח hypertenson רגיש18,19,20,21,22,23; חולדות consomic שנוצרו באמצעות ברירה מלאכותית של האס. אס חולדות עם המתח מלח-רגישות של עכברוש בראון נורבגיה (בסון). הלוחות עכברוש consomic, בכל כרומוזום מהחולדה נורבגיה בראון כבר introgressed בנפרד לרקע דאל SS24,25,26 גנטי. השימוש פנלים עכברוש consomic סיפקה ערך רמזים לגבי כרומוזומים מסוימים שתורמים מלח הרגישות של לחץ הדם ואת פנוטיפים אחרים, כולל תגובתיות וסקולרית24,25,26 27, ,28.
אסטרטגיות רבייה סלקטיבית ניצול SS עכברים וחולדות consomic נושא כרומוזומים בודדים בסון אפשרו גם הדור של זנים הצרת congenic עם מקטעים קטנים של הפרט בראון נורבגיה כרומוזומים introgressed לתוך האס דאל גנטי 22,רקע29. אלה יכולים לספק יקרי קלט על גנים ספציפיים או לצמצם אזורים של כרומוזומים אשר יכולים להשפיע על משתנים פיזיולוגיים קריטי, כגון לחץ דם, כליות נזק לכלי הדם תגובתיות22,29. בנוסף חזק אחר הכלים גנטית עכברים היא הפיתוח של עכברוש ג'ין נוקאאוט דגמי ניצול גנים מתקדם עריכה כולל ZFNs, מפעיל-כמו-אפקטור תעתיק nucleases (TALENS), שיטות, לאחרונה CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. כניסתו של טכניקות אלה עוצמה המאפשרים גנים לנוק אאוט בחולדה הוא פיתוח שלמוזיקה יש חשיבות מרובה כי מחקרים נוקאאוט גנטי עד כה השתמשו (ועכברים להמשיך להשתמש) כמעט באופן בלעדי. רכיב נסיוני נוסף בעיתון הנוכחי מדגים את הערך של העורק לצינוריות וטכניקות מיקרוסקופ וידאו כדי להעריך את מנגנוני הבקרה פיזיולוגיים בחולדות נוקאאוט חסר בסיס נוגד חמצון ותא שעתוק מגן פקטור, גרעיני גורם (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 (NRF2)30,31, אשר פותחו באמצעות טכנולוגיית TALEN הרקע הגנטי של ספראג-Dawley17. בניסויים האלה, במבחנה טכניקות במיקרוסקופ וידאו שימשו כדי לספק אימות פונקציונלי של אובדן של הגן NRF2, כדי לבדוק את ערך פוטנציאלי גישה טיפולית המבוססת על קולטנים upregulation ישירה של נוגדי חמצון בתיווך NRF2 הגנות. ה-NRF-2 יש חשיבות טיפולית משמעותית ב הייהוד שלה סטרס חמצוני וסקולרית בבני אדם, לאור תוצאות מאכזבות של ניסויים קליניים הכוללים ניהול ישיר של נוגדי חמצון כגון ויטמינים C ו- E32.

<table><tbody><tr><td></td><td>SS Rat Medical College of Wisconsin</td><td>SS/JHsd/Mcwi strain</td><td>צור קשר עם ד"ר אהרון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.5BN</td><td>המכללה הרפואית</td> של חולדה קונסומית של ויסקונסין <td>SS-Chr 5BN/mcwi</td><td>צור קשר עם ד"ר אהרון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>SS.13BN</td><td>המכללה הרפואית של חולדה קונסומית של ויסקונסין</td><td>SS-Chr 13BNזן /Mcwi</td><td>צור קשר עם ד"ר ארון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-BN</td><td>המכללה הרפואית של חולדה קונגנית של ויסקונסין</td><td>SS. BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi צור</td><td>קשר עם ד"ר ארון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr>Ren1-SSA <td>המכללה הרפואית</td> <td>לחולדה קונגנית</td> של ויסקונסין <td>SS. BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi זן</td><td>צור קשר עם ד"ר ארון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Ren1-SSB</td><td>המכללה הרפואית של חולדה קונגנית של ויסקונסין</td><td>SS. BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi זן</td><td>צור קשר עם ד"ר ארון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>Nrf2(-/-) חולדה נוקאאוט וחברי חולדה מסוג בר</td><td>המכללה הרפואית של ויסקונסין</td><td>SD-Nfe212em1Mcwi זן</td><td>צור קשר עם ד"ר ארון גרטס (ageurts@mcw.edu)</td></tr><tr><td>צ'או עכברוש דל מלח (0.4% NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>צ'או עכברוש עתיר מלח (4% NaCl)-AIN-76A</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113756</tr><tr><td>קולורדו וידאו קליפר</td><td>קולורדו וידאו, בע"מ</td><td>דגם 308</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת וידאו</td><td>היטאצ'י</td><td>KPM1AN</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס מדעי החיים</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>צג טלוויזיה</td><td>פנסוניק</td><td></td> מתמרי לחץ WVBM1410 <td></td></tr><tr><td></td><td>סטולטינג</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>יחידת תצוגת לחץ דם</td><td>סטולטינג</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>תא עורק מגולגל</td><td>מערכות חיות מכשור</td><td>CH-1</td><td>תא כלי יחיד לשימוש כללי</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה למערכות מגורים חד תאיות</td><td>מכשור</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>צינור פיזור גז, מיניאטורי,</td><td>מערכות חיים ישרות מכשור</td><td>GD-MS</td><td>מספק אוורור באמבט הכלי</td></tr><tr><td>מחמצן חילופי גזים,</td><td>מכשור מערכות חיות</td> מיניאטוריות <td>OX</td><td>מאפשר החלפת גז עם</td></tr><tr><td>מד זרימה לייזר-דופלר</td><td>פרפוזה Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>GS1 Lectin</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית למיקרופיפטות</td><td>Fredrich Haer Co.</td><td>27-33-1</td><td>2 מ"מ ODX1 מ"מ ID</td></tr><tr><td>חולץ פיפטה קודקודי</td><td>דיוויד קופף מכשירים</td><td>דגם 700C</td><td></td></tr><tr><td>חומר תפר ניילון (10/0)-3 שכבות</td><td>קו Ashaway וייצור חוטים ושות'</td><td>114-ANM-10</td><td>גדילים בודדים של תפר ניילון 3 שכבות הוצאו לשימוש על כלים</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Protandim</td><td>Protandim</td><td></td><td>NRF2 Inducer: צור קשר עם ד"ר ג'ו מק'קורד (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td></tr> <tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>פישר כימיקל</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז (D-גלוקוז)</td><td>נטול מים פישר כימיקל</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט (MgSO4-7H2O)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M1880-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2-2 H2O)</td> <td>סיגמא</td><td>C5080-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט-מונוביסיק (NaH2PO4)</td> <td>סיגמא</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>פישר כימיקל</td><td>P217-500G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>ED255-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

פרוטוקול זה המתאר את השימוש במבחנה טלוויזיה מיקרוסקופ כדי להעריך את תפקוד כלי הדם ההתנגדות מוחי מבודד העורקים (ובכל כלי אחר), ומתאר שיטות להערכת זלוף רקמות באמצעות לייזר דופלר Flowmetry (LDF ) ומתויגים צפיפות microvessel ניצול fluorescently Griffonia simplicifolia (GS1) לקטין. שיטות לימוד מבודד התנגדות העורקים בזמן transmural לחצים נתקל ויוו , בהיעדרו של תאים parenchymal השפעות ומספקות לך קישור קריטי בין ויוו מחקרים ומידע שנרכשו מ מולקולרית הרדוקציוניסטית המספקים מוגבל תובנה תגובות אינטגרטיבית ברמת כל בעלי חיים. LDF וטכניקות רבים לזהות באופן סלקטיבי נימים עם fluorescently-ידי לקטין GS1 לספק פתרונות מעשיים כדי לאפשר חוקרים כדי להרחיב את הידע שנרכש ממחקרים מבודד התנגדות העורקים. מאמר זה מתאר את היישום של טכניקות אלה כדי לצבור ידע בסיסי של כלי הדם פיזיולוגיה, פתולוגיה בחולדה כמודל ניסויי כללי, במגוון מיוחדים מהונדסים גנטית זנים "מעצבים" עכברוש יכול לספק תובנה חשובה השפעת גנים ספציפיים על חשוב פנוטיפים כלי הדם. ניצול גישות ניסיוניות יקרי ערך אלה בעכברוש הזנים שפותחו על ידי אסטרטגיות מלאכותית וטכנולוגיות חדשות לייצור מודלים נוקאאוט גנטי בחולדה, יתרחב הקשיחות של המקומי המדעי פיתח במודלים נוקאאוט של העכבר, להרחיב את הידע הזה כדי במודל חיה רלוונטי יותר, עם רקע פיזיולוגי הבין היטב, התאמתם מחקרים פיזיולוגיים בגלל הגודל שלה גדול יותר.

במבחנה מיקרוסקופ לצינוריות התנגדות העורקים מאפשר חקר הגורמים המשפיעים על הטון הפעיל התנגדות קטן העורקים (ובכל רבים גדולים יותר) נורמלי ויוו transmural לחצים, בהיעדרו של תאים parenchymal השפעות. בנוסף מעריכים את תגובתיות של כלי לגירויים שונים מרחיב כלי דם, מצר את כלי הדם, תגובות myogenic transmural העלאת הלחץ ב- PSS נורמלי, Ca2 +-PSS חינם ניתן להוסיף את perfusate ואת superfusate בסוף הניסוי כדי לקבוע את עובי קוטר וקיר קיבול מקסימלית. המדידות האחרון הם בעלי ערך ...

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בעורקי התנגדות מבודדים כדי לבחון את תגובתיות כלי הדם לגירויים וזו-אקטיביים (vasoactive). הוא ידגים גם כיצד להעריך שינויים במנגנוני הבקרה של השריר החלק ובמאפיינים מכניים פסיביים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של כלי הדם בנוגע למנגנוני בקרה של האנדותל והשריר החלק של כלי הדם בעורקי התנגדות קטנים בתנאים שונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד עורקי התנגדות קטנים מסביבת תאי הפארנכימה ולשמור אותם בלחץ הנורמלי שלהם בזמן בדיקת התגובות לגירויים וזו-אקטיביים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של תפקוד לקוי של כלי דם. סוג זה של מניפולציה אינו אפשרי in vivo.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות כלי דם היקפיים, ניתן ליישמה גם עבור מחלת עורקים כליליים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי המיקרו-קניולציה קשים ללמידה בשל עדינות הפרוצדורה והצורך להימנע מפגיעה בעורק. ביום הניסוי, הכינו שני ליטרים של תמיסת מלח פיזיולוגית בבקבוק ארלנמאייר של שני ליטרים.בעת הוספת תמיסת המאגר של הבאפר בריכוז 20X, ודאו שהתמיסה נמצאת בשיווי משקל רציף עם תערובת הגזים וערבבו אותה באמצעות מגנט ערבוב. לאחר מכן, עקבו אחר ה-pH בעת הוספת 0.28 גרם של monosodium phosphate לתערובת. במידת הצורך, כוונו את ה-pH על ידי הוספת טיפות של חומצה כלורית בריכוז six normal או של תמיסת סודיום הידרוקסיד בריכוז 6.5 normal באמצעות פיפט פסטור, כך שה-pH יישאר ב-7.4.לאחר מכן, הוסיפו 1.98 grams של גלוקוז לתמיסת המלח הפיזיולוגית. בשלב הבא, הכינו 500 milliliters של תמיסת מלח פיזיולוגית נטולת סידן על ידי דילול תמיסת המלאי 20X במים דה-יוניים. לאחר מכן, הוסיפו 25 milliliters של תמיסת מלאי בופר 20X לבקבוק ארלנמייר והוסיפו 0.07 grams של מונוסודיום פוספט לתמיסה תוך כדי ניטור וכיוון של ה-pH של התמיסה.השתמשו בצינור טטרהפלואורואתילן (tetrafluoroethylene) כדי לחבר מיכל גז המכיל את תערובת הגזים המתאימה לאמבט האיברים. בבעבעו את התמיסה באופן רציף בקצב המספיק כדי להבטיח בועות רציפות, אך לא סוערות, של התמיסה הזורמת אל תוך תא הכלי. כמו כן, הניחו בתא הכלי אבן אוויר קטנה המחוברת לתערובת גזי השיווי המשקלי כדי לסייע בשמירה על הרכב הגזים של תמיסות המלחים הפיזיולוגית.העבירו את תמיסת המלח הפיזיולוגית לבקבוק מריוט (Mariotte) בנפח של שני ליטרים. הוסיפו צינור זכוכית מרכזי לפקק שישמש כמאגר המספק באופן רציף את תמיסת המלח הפיזיולוגית לאמבט האיברים הפרמקולוגי, המעביר את התמיסה לתא הכלי הדם.פעולה זו תבטיח ראש לחץ הידרוסטטי קבוע להגשת התמיסה המלוחית הפיזיולוגית לתוך אמבט האיבר. השתמש בצינור פוליאתילן המחובר לצינור זכוכית בצורת J כדי להעביר את התמיסה המלוחית הפיזיולוגית מבקבוק מריוט אל אמבט האיבר. עבור פרפוזיה לומנלית, השתמש בצינור פוליאתילן כדי לחבר את פיפטת הכניסה למאגר של תמיסה מלוחית פיזיולוגית, המורכב ממזרק פלסטיק בנפח 66-CC המורם לגובה השומר על לחץ הכניסה הרצוי.נטרו את הלחץ על ידי חיבור מתמר לחץ למערכת באמצעות ברז (stopcock). לאחר מכן, חברו את פיפטת המוצא לצינור פוליאתילן שמוביל למאגר הדומה למאגר הכניסה, כדי לאפשר לתמילת המלח הפיזיולוגית לזרום דרך כלי הקיבול בתגובה למפל לחצים. השתמשו בברז ובחיבור מתמר לחץ דומים כדי לנטר את לחץ המוצא.הוצא את המוח של חולדה מסוג Sprague Dawley והנח אותו בתנוחה גבנית (supine) בתוך צלחת פטרי מזכוכית המלאה בתמיסת מלח פיזיולוגית קרה מאוד. לאחר מכן, הנח את הצלחת תחת סטראוסקופ. השתמש במספרי Vannas ובפינצטה עדינה מסוג Dumont number five כדי להוציא את העורקים המוחים האמצעיים (middle cerebral arteries) מהמוח.לאחר מכן, נקה שאריות רקמת מוח מהעורק המוחקי המרכזי באמצעות הפינצטה. העבר את העורק לתא הכלי על ידי החזקה עדינה בקצה המקטע שנכרת והנח אותו בזהירות לתוך התא. בשלב הבא, השחל את העורק המוחקי אל תוך מיקרופיפטת הכניסה על ידי משיכתו לכיוון בסיס הפיפטה, עד שקצה הפיפטה ייכנס לתוך הלומן של העורק.קבעו את העורק על פיפטת הכניסה באמצעות קשירת לולאה שהוכנה מסיב בודד שהופרד מחוטי תפירה 10-0 סביב העורק. לאחר מכן, קבעו את הקצה הנגדי של העורק המוחי האמצעי לפיפטת היציאה על ידי הידוק לולאת תפירה שנייה סביב כלי הדם, והשתמשו במיקרומטר המחובר למחזיק פיפטת הכניסה כדי למתוח את העורק לאורכו המקורי (in situ). קשרו את כל הענפים הצדדיים באמצעות סיבים בודדים שהופרדו מחוטי תפירה 10-0 כדי לשמור על לחץ קבוע בעורק.בשלב הבא, הגדירו מיקרוסקופ וידאו המורכב ממצלמה המחוברת למיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), אשר מחובר למדידת מיקרומטר וידאו ולמסך טלוויזיה. השתמשו במערך זה כדי למדוד את הקוטר הפנימי של העורק. העריכו את הטון המיוגני ואת תגובות כלי הדם לגירויים מרחיבי כלי דם (vasodilator) על ידי וידוא שהעורק מראה רמה מתאימה של טון פעיל לפני הניסוי.יש להשליך כל עורק שאינו מפגין טונוס פעיל במצב מנוחה, למעט כלי דם כגון עורקים מזנטריים קטנים שאינם מפגינים בדרך כלל טונוס מנוחה פעיל. לאחר מכן, יש להוסיף ריכוזים עולים של acetylcholine לתא הכלי ו למדוד את קוטר הכלי כדי לבחון את התגובתיות התלויה באנדותל של עורק ההתנגדות שהוכנס לו קטטר. בדוגמה זו, העורק מפגין תפקוד לקוי של האנדותל, כפי שניתן לראות מכך שאינו מתרחב בתגובה ל-acetylcholine.בסיום הניסוי, קבעו את הקוטר המקסימלי של העורק על ידי הוספת תמיסת מלח פיזיולוגית נטולת סידן לפרפוזאט (perfusate) ולסופרפוזאט (superfusate). השתמשו במדידה זו כדי לחשב את אחוז הטון במצב מנוחה אקטיבי. הדגמה של התרחבות מקסימלית בתמיסת מלח פיזיולוגית נטולת סידן מאששת כי אי-ההתרחבות של העורק בתגובה לאצטילכולין נבעה מדיספונקציה אנדותליאלית ולא מחוסר יכולת של העורק להירגע עקב רמודלינג מבני של כלי הדם.איור זה ממחיש את התגובות לאצטילכולין, מרחיב כלי דם תלוי אנדותל, בעורקי מוח אמצעיים מבודדים של חולדות Dahl Salt Sensitive זכרים בשלושת הזנים הקונגניים המוצרים. נתונים אלו מראים כי הרחבה תלוית אנדותל לאצטילכולין הייתה חסרה בזן ההורי רגיש המלח ובשני הזנים הקונגניים ששימרו את אלל ה-Renan רגיש המלח. הרחבה נורמלית הושבה בזן הקונגני הנושא את אלל ה-Renan של brown Norway על רקע גנטי רגיש למלח, ממצא התומך בהשערה כי תפקוד לקוי של האנדותל בחולדות SS נובע מוויסות פגום של גן ה-Renan.בניסוי זה, נבחן כישלונה של תזונה עשירה במלח בביטול ההרחבה התלויה באנדותל למול אצטילכולין בזן מסוים של חולדה, והממצאים הנוגעים לגורמים למעקה חמצוני כלי דם ולדיספונקציה אנדותללית במהלך עליות בצריכת המלח התזונתית. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שלוש עד שלוש וחצי שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לטפל בעורק המבודד בזהירות רבה כדי למנוע נזק לשריר החלק ובמיוחד לאנדותל.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון הוספת אגוניסטים מכווצי כלי דם (vasoconstrictor) ומרחיבי כלי דם (vasodilator) או אנטגוניסטים לקולטן, על מנת לענות על שאלות הכוללות מנגנונים המשפיעים על התגובתיות הווסקולרית לחומרים שונים ומנגנוני פעולתם של תרופות על כלי דם. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה הווסקולרית והפיזיולוגיה של המיקרוסירקולציה לחקור את תפקוד השריר החלק והאנדותל בעורקי התנגדות ממיטות וסקולריות שונות של בעלי חיים ובני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן השימוש בשיטה זו להערכת מנגנוני הבקרה של האנדותל והשריר החלק הווסקולרי בעורקי התנגדות קטנים ממיטות וסקולריות שונות.

evaluation-vascular-control-mechanisms-utilizing-video-microscopy

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אנחנו מדגימים את מודל רומן עורקי קשירה בשריר spinotrapezius עכברי, לרבות הליך צעד אחר צעד ותיאור של מכשור הנדרש. אנו מתארים את הניתוח ומדידות תוצאה רלוונטיות הנוגעות לשיפוץ כלי דם והרחבת כלי דם ברשת פונקציונלית באמצעות מיקרוסקופ intravital וconfocal.

דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling

myography לחץ משמש כדי להעריך vasoactivity של עורקים קטנים המתפתחים התכווצות מתמשכת כאשר לחץ. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט להעריך במגזרים בודדים של עורקי mesenteric קטנים מחולדות, vasoactivity ואת ההשפעה של לחץ intraluminal על קוטר כלי דם.

הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ

טכניקת לנדיס המותאמת מאפשרת מדידה זוגית של המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלים בודדים במזנטריה של חולדות רגילות וחולדות מהונדסות גנטית בתנאי בקרה ובדיקה באמצעות טכניקות מיקרו-פרפוזיה. הוא מספק שיטה נוחה להערכת מנגנונים המווסתים את חדירות המיקרו-כלי דם וחילופי כלי דם בתנאים פיזיולוגיים.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Videomicroscopy מערכות משמשות כדי לבחון מאפיינים פונקציונליים של רקמת שומן מבודדת רבים בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ולא תרופתי. טכניקה זו ניתן לבחון פנוטיפים microvascular בתחומים שונים רקמת שומן בבני מהשמנת יתר.

הערכה של רקמת שומן אנושי הפונקציה Microvascular באמצעות Videomicroscopy

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוטה עבור בידודו של רבים מן הרשתית עכברוש יכול לשמש אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה ואת הלחץ myography מחקרים.

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

הפרוטוקול מתאר את השימוש במיגרפיה תיל כדי להעריך את המתח האיזוגרפי של העורקים המסריים מבודדים מעכברים, עם שיקול מיוחד של האפנון על ידי גורמים שפורסמו מתאי האנדותל ורקמות השומן הפריסקולרית.

הערכה של תגובתיות וסקולרית באמצעות העורקים המבודדים הבודדים באמצעות התמקדות באפנון על ידי פריסקולרית של הרקמות

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המושגים והיישום הטכני של טכניקת המיוגרפיה הטנסומטרית באמצעות מערכת מיוגרף רב-תאית בהערכת ex vivo ניסיונית של תפקוד אנדותל אבי העורקים של עכבר.

מדידה של כלי דם תלויי אנדותל באבי העורקים החזי של העכבר באמצעות מיוגרפיה של תא נפח קטן טנסומטרי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טכניקת המיוגרפיה של החוטים למדידת תגובתיות כלי הדם של העורק הכלילי של החולדה.

הכנת טבעת כלילית סטנדרטית של חולדה והקלטה בזמן אמת של שינויי מתח דינמיים לאורך קוטר כלי השיט

Twin-to-התאום תסמונת עירוי ורצף התאום polycythemia אנמיה שתי בעיות הרסניות ברפואה הלידה. הפרעות שני להתרחש רק תאומים monochorionic והתוצאה מזרימת דם לא מאוזן anastomoses דרך כלי הדם בשליה. אנו מספקים פרוטוקול פשוט להעריך נכונה את הימצאותם של כלי הדם באמצעות הזרקת anastomoses לצבוע בצבע של כלי השליה לאחר הלידה.

הערכה מדויקת ופשוטה Anastomoses כלי הדם בשליה Monochorionic באמצעות דיי צבעוני

למדו הערכת תפקוד כלי דם בחולדות באמצעות מיקרוסקופיית וידאו מבודדת. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני בקרה אנדותליים ושרירים חלקים בעורקי התנגדות קטנים לטיפול בדיספונקציה וסקולרית.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

גלה סרטונים נוספים